Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Resumo

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Resumo

Linfócitos extravasão para o sistema nervoso central (SNC) é crítica para a vigilância imunitária. alterações relacionadas com a doença de extravasamento de linfócitos pode resultar em alterações fisiopatológicas no SNC. Assim, investigação sobre a migração de linfócitos para o SNC é importante para entender as doenças inflamatórias do sistema nervoso central e o desenvolvimento de novas abordagens de terapia. Aqui apresenta-se um modelo in vitro da barreira sangue-cérebro humano para estudar o extravasamento de linfitos. células endoteliais humanas microvasculares cerebrais (HBMEC) são cultivadas em confluently um tereftalato de polietileno poroso Transwell Insert para imitar o endotélio da barreira sangue-cérebro. a função de barreira é validado por zonula occludens imuno-histoquímica, a resistência eléctrica transendotelial (TEER) medidas bem como a análise de Evans permeação azul. Este modelo permite a investigação da diapedese de subconjuntos de linfócitos raras, tais como CD56 CD16 ^{brilhante dim / -} células NK. Furthermminério, os efeitos de outras células, citocinas e quimiocinas, alterações relacionadas com a doença, e regimes de tratamento diferentes na capacidade migratória de linfócitos podem ser estudados. Finalmente, o impacto de estímulos inflamatórios, bem como diferentes regimes de tratamento sobre a barreira endotelial pode ser analisado.

Introdução

migração de linfócitos a partir do sangue para os tecidos é crucial para a vigilância imunitária. Uma sequência de interacções moleculares específicos assegura extravasamento local específico para o intestino delgado, de pele, nódulos linfáticos, o sistema nervoso central (CNS), e outros tecidos ^1. Alterações na migração de linfócitos estão envolvidos na patofisiologia de uma série de doenças ampla disseminação ^2. Migração para o SNC imuno-privilegiado é fortemente regulada e, consequentemente, alterações deste processo estão envolvidos em doenças relacionadas com o SNC, como encefalomielite ^3, neuromielite óptica, acidente vascular cerebral, e esclerose múltipla (MS), ^{2, 4, 5, 6, 7.} Portanto, é importante estudar o extravasamento de linfócitos para melhor compreender a fisiopatologia da doença e desenvolver ferramentas para uma melhoramento da doença de carga ^{8, 9, 10, 11, 12.}

Os linfócitos migra para o SNC através de rotas distintas. Extravasamento através de vénulas pós-capilares para o espaço subaracnóide através da barreira sangue-fluido cerebrospinal dentro do plexo coróide e através da barreira sangue-cérebro ter sido descrito ^{um, 13, 14, 15.} Migração através da barreira sangue-cérebro é conduzida pela interacção de linfócitos com células endoteliais ^14. Em contraste com as células endoteliais na periferia, as células endoteliais do SNC expressar quantidades elevadas de moléculas de juno apertadas, assim limitar rigorosamente a quantidade de células e proteínas capazes de atravessar a barreira sangue-cérebrolass = "xref"> 16. Inflamação resulta em afrouxamento de junções apertadas e induz a expressão de moléculas de adesão; assim, aumentando a migração de linfócitos para o SNC ^{1, 17, 18.}

Extravasamento através da barreira sangue-cérebro é um processo de múltiplos passos. Linfócitos do tirante para as células endoteliais e, em seguida, rolar ao longo do endotélio em um processo mediado principalmente por selectinas ^{1, 15.} Posteriormente, as interacções entre as quimioquinas segregadas pelo endotélio e os respectivos receptores de quimiocinas expressas em linfócitos induzir mudanças conformacionais de integrinas, promovendo assim a adesão firme para as células endoteliais ^1. Finalmente, quer linfócitos de rastreamento ao longo da barreira endotelial contra o fluxo de sangue antes transmigrando para o espaço perivascular, ou parar imediatamente e directamente transmigrate no local da empresa ^de aderência ^{1, 19, 20.} Todos estes passos de extravasamento de linfitos pode ser analisada in vitro utilizando técnicas distintas ^21. Microscopia de lapso de tempo vídeo é usado para estudar o tethering inicial e rolando ^15. Os ensaios de adesão fornecem informações detalhadas sobre a prisão firme endoteliais barreiras ^22. Os ensaios de transmigração como demonstrado aqui permitem a análise de transmigração de células imunes ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

Usando o modelo humano in vitro barreira hematoencefálica, que recentemente poderia mostrar que uma maior migrAtory capacidade de CD56 CD16 ^{brilhante dim / -} células NK em comparação com o seu CD56 ^dim CD16 ⁺ homólogos foi reflectida por uma predominância deste subconjunto de células NK no compartimento ²¹ intratecal. Assim, a instalação experimental parece ser adequado para mimetizar a situação in vivo.

