Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Resumo

Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.

Resumo

Em culturas hippocampal fatia de organotypic (OHSC), as características morfológicas e funcionais dos neurônios e células gliais estão bem conservadas. Este modelo é apropriado para abordar questões de pesquisa diferentes que envolvem estudos na neuroproteção, eletrofisiológicos experiências em neurônios, redes neuronais ou invasão do tumor. A arquitetura hippocampal e atividade neuronal em circuitos multisynaptic estão bem conservados em OHSC, mesmo que o próprio procedimento corte inicialmente lesões e leva à formação de uma cicatriz glial. A formação de cicatriz presumivelmente altera as propriedades mecânicas e comportamento difusiva de pequenas moléculas, etc. Fatias de permitam o monitoramento de processos dependentes de tempo após a lesão cerebral sem cirurgia animal e estudos sobre interações entre vários tipos de células derivado do cérebro, ou seja, astrócitos, micróglia e neurônios sob fisiológicos e patológicos condições. Um aspecto ambivalente deste modelo é a ausência de fluxo sanguíneo e as células imunes do sangue. Durante a progressão da lesão neuronal, migração de células do sistema imunológico da peça sangue um papel importante. Como essas células estão falta em fatias, os processos intrínsecos da cultura podem ser observados sem interferência externa. Além disso, em OHSC a composição do ambiente externo médio é precisamente controlada. Uma vantagem adicional desse método é o menor número de animais sacrificados, em comparação com preparações padrão. Vários OHSC pode ser obtido de um animal, possibilitando estudos simultâneos com vários tratamentos em um animal. Por estas razões, OHSC são adequados para analisar os efeitos das novas terapias protetora após dano tecidual ou durante a invasão do tumor.

O protocolo apresentado aqui descreve um método de preparação de OHSC que permite gerar altamente reprodutível, bem preservado fatias que podem ser usadas para uma variedade de pesquisa experimental, como estudos de invasão de neuroproteção ou tumor.

Introdução

OHSC é um modelo bem caracterizadas em vitro para estudar propriedades fisiológicas e patológicas dos neurônios, astrócitos e microglia¹. É fácil de controlar o ambiente extracelular e monitorar as mudanças morfológicas e celulares após vários estímulos. A organização dos neurônios hippocampal e suas conexões estão bem conservadas após preparação^2,3. Fora várias vantagens, OHSC permitem o monitoramento da invasão de lesão e tumor cerebral sem cirurgia animal. Seis a oito OHSC pode ser obtido de um único cérebro de roedor. OHSC, portanto, ajudar a significativamente reduzir o número de animais e permitir testes várias concentrações de droga, manipulações genéticas ou modelos de lesão diferentes no mesmo animal. Fatia com base em ensaios, em condições experimentais podem ser precisamente controladas. Além disso, desenvolvimento dependente do tempo de condições patológicas como danos secundários facilmente pode ser monitorado pela imagem latente de lapso de tempo.

No protocolo determinado, originalmente estabelecido por Stoppini et al ⁴, as etapas de preparação são descritas e destacam-se importantes marcos morfológicos para a seleção de fatias apropriadas. Recomendamos a preparação de pós-Natal dia 7-9 ratos ou camundongos pós-Natal dia 4-5. Nesses períodos, OHSC mostram uma resistência robusta de traumas mecânicos e um elevado potencial para a reorganização dos circuitos neuronais. Em contraste, preparações de ratos embrionários ou adultos rapidamente mudam sua estrutura e perdem sua morfologia de organotypic durante o cultivo e, portanto, são menos adequadas para o estudo de processos a longo prazo em investigação básica^{5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}. outro ponto crítico para a taxa de sobrevivência de OHSC é a espessura da fatia em si, como a difusão e, portanto, o fornecimento de nutrientes são limitadas^12,13,14.

Protocolo

experiências em animais foram realizadas em conformidade com a política da ética e da política sobre a utilização de animais na investigação neurociência como aprovado pela Europeu comunidades Conselho Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.

