A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Resumo

Uma vez removido do corpo, tecido neuronal é muito afectado pelas condições ambientais, conduz a uma eventual degradação do tecido após 6-8 h. Usando um método de incubação único, que acompanha de perto e regula o ambiente extracelular do tecido, a viabilidade do tecido pode ser significativamente prolongada por> 24 h.

Resumo

Aguda preparações de tecidos neuronais, fatias de cérebro e da retina wholemount, normalmente só pode ser mantida durante 6-8 h após a dissecação. Isto limita o tempo experimental, e aumenta o número de animais que são utilizados por cada estudo. Esta limitação especificamente impactos protocolos como imagem de cálcio que exigem prolongada pré-incubação com corantes aplicados-banho. exponencial do crescimento bacteriano dentro de 3 - 4 h após o corte é fortemente correlacionada com uma diminuição na saúde dos tecidos. Este estudo descreve um método para limitar a proliferação de bactérias em preparações agudas, para manter o tecido neuronal viável durante períodos de tempo prolongados (> 24 h) sem a necessidade de antibióticos, procedimentos de esterilização, ou meios de cultura de tecidos contendo factores de crescimento. E ligando o fluido extracelular por meio de irradiação UV e manter o tecido numa câmara de retenção costume em 15-16 ° C, o tecido não mostra nenhuma diferença de propriedades electrofisiológicas, ou Si cálciognaling através corantes de cálcio intracelular em> 24 h postdissection. Estes métodos não só irá aumentar o tempo experimental para aqueles que utilizam tecido neuronal aguda, mas irá reduzir o número de animais necessários para completar objectivos experimentais, e irá definir um padrão de ouro para a incubação do tecido neuronal aguda.

Introdução

Eletrofisiologia e imagens funcionais (cálcio, tensão corantes sensíveis) são duas das técnicas experimentais mais comumente usados ​​em neurociência. preparações fatia do cérebro e da retina wholemount, que será analisada aqui, fornecer um meio de examinar propriedades eletrofisiológicas e conectividade sináptica sem contaminação de anestésicos e relaxantes musculares. Fatias de cérebro e da retina Wholemount manter a sua integridade estrutural, ao contrário de culturas ou homogeneizados celulares, permitindo o estudo de circuitos específicos e redes cerebrais ^1. Gravações de tecido isolado têm vantagens sobre em gravações vivo como os movimentos associados ao batimento cardíaco e respiração são eliminados. Além disso, a visualização direta permite que classes específicas de células a serem alvejados e aplicação local de ferramentas farmacológicas ^{2, 3.}

gravações de patch-clamp e calcio-corante de carga em wholemount retina é complicado devido à existência da membrana interna limitante (ILM), que cobre a camada de células ganglionares da retina (RGC) e impede o acesso directo às células. Tipicamente, esta membrana é raspada com uma pipeta de vidro para permitir a aplicação directa de uma pipeta de adesivo e a formação de uma vedação gigaohm numa única célula. Além disso, os corantes de cálcio aplicado-banho não atravessar a ILM e quer deve ser injetado sob essa membrana ^4, transportado retrogradamente a seguir à injecção no nervo óptico ⁵ ou electroporadas através do tecido ^6. Além disso, quando se utiliza um modelo de roedor de retinite pigmentosa, o rato rd / rd, a ILM é mais espessa e mais impenetrável. Aqui, usamos uma técnica para remover a ILM com a digestão enzimática ^7, para permitir que tanto o cálcio onipresente corante de carregamento, e acesso directo à células ganglionares da retina para patch-clamp recordiNGS ^8.

gravações bem sucedidas a partir de qualquer fatias cerebrais ou da retina wholemount depender de dissecção e de incubação de tecido neuronal viável. Tipicamente, o tecido é extraído na manhã da experiência e incubada em fluido cerebrospinal artificial (aCSF) até que seja usada para gravações. Geralmente, o tecido permanece viável durante 6 - 8 h, com uma degradação significativa após esta janela de tempo. No entanto, ambas as fatias de cérebro e preparações retinae wholemount costumam produzir mais tecido do que pode ser gravado a partir de dentro deste período de tempo curto. Consequentemente, o tecido é muitas vezes descartados no final do dia e a dissecção é completada novamente nos dias subsequentes. Isso significa que um outro animal é utilizado e ~ 2 h de configuração e dissecção / coloração repetida. O protocolo seguinte descreve um método para aumentar a vida útil do tecido neuronal durante mais de 24 h, o que significa que menos animais são utilizados, e mais tempo experimental está disponível. Tissue viabilidade wcomo avaliado por meio de gravação propriedades eletrofisiológicas e dinâmica do cálcio, e essas propriedades eram indistinguíveis entre <4 h e> 24 h postdissection.

