Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

Resumo

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Resumo

Há uma demanda crescente para analisar muitas amostras biológicas para a compreensão da doença e descoberta de biomarcadores. estratégias de proteômica quantitativas que permitem a medição simultânea de múltiplas amostras tornaram-se generalizada e reduzir consideravelmente os custos experimentais e tempos. O nosso laboratório desenvolveu uma técnica chamada precursor combinado marcação isotópica e etiquetagem isobárica (cPILOT), que aumenta a amostra multiplexagem de marcação isotópica tradicional ou abordagens de marcação isobáricas. cPILOT global pode ser aplicada a amostras provenientes de células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros e dá informação sobre a abundância relativa de proteína em diferentes condições de amostra. cPILOT funciona por 1) usando condições de baixa tampão de pH para selectivamente péptido dimethylate terminais N e 2) utilizando condições de tampão de pH elevado para rotular aminas primárias de resíduos de lisina com reagentes isobáricas comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais / Reagentes). O grau demultiplexagem amostra disponível é dependente do número de etiquetas precursor utilizado e o reagente de marcação isobárica. Aqui, apresentam-se uma análise de 12-Plex utilizando luz e dimetilação pesada combinada com reagentes isobáricas seis-plex para analisar 12 amostras de tecidos de rato em uma única análise. multiplexagem aumentada é útil para reduzir o tempo e custo experimental e mais importante ainda, permitindo a comparação entre muitas condições de amostra (réplicas biológicas, estágio da doença, tratamentos medicamentosos, genótipos, ou pontos de tempo longitudinais) com polarização menos experimental e erro. Neste trabalho, a abordagem cPILOT global é utilizado para analisar o cérebro, coração e tecidos do fígado em todo repetições biológicas dos controles modelo do rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. CPILOT global pode ser aplicada ao estudo de outros processos biológicos e adaptada para aumentar a multiplexagem amostra para maior do que 20 amostras.

Introdução

Proteomics muitas vezes envolve a análise de muitas amostras utilizadas para melhor compreender os processos de doença, de cinética enzimática, modificações pós-traducionais, resposta a estímulos ambientais, de resposta a tratamentos terapêuticos, a descoberta de biomarcadores, ou mecanismos de drogas. Os métodos quantitativos podem ser utilizados para medir as diferenças relativas nos níveis de proteína através das amostras e pode ser livre de marcador ou envolver a marcação isotópica (metabólica, químicos, ou enzimáticos). Os métodos de marcação de isótopos estáveis ​​têm crescido em popularidade, porque eles permitem muitas amostras a ser analisadas simultaneamente e são adequados para as amostras a partir de diferentes células, tecidos, fluidos corporais, ou organismos inteiros. Marcação isotópica métodos ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,} aumentar o rendimento experimentalenquanto reduz o tempo de aquisição, custos e erro experimental. Estes métodos usam espectros de massa precursor para medir a abundância relativa de proteínas a partir de picos peptídicos. Em contraste, os reagentes de marcação isobáricas ^{8, 9, 10} gerar is repter que, ou são detectadas em MS / MS ou MS ^{3 11} e espectros estes picos são usados para informar sobre abundâncias relativas das proteínas.

O atual estado-da-arte no multiplexagem proteómica ou é uma análise de marcação isobárica 10-Plex ¹² ou 12-Plex ^13. Multiplexagem amostra melhorada (isto é,> 10 amostras) os métodos têm sido desenvolvidos pelo nosso laboratório para os tecidos ^{14, 15, 16, 17,} e por outro para a análise de células ¹⁸ sup>, ^{19, 20, 21} tecidos, ou péptidos segmentados ^22. Desenvolvemos uma técnica de multiplexagem reforçada chamado precursor de marcação isotópica combinado com marcação isobárica (cPILOT). CPILOT global é útil para a obtenção de informações sobre as concentrações relativas de todas as proteínas em diferentes condições de amostra (≥12) ^14. A Figura 1 mostra um fluxo de trabalho geral cPILOT. Peptídeos trípticos ou Lys-C são selectivamente marcado na extremidade N-terminal com dimetilao usando baixo pH ² e nos resuos de lisina com 6-Plex reagentes usando pH elevado. Esta estratégia dobra o número de amostras que podem ser analisadas com os reagentes isobáricas que ajuda a reduzir os custos experimentais e, adicionalmente, reduz passos experimentais e tempo.

cPILOT é flexível como nós desenvolvemos outros métodos para estudar modi oxidativo pós-translacionalções, incluindo as proteínas de 3-nitrotirosina modificado ¹⁴ e péptidos contendo cisteina, com S-nitrosilação (oxcyscPILOT) ^23. Também desenvolvemos um aminoácido abordagem selectiva, cPILOT cisteína (cyscPILOT) ^17. MS ³ aquisição com uma parte superior de iões de ¹¹ ou selectiva-y ₁ -Permutadores método ¹⁵ pode ajudar a reduzir a interferência de iões repórter e melhorar a exactidão quantitativa de cPILOT. O uso de MS no ³ o método de aquisição requer um instrumento de alta resolução com um analisador de massa Orbitrap apesar dos instrumentos de armadilha de iões de baixa resolução, podem também trabalhar ^24.