1. preparação dos instrumentos e meios de cultura

1. para a preparação de OHSC usar o seguinte conjunto de instrumentos: duas tesouras pequenas, duas pinças curvas, uma pinça com ponta fina, três lâminas (duas de tamanho 11, um de tamanho 15), três suportes de bisturi, ronda os papéis de filtro (diâmetro: 35mm), agar, uma lâmina de barbear, um não modificado pipeta Pasteur, e um modificado pipeta Pasteur sem uma dica. Esterilize todos os materiais em autoclave antes do uso ( Figura 1).
2. Pesa agar 5g e dissolvê-lo em 100 mL de água destilada. Esterilize a solução por 20 min a 121,7 ° C, a 210.8 kPa em autoclave. Distribuir a 3 mL de solução de ágar líquido em placas de Petri 60mm usando uma pipeta de vidro estéril, deixe-o solidificar por 5h, cubra com filme plástico parafina para evitar contaminação e armazenar a 4 ° C até nova utilização. Blocos de ágar são necessários para estabilizar o cérebro durante o procedimento de corte.
3. Media
   1. fazer 200 mL do meio de preparação (pH 7,35) consistindo de meio essencial mínimo (MEM) de 198 mL e 2 mL de solução de L-glutamina (concentração final de 2 milímetros). Preparar a solução no dia da preparação de mídia e armazená-lo em 4 ° C.
   2. Preparar 100 mL de meio de cultura composto por 49 mL MEM, 25ml Hanks ' equilibrada soluções salinas (HBSS), soro de cavalo normal de 25 mL (v/v) (NHS), 1 mL de solução de L-glutamina (concentração final 2 mM), 100 µ g insulina, glicose de 120 mg, estreptomicina 10 mg , 10.000 U de penicilina e 800 µ g de vitamina C, como relatado anteriormente. Aquecer o meio (37 ° C), ajuste o valor de pH para filtro pH 7,4 e estéril (tamanho de poro de 0,2 µm). Repita o procedimento (aquecimento, ajuste de pH, etc.) em dois dias antes de mudar o meio. Utilize o meio, no máximo, por uma semana quando conservado a 4 ° C.
4. Encha uma 35mm placa de Petri com meio de preparação para armazenar o cérebro. Coloque dois pratos de Petri vazia para coletar o tecido em um bloco de arrefecimento na área de trabalho.

2. Preparação e fatiar com uma Vibratome

1. uso cérebros de ratos de 7-9 dias de idade ou 4 a 5 dias velhos ratos para a preparação de OHSC de acordo com Stoppini et al. ⁴ após a decapitação de animais, retire a pele do crânio com uma tesoura.
2. Introduzir a lâmina de uma tesoura bem o buraco occipital e abrir o crânio por corte ao longo do eixo (dianteiro) (volta) rostral caudal. Fazer dois cortes perpendiculares ao primeiro, para que a tesoura aponta para a orelha esquerda e direita, respectivamente (" T-incisão ").
3. Abrir o crânio cuidadosamente com a pinça fina, prestando atenção para não machucar o cérebro. Usar um bisturi (tamanho da lâmina 11) para cortar a parte mais rostral do polo frontal e o cerebelo.
4. Por meio de uma espátula, retire o cérebro e coloque-o cuidadosamente na caixa de Petri preenchida com meio de preparação ( Figura 2). Posicione o cérebro sobre o suporte de amostra e corrigi-lo com cola de cianoacrilato médica. Usar as peças do ágar para assegurar a estabilização mecânica.
5. Dissecar o tecido horizontalmente em 350 µm espessura OHSC usando um deslizamento vibratome.
6. Avaliar as fatias opticamente, usando um microscópio binocular. OHSC de baixa qualidade descarte imediatamente. É importante tomar somente aquelas fatias com cytoarchitecture intacto, isolado da parte média do hipocampo (ver figuras 3 e 4) entre a dorsal e ventral hipocampo.
7. Separar a região do hipocampo e córtex entorhinal usando um bisturi (redondo, tamanho da lâmina 15; a Figura 3). Deve ser preservado o córtex de percurso e entorhinal perforant.
8. OHSC de seis a oito são obtidos de cada cérebro. 2-3 fatias de transferência para inserção de cultura de uma célula (poros tamanho 0.4 µm) e colocá-lo em um poço de um prato de cultura 6-poços contendo 1 mL de meio de cultura por alvéolo.
9. Incubar os pratos 6-poços em 35 ° C em uma atmosfera totalmente umidificada com 5% (v/v) de CO ₂ e mudar o meio de cultura celular cada segundo dia.
   Nota: Realizar suas experiências no dia 6 em vitro (div). Reações inflamatórias associadas com o fatiamento procedimento desaparecem por dia 6. Nesta fase, as células de microglial apresentam uma morfologia ramificam novamente e conexões sinápticas amadureceram.