Estes resultados indicam que não só são propriedades de uma única célula intacta e funcional após incubação prolongada, mas a atividade da rede, tal como avaliado por cálcio e de imagiologia e registos electrofisiolicos, mantém-se inalterado> 24 h postdissection. Além disso, mostramos que os corantes de cálcio pode permanecer nas células durante períodos prolongados, sem causar quaisquer efeitos prejudiciais. A aplicação deste protocolo demonstra que a actividade funcional de neurónios no tecido neuronal aguda pode ser mantida por períodos longos, uma vez que o ambiente externo é altamente regulado. Além disso, como a viabilidade do tecido varia muito entre laboratórios devido a diferentes protocolos de incubação, este método estabelece um padrão de ouro para os parâmetros ideais que devem ser aplicadas para reduzir a variabilidade na saúde de neu agudatecido ronal.

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Protocolo

O protocolo que se segue descreve a preparação de ratinhos C57BL / 6 e C3H / He (retinally degenerar) tecido neuronal de rato, mas técnicas semelhantes podem ser aplicados a outras espécies. Todos os animais eram saudáveis ​​e manipulados com as condições padrão de temperatura, humidade, 12 h ciclo claro / escuro, livre acesso a comida e água, e sem quaisquer estímulos de estresse pretendidos. Todos os experimentos foram aprovados e realizados de acordo com o comitê Animal Care Universidade Western Sydney e Ética e de acordo com o uso de animais e orientações de cuidados (Animal Research Autoridade # A9452, # A10396 e # A8967).

1. Cérebro Slice Preparação

1. Anestesiar os animais por inalação de isoflurano (5%) e decapitar utilizando uma guilhotina roedor. Remover o cérebro rapidamente, tal como descrito anteriormente ⁹ e colocá-lo em solução fisiológica gelada (aCSF) contendo (em mM): NaCl 125, KCl 2,5, _MgCl2 1, 1,25 NaH ₂ PO _4, 2 _CaCl2, 25De NaHCO _3, 25 dextrose, e saturada com carbogéneo (95% _O2 / 5% de mistura _de CO _2; 310 mOsm; pH 7,4).
2. Corte fatias de cérebro, na região de interesse, 300 mm de espessura em micrótomo vibrando.
3. Transfira as fatias a um sistema de incubação personalizado construído que estreitamente monitora e controla os níveis de pH (pH 7,2-7,4), o fluxo de carbogênio e temperatura, como descrito anteriormente ^{10, 11.}
4. Ajuste da temperatura inicial da câmara para 35 ° C durante 15 - 30 min, e em seguida reduzir-se lentamente a 15-16 ° C como mostrado na Figura 1C. Em seguida, incubar fatias no sistema de incubação até ser necessário, seja para eletrofisiologia ou imagem.
   NOTA: Se as fatias estão a ser utilizados para o cálcio-imagem, siga os passos abaixo antes de arrefecimento do tecido abaixo RT.