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Protocolo

1. Cultura de células de cérebro humano Células Endoteliais Microvasculares (HBMEC)

1. Revestimento de frascos de cultura de células
   1. Para preparar a solução de fibronectina, adicionar 10 mL de PBS para um tubo de centrífuga de 15 mL. Adicionar 150 mL de fibronectina e misture bem.
   2. Para cobrir o fundo de um frasco de cultura de células T-25, adicionar 2 ml de solução de fibronectina. Incubar o balão de cultura de células durante pelo menos 3 h a 37 ° C na incubadora. Revestidas com fibronectina frascos podem ser armazenados durante 2 semanas a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Sementeira e cultura de células de HBMEC
   1. Aspirar solução de fibronectina a partir do fundo do frasco de cultura de célula. Adicionar 7,2 x 10 ⁴ HBMEC / cm² suspenso em 6 ml de meio de ECM-b (= ECM-b suplementado com 5% de soro fetal bovino, 1% de penicilina / estreptomicina e 1% de suplemento de crescimento de células endoteliais). Incubar a 37 ° C / 5% de CO _2. Verifique o crescimento de células diariamente usando um microscópio.
   2. Mudar o meio cada 3 dias.Colheita ou células divididas, quando HBMEC atingir aproximadamente 80% de confluência. HBMEC deve ser usado entre a passagem 1 e 15 para evitar a perda de propriedades fisiológicas.
3. Colheita HBMEC.
   1. Prepare Accutase solução por mistura de Accutase (1x) com PBS numa proporção de 1: 1. Manter Accutase solução a 37 ° C em um banho de água até à sua utilização.
   2. Transferência médio ECM-b a partir do balão de cultura de células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar HBMEC por adição de 5 mL de PBS para o fundo do frasco de cultura de células. Aspirar PBS e repetir o passo de lavagem mais duas vezes.
   3. Adicionar a solução de 2 ml pré-aquecido Accutase. Incubar a 37 ° C durante 2 min. Posteriormente, HBMEC são re-suspensos batendo firmemente o frasco de cultura de células várias vezes. destacamento das células é controlada usando um microscópio
   4. O ECM-b-forma previamente armazenado num tubo de 15 ml é adicionado de volta ao frasco de cultura de células, logo que HBMEC começar a separar. Lavar o fundo do frasco repetidamente até que a maioria são HBMECre-suspensa.
   5. Transferir a suspens celular para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante e as células em 1 mL de meio de ECM-b re-suspender. Contar as células e dilui-se a suspensão de células para se conseguir uma concentração final de 3 x 10 ⁵ mL HBMEC por meio de ECM-b.

2. Preparação do celular Cultura Insere

1. Revestimento de inserções de cultura de células
   Nota importante: Evite tocar a membrana das inserções de cultura de células.
   1. Adicionar 100 de soluo de fibronectina (ver 1.1.1) de cada inserção de cultura de células (Figura 1A) e uma cavidade de uma placa de 96 poços de fundo plano (controlo óptico bem). Incuba-se durante pelo menos 3 h a 37 ° C. Depois da solução de incubação aspirado fibronectina.
   2. Adicionar 100 mL HBMEC suspensão para as inserções de cultura de células e o controlo óptico bem. Adicionar 600 ul de ECM-b meio para o compartimento inferior da célulainserções cultura. Incubar durante 3 - 4 dias a 37 ° C / 5% de _CO2 até que a integridade da barreira (Figura 1B) é atingido, verificar o crescimento celular por avaliação microscópica do HBMEC no controlo óptico bem. Nota: O crescimento celular para além de quatro dias não é recomendado.
   3. Opcional: Para imitar as condições inflamatórias aspirar o meio a partir do compartimento inferior e substituí-la por ECM-b meio suplementado com 500 U / mL de IFN-γ / TNF-α 24 h antes do ensaio de migração.

3. Controle de Qualidade com azul Evans no dia do ensaio Transmigração

1. Preparação de solução de azul de Evans
   1. Para preparar PBS / B27 solução mistura de 10 mL de PBS com suplemento B27 200 ul utilizando um tubo de 15 ml de centrífuga. Diluir solução mãe de azul de Evans (20 mg / mL PBS) 1: 1000 com PBS / B27.
2. ensaio de permeabilidade de azul de Evans
   1. Aspirar o meio do compartimento inferior seguido pelo compartimento superiorde uma inserção de cultura de célula contendo uma monocamada confluente HBMEC. Adicionar 100 mL Evans solução azul para a inserção de cultura de célula.
   2. Adicionar 600 de PBS / B27 para o compartimento inferior e incubar durante 60 min a 37 ° C / 5% de CO _2. Cuidadosamente remover a inserção de cultura de célula usando uma pinça.
3. medição de azul de Evans
   1. Remover PBS / B27 a partir do compartimento inferior e transferir 100 ul cada um de dois pos de uma polistirol preto placa de 96 poços de fundo plano. Inserir a placa num leitor de placas Tecan Pro Infinito M200 e determinar-z posição óptima.
   2. excitação medida de azul de Evans, utilizando respectivas configurações (por exemplo: de excitação: 620 nm, emissão: 680 nm, largura de banda de excitação: 9 nm, largura de banda de emissão: 20 nm, realce 175x, 25 flashes, tempo de integração: 20 mS).
   3. Para determinar as funções de barreira HBMEC comparar os dados adquiridos para uma curva padrão representando Evans permeação azul através HBMEC em diferentes pontos de tempo após a sementeing células (Figura 1B, à direita).

4. Migração Assay

1. Preparação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC).
   1. Adicionar 10 mL de meio RPMI para um tubo de centrífuga de 15 ml e adiciona-se 200 uL suplemento B27. Contagem de células PBMC e de centrifugação a 300 xg durante 5 min. Re-suspender as PBMC a uma concentração final de 5 x 10 ⁶ culas / mL de RPMI / B27.
2. Defina-se o ensaio de migração
   1. Meio aspirado a partir do compartimento inferior seguido pelo compartimento superior de inserções de cultura de células contendo monocamadas confluentes HBMEC (Figura 1A). Por doador, adiciona-se 100 uL de suspensão de PBMC de cada para as inserções de cultura de células e também a um poço de uma placa de 24 poços por (in vitro de controlo).
   2. Adicionar 600? L de RPMI / B27 para o compartimento inferior das inserções de cultura de células e 500 ul para o PBMC do controlo in vitro e incubar 6 h a 37 ° C / 5% de CO _2.
3. Colheita de PBMC migrado
   1. Retire a inserção de cultura de célula usando uma pinça e lavar cuidadosamente a parte inferior com 400 uL de PBS sem tocar na membrana. Descartar a inserção de cultura de célula.
   2. Adicionar 20 ul fluorosferas contagem de fluxo (cerca de 1000 esferas / uL) para o compartimento inferior da cultura celular inserir, bem como para o controlo in vitro e misturar bem. Transferir 1 ml da resultante suspensão de PBMC para tubos de citometria de fluxo.

5. Citometria de Fluxo

1. Preparação de amostra
   1. Centrífuga PBMC a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   2. Preparar a soluo de anticorpo através da adição de anticorpos fluorocromo-conjugados com 100 uL de tampão de citometria de fluxo (PBS / BSA a 1% / EDTA a 2 mM) por amostra. Para os resultados apresentados abaixo 1 uL de CD4-FITC, um μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 uL de CD56-PC7, 1 uL CD8-A700, e 1 uL de CD16-A750 foram usadas por amostra.
   3. Re-suspender PBMC em 100 mL da solução de anticorpo e incubar durante 30 min a 4 ° C.
   4. Adicionar 250 uL de tampão de citometria de fluxo e centrifugar a 300 xg durante 5 min.
2. aquisição amostra
   1. Re-suspender as PBMC na quantidade necessária (varia de acordo com o citetro de fluxo utilizado) de tampão de citometria de fluxo.
   2. Adquirir manchado de PBMC utilizando um citómetro de fluxo com um detector activa entre 525 e 700 nm comprimento de onda para detectar fluorosferas contagem de fluxo (excitação 488 nm, emissão a 525-700 nm).
      (Os passos seguintes são um exemplo, se um fluxo Gallios citómetro operado com o software Kaluza G é usada:. (1) Iniciar o computador (2) Quando o sistema de operação está completamente carregado, iniciar o citómetro de fluxo por prensagem a "citómetro no" botão . (3) Coloque o respectivo protocolo de aquisição, premindo o botão "protocolo aberto". (4) Escolha o protocolo necessário e selecione "abrir". (5) Duplicar o protocolo para cada amostra, clicando com o direitobotão do mouse sobre o protocolo visível no carrossel virtual e um clique esquerdo no campo "duplicado". (6) Rotular cada amostra na lista de amostra. (7) Transferir as amostras para as posições indicadas do carrossel e iniciar a aquisição.)
3. análise de amostras
   1. Abrir fluxo resultante citometria de dados usando o respectivo software. Determinar o número de sub-populações de interesse para PBMC transmigradas, bem como células in vitro a partir de poços de controlo e fluir fluorosferas contagem usando o respectivo software de análise.
      (Um exemplo da estratégia de intermitcia é dada na parte resultados (Figura 1 C: Para analisar a transmigração de subconjuntos de culas NK, seleccionar primeiro os linfócitos em um canal de dispersão para um lado (SSC) em relação ao canal de dispersão FSC) trama (linfócitos são. então exibidos num CD3 contra CD56 trama e CD56 ⁺ CD3 ^-. As células NK são seleccionados para distinguir entre os subconjuntos de células NK, células NK são exibidas emum contra CD56 CD16 CD56 CD16 trama e ^{brilhante dim / -} células NK, bem como CD56 CD16 ⁺ são seleccionadas ^dim. Além disso, fluorosferas contagem de fluxo são seleccionados a partir de um FSC SSC contra trama e posteriormente apresentado numa trama de um canal com uma emissão entre 525 e 700 nm versus tempo para determinar o seu número.)
   2. Para calcular o número total de células de cada amostra, normalizar o número de células detectadas usando fluorosferas contagem de fluxo:
      
   3. Determinar a percentagem de células que migraram como a razão entre células que migraram totais e de células totais no controlo in vitro.

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Resultados

Os resultados representativos, mostrando a transmigração de células NK e subconjuntos de células T utilizando o modelo de barreira sangue-cérebro humano (Figura 1A) são mostrados. A integridade da monocamada HBMEC foi validado por coloração da molécula de junção estanque ZO-1, a resistência eléctrica medições transendotelial (TEER), e Evans permeação azul (Figura 1B). Seguindo 3 - 4 dias de cultura HBMEC expressa a molécula de junção ...

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Discussão

Aqui apresentamos uma técnica para investigar a transmigração de linfócitos através da barreira sangue-cérebro humano. A análise in vitro de migração de linfócitos para o SNC é importante para estudar processos básicos de extravasamento de linfitos, potenciais alterações relacionadas com a doença, e de novas abordagens terapêuticas.

Várias modificações do modelo de barreira sangue-cérebro são possíveis. Por exemplo, as células do compartimento superio...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Gibco	14190-094	without CaCl2 or MgCl2
Fibronectin 1 mg/mL	Sigma	F1141-5MG	from bovine plasma
T-25 cell culture flask	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Penicillin/Streptomycin	ScienCell	1001-b
Endothelial cell growth supplement	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clear, 6.5 mm diameter, 3.0 µm pore size
96-well flat bottom plate	Corning	3596
Evans blue	Sigma	E2129-10G	stock solution: 1 g/50 mL PBS
B27	Gibco	17504-044	50x concentrated
Infinite M200Pro	Tecan
96-well black flat bottom plate	Greiner BioOne	675086
48-well plate	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Flow Count Fluorospheres	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios 10-color flow cytometer	Beckman Coulter
Kaluza 1.5a	Beckman Coulter
TNF-α	Peprotech	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11