Anteriormente, cPILOT tem sido usado para estudar proteínas hepáticas ¹⁶ de rato modelo da doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos como realizar análise cPILOT mundial usando cérebro, coração e homogeneizados de fígado para estudar o papel do periphery na doença de Alzheimer. Esta experiência incorpora replicação biológica. Devido à versatilidade de cPILOT, os usuários interessados ​​podem usar a técnica para estudar outros tecidos para uma série de problemas e sistemas biológicos.

Protocolo

Ética declaração: Ratos foram comprados a partir de um sem fins lucrativos, instituição independente, a investigação biomédica e alojados na Divisão de Recursos Animais de Laboratório da Universidade de Pittsburgh. Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Pittsburgh.

1. Extração de Proteínas e produção de péptidos para a etiquetagem Chemical

1. Extracto de proteína a partir de tecido, células, ou fluidos corporais.
   1. Homogeneizar 60-90 mg de tecido (por exemplo, cérebro, coração, fígado e) em solução salina de tampão fosfato (PBS 1x) com ureia 8 M (500 mL), utilizando um homogeneizador mecânico. Os inibidores de protease ou de fosfatase pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Neste projeto, eles não foram usados. Utilizar os seguintes parâmetros para o homogeneizador: lisar os grânulos da matriz A, 4 m / s, 20 s. tecido cardíaco pode exigir até 9 ciclos de homogeneização.
      NOTA: Protease ou inibidor de fosfatase s pode ser adicionado ao tampão, se necessário. Eles não foram utilizados neste estudo.
      1. Remover homogeneizado de tecido a partir do tubo de lise e transferir para um tubo de micro-centruga. Lavar tubos de lise com 100-500 ul de PBS com 8 M de ureia e combinar a solução de lavagem com o homogeneizado de tecido.
   2. Centrifugar os tecidos homogeneizados (9447 xg, 4 ° C, 15 minutos) e recolher o sobrenadante.
2. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: A diluição adicional com tampão pode ser necessário se a concentração de proteína é muito alta. As concentrações resultantes para amostras a partir destes tecidos eram entre 6-13 ug / uL.
   1. Opcional: adicionar um padrão interno de controlo da qualidade (por exemplo, caseína alfa bovina ou outra proteína exógena) com o padrão ug proporção 1: amostra de proteína de 100 ug.

jove_title "> 2. Digestão Amostra

1. Adiciona-se 100 ug (100 x 10 ^-6 g) de proteína de cada amostra para tubos etiquetados individualmente micro-centrífuga. O volume é dependente da concentração de proteína (ver passo 1.2).
2. Adicionar ditiotreitol (DTT) (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar a 37 ° C durante 2 h. O cálculo para a razão molar é baseada fora a massa de proteína de albumina de soro bovino (BSA), que é de 66,5 x 10 ³ g / mole.
3. Adicionar iodoacetamida (IAM) (80: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar em gelo no escuro durante 2 h. Esta reacção é realizada em gelo durante 2 h, para evitar reacções secundárias.
4. Adicionar L-cisteína (40: 1 de reagente para provar razão molar) a cada amostra. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
5. Adiciona-se 20 mM de tampão Tris com 10 mM de _CaCl2 (pH 8,2) para diluir ureia para uma concentração final de 2 M.
6. Adicionar L-1-tosilamido-2 feniletil clorometil-cetona (TPCK) tripsina -treated (50: Um substrato para a enzima razão molar) a cada amostra e incubar a 37 ° C durante 24 h.
7. Extingue-se a digestão de proteínas por flash-congelação da amostra em azoto líquido e armazenar a -80 ° C até processamento adicional.

Dessalinização 3. Amostra

1. Re-acidificar as amostras pela adição de ácido fórmico (FA). Adicionar suficiente FA para se obter uma concentração final de 0,1%. Se as amostras são inicialmente a -80 ° C, descongelar as amostras em gelo antes de re-acidificação.
2. De-sal utilizando os péptidos C ₁₈ lipofílico hidrofílico em relação (HLB) cartuchos de 10 mg tal como previamente descrito ^16.
3. Secam-se as amostras por centrifugação de vácuo (5 Torr, 45 ° C, 77 xg) para um volume de ~ 10 mL.