2. Preparação da retina Wholemount e Inner Limitando remoção da membrana

1. Prepare wholemounts da retina quer em regime normal,condições de iluminação laboratoriais ou luz vermelha / infra-vermelho escuro.
2. Eutanásia de animais por deslocamento cervical e os olhos imediatamente enuclear. Fazer um pequeno corte ao longo da ora serrata e o lugar em ambos os meios de Ames, ou aCSF contendo (mM): 125 NaCl, 25 _NaHCO3, 3 de KCl, 2 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 de glicose, 0,5 de L-glutamina, e saturar com carbogénio (95% O ₂ mistura / 5% de CO _2; ~ 300 mOsm; pH 7,4), à TA.
3. Remover imediatamente a córnea, cristalino e vítreo cortando ao longo da ora serrata com uma tesoura pequena e remover a lente e vítreo com uma pinça. Colocar o tecido no sistema de incubação à TA.
   NOTA: tecido retiniano pode ser mantida na de taça do olho, após a redução da temperatura lento a 15-16 ° C, durante> 24 h no sistema de incubação até serem necessários.
4. Para remover o ILM, transferir a taça de olho contendo a retina para um pequeno frasco de vidro contendo 30 U / mL de papaína, 1 mM L-cistina, EDTA 0,5 mM e 0,005% de DNase em Earl's-Solução Salina Equilibrada (BSS) a 37 ° C durante 20 min. Aplicar 95% _{de O2} / 5% de CO ₂ para a solução através da tampa, mas não fazer espuma. Se usando tecido de animais jovens (<6 semanas), dilui-se a solução a meia-força.
   1. Parar a digestão enzimática, através da colocação do tecido numa solução de ovomucóide (10 mg / mL) e BSA (10 mg / mL) durante 10 min em BSS de Earl. tecido Lavar bem com aCSF antes da transferência para o sistema de incubação e reduzir a temperatura a 15-16 ° C.
5. Manter o tecido da retina no olho de taça até ser necessário. Para transferência para o microscópio, isolar a retina do olho-cup e cortada em 4 pedaços com uma lâmina de barbear. Se a retina inteira é necessário, fazer quatro pequenos cortes na periferia da retina para lhe permitir ficar na posição horizontal.
   NOTA: Para experimentos com imagens, carga com cálcio-corantes antes da transferência para o sistema de incubação, veja abaixo.

3. Manter Tissue na Incubadora

1. Tecido Lugar na câmara principal contendo sondas para medições de pH e de temperatura (Figura 1A, B).
2. Circular aCSF através de uma segunda câmara (câmara UVC, construído como anteriormente descrito ¹²⁾ isolado a partir da câmara principal e exposto a 1,1 W de luz UVC (254 nm, lâmpada UV 5W / 2P esterilizador), a fim de eradiate bactérias que flutuam na solução (Figura 1A). Controle UVC tempo de luz através de um timer programável usando um recurso aleatório que liga às vezes variando entre 15 e 26 min a cada 15-30 minutos para evitar o aquecimento excessivo do aCSF.
3. Definir a taxa de fluxo na câmara UVC a 12 mL / min conforme relatado anteriormente ^12. Cubra a câmara UVC com papel alumínio para evitar UVC iluminação no exterior da câmara, o que pode danificar o tecido neuronal.
   NOTA: Para o tecido da retina de adaptação ao escuro, aplique uma capa feita sob medida para a câmara principal para eliminar a luz.
4. Use uma bomba peristáltica para Circulate a solução (aCSF) através das duas câmaras e uma placa fria termoeléctrico refrigerador Peltier para refrigeração ou o aquecimento, quer a câmara principal para as temperaturas desejadas na gama de 0 - 50 ° C. Para a incubação de tecido óptima, usar 15-16 ° C durante a viabilidade a longo prazo.

4. O cálcio corante de carregamento

1. Selecione corantes de cálcio com base na preferência do pesquisador individual. Aqui usamos Fura-02:00, Fluo-08:00 ou Fluo-04:00. No entanto, este método pode ser aplicado a outros corantes, bem como: dissolver corantes de cálcio em DMSO a uma solução de copolímeros de 1 mM e 1% de bloco (por exemplo, ácido-127 plurónico) para um volume final de 50 mL e sonicado durante 10 minutos.
2. Adicionar a solução de aCSF a uma concentração final de 10 uM, copolímeros em bloco 0,01% de fatias cerebrais, e 20 uM (retina), copolímeros em bloco 0,02% para a retina. Na retina (papaína tratados) e fatias de cérebro de animais jovens, de carga para o banho durante 45 minutos a 37 ° C (Fura-2 AM) ou à TA (Fluo-4 AM; FLuo-08:00).
   1. Para animais adultos, (> 12 semanas), pipetar os corantes (50 ul) directamente sobre as fatias de cérebro, e manter por 75 min para permitir uma melhor penetração do corante nas camadas profundas.
   2. Para garantir uma oxigenação adequada do fatia submersa durante a incubação corante, preparar uma câmara de carga de vidro com uma tampa fechada (frasco circular de 2,5 cm de diâmetro, 3,5 centímetros de altura) com corantes de cálcio diluída em 2,5 mL de aCSF. Oxigenar continuamente com 95% _O2 / 5% de CO _2. não bolha.
3. Após carga de corante, lavar o tecido com aCSF e transferência para o sistema de incubação, reduzir-se lentamente a temperatura a 15-16 ° C até à sua utilização experimental.