3. Avaliação da qualidade do tecido

1. fixação, rotulagem e visualização de neurônios degeneram em OHSC
   1. após a realização dos experimentos, incubar o OHSC com iodeto de propidium 5 µ g/mL (PI) por 2 h antes da fixação, em ordem para manchar os núcleos dos neurônios degeneram.
      Atenção: O PI é um suspeito cancerígeno, use sempre equipamentos de proteção individual (EPI) tais como luvas.
   2. Lavar o OHSC com tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) e corrigi-los com uma solução de 4% (v/v) de paraformaldeído (PFA) por 24 h.
      Cuidado: PFA é um carcinógeno tóxico e suspeito. Trabalhar sob a coifa e usar EPI.
   3. Lavar o OHSC em inserções com 1 mL de PBS e use um pincel de rigger para separar as fatias da membrana.
   4. Rotular o OHSC com tintura de IB ₄ em uma placa de 24 ( Figura 5).
2. Condução de experimentos de invasão do tumor usando fluorescente etiquetado células únicas
   1. 24 h antes do início do experimento, rotular as células do tumor, usando o tintura fluorescente Carboxyfluorescein diacetato grufo éster (SE CFDA).
   2. Desanexar e contar as células de tumor utilizando uma câmara de Neubauer.
   3. Ressuspender as células em meio, tal que 10 µ l de suspensão contém o número de celular desejado (normalmente 50.000 ou 100.000 células).
   4. Aplicar 10 µ l de suspensão de célula para a cultura de fatia e permitir que as células para invadir por 3 dias.
   5. No final do experimento, corrigir as culturas fatia usando 4% (v/v) PFA para 24h e rotular as culturas co com PI para outro 24h para visualizar o cytoarchitecture.
      Cuidado: PFA é um carcinógeno tóxico e suspeito. Trabalhar sob a coifa e usar EPI.
   6. Montar as culturas co em uma lamela para posterior análise utilizando o meio de montagem.

4. Avaliação das experiências de OHSC

analisar o OHSC com um laser confocal microscópio (CLSM). Para a deteção de PI rotulado, degenerando neurônios ou o PI rotulado cytoarchitecture usar a luz monocromática do comprimento de onda λ = 543 nm e uma banda de emissão passam filtro para comprimentos de onda λ = 585-615 nm. Para o CFDA rotulado de células tumorais ou IB ₄ micróglia, usar um comprimento de onda de excitação de λ = 488 nm. Para ambos os tipos experimentais, gravar uma z-pilha com µm 2 fatias grossas de óptica e usado para a avaliação.

Resultados

Estudos de neuroproteção: Para determinar o dano neuronal, o número de núcleos positivos de PI e IB₄ positivo microglia em cada terceira secção óptica da camada de células grânulo (GCL) de giro do pectínea (DG) foi contado. Para experiências de invasão do tumor, o z-projeção de intensidade máxima da pilha foi usado para calcular a área coberta por células tumorais, como uma medida de invasão e Visualizar padrões diferentes de invasão (

Discussão

O presente protocolo descreve a preparação de OHSC. Esse modelo permite que o teste de recursos intrínsecos e reações do tecido cerebral após a aplicação de estímulos fisiológicos e patológicos. Além de análises de parâmetros eletrofisiológicos, OHSC pode ser lesado e os efeitos de dano em todos os tipos de células podem ser determinados. Tratamento com substâncias diferentes e a descrição detalhada dos processos de maciços ou na ausência de macrófagos e linfócitos de cura é possível.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Well	Falcon	35-3046
Agar	Fluka	5040
Autoclav	Systec	DX-45
CFDA	Thermo Fisher	V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700	Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium	Invitrogen	32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I	Vector Labs	FL-1101
Glucose	Merk	1083371000
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)	Invitrogen	24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+)	Invitrogen	14170-138
Insulin	Sigma Aldrich	I5500
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A5960
L-Glutamin	Invitrogen	25030-024
LN229	Cell-Lines-Service	300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue)	B.Braun	1050052
Millicell Culture Inserts	Millipore	PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid	Sigma Aldrich	M3262
Normal Horse Seum	Invitrogen	26050-088
Penicillin Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Petri dishes (all sizes)	Greiner	627160/664160/628160
PFA	Roth	0335.1	toxic
Propidium iodid (PI)	Sigma Aldrich	81845-25MG	toxic
U138	ATCC	HTB-14
Vibratome	Leica	Leica VT 1200