4. dimetilao Rotulagem (N-terminais)

1. Reconstituir péptidos em ácido acético a 1% (0,25 mg / mL) dissolvido em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) ou água de grau de nano-puro. Remover a 50 μ; G de porção para um novo tubo de micro-centruga (1,5 mL) e armazenar o restante à temperatura de -80 ° C.
2. Adiciona-se 8 mL de 60 mM (4%) CH ₂ O (37% p / v) ou 60 mM (4%) ¹³ CD ₂ O (20% p / v) às amostras para marcação com luz ou dimetilao pesado, respectivamente . Tipicamente, 4 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos (Passos 4.2, 4.3, 4.6).
3. Adicionar 8 mL de mM de _NaBH3CN ou 24 mM NaBD ₃ CN 24 para as amostras marcadas com luz ou dimetilao pesada, respectivamente.
4. Vortex e agitar num agitador de tubo durante ~ 10 min a temperatura ambiente.
5. Extingue-se as reacções através da adição de 16 uL de 1% de amoníaco (~ 28-30% v / v) durante 5 min. Tipicamente, 8 uL de reagente é adicionado por 25 ug de péptidos.
6. Re-acidificar as misturas reaccionais através da adição de 8 pL de 5% de FA (98% v / v).
7. Combinar a luz e péptidos pesados dimetilada (Figura 1) para gerar um total de seis amostras. Ver Tabela 1 para uma descrição de etiquetagem da amostra e a concentração utilizada para este estudo.
8. Realizar a dessalinização da amostra de acordo com os passos 3.2 e 3.3.

5. Isobaric Marcação (resíduos Lys)

1. Reconstituir 100 ug de péptidos dimetilada (1 ug / uL) em 100 mM de bicarbonato de amónio tri-etil (BTEA) (pH ~ 8,5).
2. Preparar reagentes isobáricas como indicado no protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais / Reagentes).
3. Adicionar reagentes isobáricas solubilizadas (41 ul) aos péptidos e vortex durante ~ 10 s. Agitar as amostras num agitador tubo de micro-centrífuga durante ~ 1 h. Extingue-se a reacção com 8 mL de hidroxilamina (10% w / v) e incuba-se as amostras durante 15 min à temperatura ambiente.
4. Reúnem-se os seis amostras marcadas em uma única mistura e desalt (Passos 3,1-3,3) ou armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
   NOTA: Para melhorar a cobertura proteoma e profundidade, uma estratégia de separação multi-dimensional é sugeridotais como de permuta de catiões forte (SCX).

6. troca catiônica forte

1. Execute SCX conforme o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   1. Prepara ~ 1 ml de soluções de formiato de amónio (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, e 500 mM) com 10% de acetonitrilo (ACN), 0,1% de FA (pH 3).
   2. Remover a tampa vermelha a partir do topo da ponta da pipeta e toque a ponta da pipeta com a suspens de embalagem para assegurar que o material de embalagem é para a parte inferior da ponta da pipeta.
      NOTA: Critical: Não jogue fora a ponta da pipeta até o final do protocolo.
   3. Colocar a placa de centrífuga para o topo de um tubo de micro-centruga (2 mL) e fixar a ponta da pipeta para dentro.
   4. Adicionar 150 uL de tampão de reconstituição SCX para pontas de pipeta.
   5. Centrifugar as pontas de pipeta para 6 min à temperatura ambiente (4000 xg). Repita este passo mais duas vezes e descartar os resíduos.
   6. Dissolve-se o peptides em 150 uL de tampão de reconstituição de SCX. Certifique-se de que o pH é de 3.
   7. Adicionar peptídeos para as pontas de pipetas, centrífuga (ver 6.1.5), e manter o eluente.
   8. Transferir o filtro e pipeta para um novo tubo de micro-centruga (2 mL) e adicionar 150 mL de solução de formato de amónio 20 mM. Centrifugar durante 6 min à temperatura ambiente (4000 xg) e manter o eluente.
   9. Repetir o passo 6.1.8 mais sete vezes, utilizando concentrações sucessivas (isto é, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM e 500 mM) de formiato de amónio.
2. Transferir as oito fracções SCX para tubos de micro-centrifugação (1,5 mL) e concentrá-las utilizando evaporação centrífuga (ver passo 3.3).