5. As gravações eletrofisiológicas e imagem

1. Colocar o tecido numa câmara de registo submersa sob um microscópio, e perfundir com aCSF oxigenado a um caudal de 4-5 ml / min, quer à TA (~ 22 ° C) ou à temperatura fisiológica (~ 35 ° C). hold o tecido no seu lugar por um feito usando '' harpa '', feito de fios de nylon ou de ouro esticada e colada através de uma peça em forma de U, de ouro ou de fio de platina.
2. Para eletrofisiologia:
   1. Prepare pipetas de gravação de 1,5 mm (1,19 milímetros ID) vidro de borosilicato usando um extrator micropipeta para conseguir uma resistência final dos 5-6 mohms.
   2. Encha a pipeta com 3-4 mL de solução interna como descrito anteriormente ¹³ e visualizar células sob infravermelho contraste de interferência diferencial (IR-DIC) usando uma câmera CCD. A solução intracelular devem ser cuidadosamente adaptado para cada experimento para alcançar resultados experimentais.
   3. Posição pipeta, enquanto se mantém a pressão positiva aplicada através de uma porta de sucção no suporte da pipeta, sobre a membrana de uma célula utilizando um micromanipulador. Uma vez que a ILM foi removido a partir da retina, sem raspagem membrana prévia é necessária. Uma vez que a pipeta está na célula, aplicar negativo suavepressão para a pipeta para obter uma vedação gigaohm. Em seguida, ruptura da membrana celular com uma breve quantidade de pressão negativa.
   4. Fazer gravações de observação de correntes ou de tensão-clamp de células inteiras usando técnicas padrão, conforme apropriado.
3. Cálcio-imaging:
   1. Para geração de imagens raciométrica de Fura-2, use um comutador de comprimento de onda ultra-alta velocidade para proporcionar a comprimentos de onda de excitação de 340 nm e 380 nm. Passar a luz emitida a partir de células individuais através de um filtro de emissão de 510 ± 20 nm, e capturar com uma sensibilidade elevada, a câmara digital de alta velocidade.
   2. Para um único comprimento de onda de excitação de Fluo-4, luz de excitação do filtro através de um 460 - banda nm filtro passa-490 e luz emitida através de um 515 - filtro passa banda nm 550. Para a gravação mais rápida e mais sensível usar uma câmera digital de alta velocidade tal. Adquirir imagens conforme necessário.
   3. Medir alterações na fluorescência como uma função do tempo, quer a um único comprimento de onda (Fluo-4) ou utilizando o rácio de comprimento de ondamétodo (Fura-2), tal como descrito anteriormente ^{8, 14.}

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Resultados

regulação apertada da carga bacteriana e a temperatura do aCSF durante a incubação é essencial para manter a viabilidade do tecido neuronal. Isto pode ser optimizado por meio de irradiação com luz UVC e mantendo a temperatura do aCSF a 15-16 ° C (Figura 1). Além disso, o aCSF os parâmetros de selo (APS; Figura 1C) fornece o experimentador com um registro das condições ambientais (pH e temperatura.), Oferecendo assim um padrão de ouro para os...

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Discussão

Este artigo descreve um método de incubação para estender a viabilidade do tecido neuronal aguda para geração de imagens e eletrofisiológicos experimentos, reduzindo assim o número de animais necessários para completar objetivos experimentais. Dois processos principais governam a deterioração do tecido neuronal ao longo do tempo: i) aumento dos níveis de bactérias, eo aumento de acompanhamento endotoxina bacteriana lançado, e ii) excitotoxicidade que segue o procedimento de corte traumática

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232