7. Cromatografia Luida-Espectrometria de Massa em Tandem (LC-MS / MS) e MS ³

1. Reconstituir os péptidos em água grau de espectrometria de massa com 0,1% de FA, filtrar, e colocar num frasco de auto-amostrador. peptídeos filtro como follOWS:
   1. Adicionar péptidos reconstituídos para um tubo de micro-centruga contendo um filtro de 0,65? M (ver Materiais Tabela).
   2. péptidos centrifugar a 12000 xg durante 1 min. Remover filtro, descartar, e adicionar péptidos filtrados para um frasco de auto-amostrador.
2. Prepare os buffers de fase móvel como se segue: 3% (v / v) de ACN com 0,1% de FA (A) e 100% de ACN com 0,1% de FA (B).
3. Injectar 6 uL de cada amostra de fracção de SCX numa coluna armadilha embalado a 2 cm com ₁₈ C-prima (5? M, 200 A de tamanho de poro).
   NOTA: a limpeza da amostra sobre a armadilha é como se segue: 3 min, 0% de B; 3 mL / min usando um sistema de cromatografia líquida de 2D (ver Materiais Tabela).
4. Execute o método de separação analítica. Utilizar uma coluna ID de 75 um x 13,2 centímetros de laser puxou-ponta capilar de sílica fundida embalados com material de C ₁₈ (5? M, 100 Â). O gradiente é: 0-5 min, 10% de B; 5-40 min, 10-15% de B; 40-90 min, 15-25% de B; 90-115 min, 25-30% de B; 115-130 min, 30-60% de B; 130-135 min, 60-80% de B; 135-145 min, 80% de B, 145-150 min, 80-10% de B; 150-180 min, 10% de B; 300 nL / min, 180 min.
5. Execute o de aquisição de dados para o espectrômetro de massa, enquanto o método de separação analítica está em execução.
   NOTA: Os parâmetros para a verificação levantamento MS são como se segue: 400-1,600 m / z, a resolução de 60.000, o controlo automático de ganho (AGC) alvo 1 x 10 ^{6 de} iões, o tempo máximo de injecção de 500 ms. Parâmetros para CID-MS / MS são os seguintes: Topo 1-7 ou aquisição dependente dos dados Topo 8-14 (DDA), 3 m / z largura isolamento, 500 de sinal mínimo, 35% da energia de colisão normalizada (NCE), 0,25 q activação , 10 ms de tempo de activação, a 3 x 10 ⁴ AGC, 50 ms de tempo máximo de injecção. Parâmetros para HCD-MS ³ são como se segue: 200 de sinal mínimo, 4 largura m / z isolamento, 60% NCE, o tempo de activação 0,1, 3 x 10 ⁵ AGC, 250 ms de TI, 300-1,300 m / z intervalo de selecção MS / MS , excluir ião progenitor não fragmentado.
6. Realizar cada análise em duplicado, tanto para o topo 1-7 e superior 8-14 corridas.
   NOTA: Para as amostras executado em um modelo mais recente de um instrumento contendo uma Orbitrap ou um espectrómetro de massa Tribrid, DDA parâmetros irão variar e pode ser optimizado para incluir mais de MS / MS e MS ³ varrimentos. Além disso, para instrumentos Tribrid, selecção precursor síncrono (SPS) -MS ³ deve ser empregue.

8. Análise de Dados ¹⁶

1. Pesquisar os arquivos RAW usando software de análise de proteína contra um banco de dados apropriado, como rato UniProt.
   NOTA: É importante criar dois fluxos de trabalho para cada arquivo RAW, a fim de procurar a luz e peptídeos dimetilado pesados.
2. Pesquisa os arquivos RAW usando os seguintes parâmetros: tripsina com duas clivagens perdidas, gama de massa de péptido 300-6,000 Da, 15 ppm pai tolerância massa, uma tolerância Da fragmentação. modificações estáticos: dimetilao luz (28,031, de péptido N-terminal) ou hdimetilao eavy (36,076 Da, ptido N-terminal), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
   NOTA: Às vezes o pico dimetilada pesado é ~ 7 Da (35,069 Da, ptido N-terminal) é a partir da luz dimetilado pico e, portanto, deve ser incorporada no fluxo de trabalho de pesquisa para péptidos dimetilado pesados. modificações dinâmicos: oxidação (15,995 Da, H), TAG isobárica 6-Plex (229,163 Da, K). Incluem uma pesquisa da base de dados de engodo para proporcionar taxas de detecção falso (por exemplo, 1 e 5%) e um nó de quantificação para procurar as intensidades de iões repórter de etiquetas isobáricas.
3. Estatisticas
   1. dados de exportação para um programa de folha de cálculo electrónica, a fim de normalizar os valores de iões repórter proteína. Para cada proteína, dividir ambos os rácios de iões repórter mediana ou intensidades de iões repórter em bruto pela proporção mediana do padrão interno ou intensidades de iões repórter matérias do padrão interno, respectivamente. Use o software estatístico adequado, tais como um programa de planilha eletrônica, Perseus, ou R para determinar alterações significativas entre condições de amostra.

Resultados

cPILOT utiliza química à base de amina de péptidos quimicamente etiqueta na extremidade N-terminal e resuos de lisina e melhora as capacidades de multiplexação de amostra. A Figura 2 mostra os dados de MS representante que é obtido a partir de uma análise cPILOT 12-Plex de cérebro, coração, fígado e tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer. Como mostrado na Tabela 1, duas réplicas biológicas ...

Discussão

cPILOT permite a medição simultânea de mais do que 12 amostras originais. A fim de assegurar a etiquetagem bem sucedido em ambos os resíduos do N-terminal e lisina de péptidos, é imperativo ter o pH correcto para cada conjunto de reacções e para executar a primeira reacção dimetilao para rotulagem péptido. dimetilao selectiva na extremidade N-terminal é realizada por ter um pH em ~ 2,5 (± 0,2). Isto é conseguido através da exploração das diferenças de pKa de um dos grupos amino de lisina e o N-terminus...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water - MS Grade	Fisher Scientific	W6-4	4 L quantity is not necessary
Acetonitrile - MS Grade	Fisher Scientific	A955-4	4 L quantity is not necessary
Acetic Acid	J.T. Baker	9508-01
Ammonium hydroxide solution (28 - 30%)	Sigma Aldrich	320145-500ML
Ammonium formate	Acros Organics	208-753-9
Formic Acid	Fluka Analytical	94318-250ML-F
BCA protein assay kit	Pierce Thermo Fisher Scientific	23227
Urea	Biorad	161-0731
Tris	Biorad	161-0716
Dithiothreiotol (DTT)	Fisher Scientific	BP172-5
Iodoacetamide (IAM)	Acros Organics	144-48-9
L-Cysteine	Sigma Aldrich, Chemistry	168149-25G
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich, Life Science	T1426-100MG
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 - 38% in H2O	Sigma Aldrich, Life Science	F8775-25ML
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C	Sigma Aldrich, Chemistry	596388-1G
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95%	Sigma Aldrich	156159-10G
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP	Sigma Aldrich, Chemistry	190020-1G
Strong Cation Exchange (SCX) spin tips sample prep kit	Protea BioSciences	SP-155-24kit
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer	Sigma Aldrich, Life Science	T7408-100ML
Isobaric Tagging Kit (TMT 6 plex) - 6 reactions (1 x 0.8 mg)	Thermo Fisher Scientific	90061
Hydroxylamine hydrochloride	Sigma Aldrich, Chemistry	255580-100G
Standard vortex mixer	Fisher Scientific	2215365	any mixer can be used
Oasis HLB 1 cc (10 mg) extraction cartridges	Waters	186000383	These are C18 cartridges
Visiprep SPE vacuum manifold, DL (disposable liner), 24 port model	Sigma Aldrich	57265	A 12 port model is also sufficient
Speed-vac	Thermo Scientific	SPD1010	any brand of speed vac is sufficient
Water bath chamber	Thermo Scientific	2825/2826	Any brand of  a water bath chamber with controlled temperatures is sufficient.
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G)	MP Biomedicals	116005500
Eksigent Nano LC - Ultra 2D with Nano LC AS-2 autosampler	Sciex	-	This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient.
LTQ Orbitrap Velos Mass Spectrometer	Thermo Scientific	-	This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used.
Protein software (e.g. Proteome Discoverer)	Thermo Scientific	IQLAAEGABSFAKJMAUH
Analytical balance	Mettler Toledo	AL54
Stir plate	VWR	12365-382	Any brand of stir plates are sufficient
pH meter (Tris compatiable)	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-183	Any brand of a pH meter is sufficient
pH 10 buffer	Fisher Scientific	06-664-261	Any brand of pH buffer 10 is sufficient
pH 7 buffer	Fisher Scientific	06-664-260	Any brand pH buffer 7 is sufficient
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	05-408-129	Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk	Fisher Scientific	04-408-120	Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units	EMD Millipore	UFC30DV00
2 mL microcentrifuge tubes, 72 units	Thermo Scientific	69720
C18 packing material (5 µm, 100 Å)	Bruker	PM5/61100/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient
C18 packing material (5 µm, 200 Å)	Bruker	PM5/61200/000	This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient