Redox Cellular Profiling Usando Microscopia de Alto Conteúdo

Resumo

Este trabalho apresenta um fluxo de trabalho de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, bem como o potencial e morfologia da membrana mitocondrial, denominados conjuntamente como morfofunção mitocondrial, em células vivas aderentes, 6) -clorometil-2 ', 7'-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM-H ₂ DCFDA) e éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (ROS) regulam os processos celulares essenciais, incluindo a expressão gênica, migração, diferenciação e proliferação. No entanto, níveis excessivos de ROS induzem um estado de estresse oxidativo, que é acompanhado por danos oxidativos irreversíveis ao DNA, lipídios e proteínas. Assim, a quantificação de ROS fornece um proxy direto para condição de saúde celular. Uma vez que as mitocôndrias estão entre as principais fontes e alvos celulares de ROS, a análise conjunta da função mitocondrial e da produção de ROS nas mesmas células é crucial para melhor compreensão da interconexão em condições fisiopatológicas. Portanto, desenvolveu-se uma estratégia baseada em microscopia de alto conteúdo para quantificação simultânea dos níveis intracelulares de ROS, potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ _m ) e morfologia mitocondrial. É baseado em microscopia de fluorescência de campo largo automatizada e análise de imagem de células aderentes vivas, cultivadas em placas de múltiplos poços, e staineD com as moléculas fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) e TMRM (ΔΨm e morfologia mitocondrial) permeáveis ​​às células. Em contraste com a fluorimetria ou citometria de fluxo, esta estratégia permite a quantificação dos parâmetros subcelulares ao nível da célula individual com elevada resolução espaço-temporal, tanto antes como depois da estimulação experimental. É importante notar que a natureza baseada em imagens do método permite extrair parâmetros morfológicos além das intensidades de sinal. O conjunto de recursos combinados é usado para análise de dados multivariada exploratória e estatística para detectar diferenças entre subpopulações, tipos de células e / ou tratamentos. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada do ensaio, juntamente com um exemplo de experiência que comprova o seu potencial para discriminação inequívoca entre estados celulares após perturbação química.

Introdução

A concentração de ROS intracelular é meticulosamente regulada através de uma interacção dinâmica entre a produção de ROS e sistemas de desactivação ROS. O desequilíbrio entre os dois provoca um estado de estresse oxidativo. Entre as principais fontes de ROS estão as mitocôndrias ¹ . Dado o seu papel na respiração celular, são responsáveis ​​pela maior parte das moléculas intracelulares de superóxido (O ₂ ^{• -} ) ² . Isto resulta principalmente da fuga de electrões para O ₂ no complexo 1 da cadeia de transporte de electrões em condições de forte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ _m ), isto é , hiperpolarização mitocondrial. Por outro lado, a despolarização mitocondrial também tem sido correlacionada com o aumento da produção de ROS apontando para múltiplos modos de ação ^{3 , 4 , 5 ,}> 6 ^{, 7 , 8} . Além disso, através de modificações redox em proteínas da maquinaria de fusão-fissão, ROS co-regular a morfologia mitocondrial ^9. Por exemplo, a fragmentação está correlacionada com o aumento da produção de ROS e apoptose 10,11, enquanto as mitocôndrias filamentosas têm sido associadas à inanição de nutrientes e proteção contra Mitófago ¹² . Dada a intrincada relação entre ROS celular e morfofunção mitocondrial, ambos idealmente devem ser quantificados simultaneamente em células vivas. Para fazer exatamente isso, um ensaio de imagem de alto conteúdo foi desenvolvido com base em microscopia automatizada de campo amplo e análise de imagem de culturas de células aderentes coradas com as sondas fluorescentes CM-H ₂ DCFDA (ROS) e TMRM (mitochondrial Δψ _m e morfologia). Imagens de alto conteúdo refere-se à extração de spAtiotemporally ricos ( ou seja , grande número de características descritivas) informações sobre fenótipos celulares usando múltiplos marcadores complementares e análises automatizadas de imagem. Quando combinadas com microscopia automatizada, muitas amostras podem ser rastreadas em paralelo ( isto é, alto rendimento), aumentando assim o poder estatístico do ensaio. Na verdade, um dos principais ativos do protocolo é que permite a quantificação simultânea de vários parâmetros na mesma célula, e isso para um grande número de células e condições.

O protocolo é dividido em 8 partes (descritas em detalhe no protocolo abaixo): 1) Semeadura de células numa placa de 96 poços; 2) Preparação de soluções-mãe, soluções de trabalho e tampão de imagem; 3) Instalação do microscópio; 4) Carregamento das c�ulas com DCFDA CM-H ₂ e TMRM; 5) Primeira ronda de imagens ao vivo para medir os níveis basais de ROS e morfofunção mitocondrial; 6) Segunda ronda de imagens ao vivo após adição de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir os níveis de ROS induzidos; 7) Análise automatizada de imagens; 8) Análise de Dados, Controle de Qualidade e Visualização.

O ensaio foi originalmente desenvolvido para fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF). Uma vez que estas células são grandes e planas, eles são bem adequados para avaliar a morfologia mitocondrial em 2D widefield imagens [ ^{13 , 14]} . No entanto, com pequenas modificações, este método é aplicável a outros tipos de células aderentes. Além disso, ao lado da combinação de DCFDA CM-H2 e TMRM, o fluxo de trabalho está em conformidade com uma variedade de pares de corantes fluorescentes com diferentes especificidades moleculares ^{1 , 15} .

Protocolo

O protocolo abaixo é descrito como realizado para células NHDF e com utilização das placas multipoço especificadas no ficheiro de materiais. Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral do fluxo de trabalho.

1. Preparação de Reagentes

1. Preparar o meio completo suplementando o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% v / v de soro bovino fetal (FBS) e 100 IU / mL de penicilina e 100 IU / mL de estreptomicina (PS). Para 500 mL de meio completo, adicionar 50 mL de FBS e 5 mL de PS a 445 mL de DMEM.
2. Preparar o tampão de imagem HBSS-HEPES (HH), suplementando a solução de sal equilibrada de Hank (com magnésio e cálcio, mas sem vermelho de fenol) com HEPES 20 mM. Para 500 mL de HH, adicionar 10 mL de solução-mãe de HEPES 1M a 490 mL de HBSS. Verificar o pH e, se necessário, ajustar a pH 7,2.
3. Preparar solução-mãe CMF-H ₂ DCFDA 1 mM por dissolução de 50 μg de pó liofilizado CM-H ₂ DCFDA em 86,5 &# 181; L DMSO anidro. Misture vortexando ou pipetando para cima e para baixo e faça alíquotas de 20 μL em tubos de microcentrífuga marrom. Armazenar no escuro a -20 ° C e usar dentro de 1 semana. Se armazenado sob N ₂ -atmosphere vida útil pode ser aumentada até pelo menos 1 mês.
   1. Preparar solução-mãe TMRM 1 mM dissolvendo 25 mg de TMRM em pó em 50 mL de DMSO anidro. Misturar por vortex ou pipetagem para cima e para baixo e fazer alíquotas de 10 μL em tubos de microcentrífuga marrom. Armazenar no escuro a -20 ° C. Esta solução é estável por pelo menos um ano.
4. Preparar uma alíquota fresca de stock de peróxido de tert -butilo (TBHP) (~ 7 M) para cada experiência pipetando directamente um volume a partir da solução de reserva a 70% (10 μL / placa de 96 poços). Manter esta alíquota a 4 ° C até nova utilização.
5. Preparar a solução de trabalho de anticorpos (AB) diluindo dois anticorpos secundários (Alexa Fluor 488 burro anti-coelho e CY3 burro anti-coelho) 1.000 vezes em 1x HH-buFfer.

2. Configuração do Microscópio e Protocolo de Aquisição (± 15 min)

NOTA: A aquisição de imagem é realizada com um microscópio de campo amplo equipado com um estágio automatizado e obturadores, e um sistema de autofoco baseado em hardware usando um objetivo 20X ar Plan-corrigido (NA = 0,75) e uma câmera EM-CCD. Ao configurar o ensaio pela primeira vez, é utilizada uma placa de ensaio contendo células de controlo, coradas de acordo com as instruções do protocolo, para calibrar o estádio XY e optimizar as configurações de aquisição. Se as configurações de aquisição já foram determinadas, a calibração pode ser feita usando uma placa vazia.

1. Abaixe o objetivo para o nível base absoluto e calibre o estágio XY seguindo as instruções do software.
2. Verifique se os cubos de filtro corretos estão instalados. Para visualizar CM-H ₂ DCFDA, use um cubo de filtro GFP padrão com um filtro de banda de excitação de 472/30 nm, um dicro de corte de 495 nmE um filtro de emissão de banda 520/35 nm. Para o TMRM, use um cubo de filtro para TRITC com um filtro de excitação de passagem de banda de 540/25 nm, um espelho dicróico de corte de 565 nm e um filtro de emissão de banda de 605/55 nm.
3. Crie um protocolo de imagem utilizando o software de aquisição.
   1. Selecione o tipo correto de placa multipoço (fabricante e código) da lista de placas disponíveis fornecidas no software. Como alternativa, defina o seu próprio formato de placa de multi-poço usando as dimensões de placa e poço.
   2. Alinhe a placa do poço de acordo com as instruções do software, por exemplo , definindo dois cantos dos quatro poços de canto externo. Esta etapa cobre a variação da orientação da câmera.
   3. Selecione os poços que precisam ser adquiridos. Se esta opção não estiver disponível no software, use um conjunto de localizações XY definidas manualmente que correspondam aos poços selecionados.
   4. Otimizar as configurações de aquisição (tempo de exposição, intensidade da lâmpada,E dois canais separadamente usando a placa de teste. Minimize a exposição ea intensidade como a própria luz de excitação de fluorescência induz ROS. Mas, certifique-se de que a relação sinal / fundo seja pelo menos 2 para DCFDA CM-H ₂ basal e 3 para TMRM antes do tratamento TBHP e que não haja saturação após tratamento com TBHP. As definições de aquisição dependem muito da configuração da microscopia e do tipo de célula utilizada, mas como referência, as definições indicativas quando se utiliza uma lâmpada de halogeneto metálico de 130 W como fonte de luz e células NHDF coradas de acordo com as instruções do protocolo são as seguintes: H ₂ DCFDA e TMRM são utilizados um tempo de exposição de 200 ms e um filtro ND 8, combinados com um ganho EM de 15 (13 MHz; 14 bits) e 4 (27 MHz; 14 bits), respectivamente. Uma vez otimizado para uma determinada configuração e tipo de célula, essa etapa pode ser ignorada.
      NOTA: é essencial que as definições de aquisição sejam mantidas iguais ao longo de todo o processo de imagem. Para experiências em grande escala, de vários dias,Deve ser garantida por um controle de qualidade regular.
   5. Definir um protocolo de aquisição, consistindo em uma aquisição sequencial lambda (comprimento de onda). Selecione o CM-H ₂ DCFDA canal a ser adquirido em primeiro lugar, para minimizar a exposição à luz antes da medição.
   6. Definir um laço de placa de poço, para adquirir 4 imagens não-sobrepostas regularmente espaçadas posicionadas ao redor do centro de cada poço da seleção de poço usando o protocolo de aquisição definido em 2.3.4. Escolha a aquisição de imagens sinuosas, isto é, primeiro da esquerda para a direita, do poço B02 até B11, depois de trás, da direita para a esquerda, do poço C11 a C02 e assim por diante ( Figura 2A ). Isso economiza tempo em comparação com a aquisição de imagem da esquerda para a direita. Se esta opção não estiver disponível no software, ajuste o conjunto personalizado de locais XY criados em 2.3.3 para assumir este padrão de imagem.
   7. Salve as coordenadas XY das posições de imagem ( por exemplo, em um arquivo xml separado), paraEm caso de recalibração do microscópio. Isto é especialmente importante se a leitura deste ensaio tem de ser correlacionada com uma coloração por imunofluorescência (IF) post-hoc para as mesmas células.

3 . Seeding Cells em uma placa de 96 poços (45 - 90 min, dependendo do número de diferentes linhas celulares)

1. Trabalhar em ambiente estéril, como um gabinete de biossegurança de classe 2 e usar luvas.
2. Descontaminar todas as superfícies e materiais usando etanol a 70% v / v em água destilada.
3. Tome um frasco de cultura celular com uma cultura de células confluentes de 90% da incubadora e coloque-o no gabinete de biossegurança.
4. Lavar as células duas vezes com PBS 1x.
5. Adicionar a quantidade apropriada de solução de tripsina-EDTA a 0,05% nas células, certificando-se de que a superfície celular completa é coberta ( por exemplo , 1 mL para um balão T25) e incubar durante 2 min a 37 ° C e 5% de CO2.
6. Se todas as células estiverem destacadas (verifique com um microscópio ), Adicionar meio de cultura (DMEM + FBS a 10% + penicilina-estreptomicina a 1% ± 4 mL num balão T25) para inactivar a solução de tripsina-EDTA.
7. Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg à temperatura ambiente.
8. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em meio de cultura. Determine a quantidade de meio para cada tipo de célula para obter uma concentração celular que seja compatível com a contagem de células. Tipicamente, um frasco T25 confluente a 90% de NHDF contém cerca de 1 a 1,5 milhões de células, que são ressuspensas em 3-4 ml de meio de cultura.
9. Contar as células usando uma câmara de contagem de células ou contador Coulter.
10. Sementes 8.000-10.000 células em cada um dos 60 poços interiores de uma placa de 96 poços preta com um fino poliestireno contínuo ou fundo de vidro (preto para evitar a dispersão e cross-talk entre poços adjacentes durante a imagem). Quando se utilizam diferentes condições / tratamentos / linhas celulares, distribuem os seus locais de semeadura homogeneamente na placa de modo a minimizar os efeitos da placa (Os poços externos, com exceção dos poços B01 e A01, não são utilizados porque são mais propensos aos efeitos de borda.
11. Semear 8.000-10.000 células em B01. Este poço será utilizado para ajuste do foco, imediatamente antes da aquisição da imagem.
12. Encher os poços externos vazios com meio para minimizar gradientes (temperatura, umidade, etc. ) entre os poços e o ambiente.
13. Toque suavemente a placa três vezes antes de colocá-lo de volta para a incubadora para evitar que as células cresçam em remendos.
14. Cultivar as células durante 24 h, ou até um grau de confluência de aprox. 70%.
15. Salve as informações de tratamento para a experiência em uma planilha chamada "Setup.xlsx". O arquivo deve conter quatro colunas e será usado para vincular tratamentos com poços e informações de imagem durante a análise de dados. As quatro colunas são: "Bem", "Número de tratamento", "Tratamento" e "Controlo" (uma linha por poço). Cada tratamento é acopladoCom um número de tratamento único, que é utilizado durante a visualização dos dados para determinar a ordem dos tratamentos no eixo X das parcelas. A coluna de controle especifica o tratamento que funciona como controle para o tratamento na linha atual. As ilustrações de um layout experimental típico e do arquivo de configuração correspondente são mostradas na Figura 2 .

4. Carregamento das C�ulas com DCFDA CM-H ₂ e TMRM (± 45 min)

NOTA: A manipulação das células no dia da experiência pode ser realizada num ambiente estéril (gabinete de biossegurança), mas isso não é obrigatório porque as células serão descartadas ou fixadas diretamente após o ensaio.

1. Aquecer o tampão HH a 37 ° C.
2. Preparar uma solução de trabalho TMRM 20 μM diluindo a solução-mãe 1 mM 50 vezes em tampão HH (adicionar 490 μL de tampão HH a 1 alíquota de 10 μL de solução mãe TMRM).
3. Prepare uma cargaCom 2 μM CM-H ₂ DCFDA e 100 nM TMRM. Para este fim, dilui-se a solução-mãe de CMF-H ₂ CMF 500x e a solução de trabalho de TMRM 20 μM 200x em tampão HH.
   1. Tipicamente, para 60 po�s, preparar 7,5 mL de solu�o de carga adicionando 15 � de DCFDA CM-H2 e 37,5 � de solu�o TMRM a 7447,5 � de HH.
4. Descarte o meio de cultura das células, virando a placa de cabeça para baixo em um único movimento de fluido.
5. Lavar cuidadosamente as células duas vezes com tampão HH utilizando uma pipeta multicanal (100 μL / poço). Descarte o tampão HH entre as etapas de lavagem girando a placa de cabeça para baixo em um único movimento de fluido.
6. Carregar as células com DCFDA CM-H ₂ e TMRM adicionando 100 μL da solução de carga a cada poço, novamente usando uma pipeta multicanal. Incubar durante 25 min no escuro, à temperatura ambiente. Não esqueça bem B01.
7. Durante estes 25 min, prepare soluções de trabalho do oxidante TBHP e certifique-se de que o microscópio eo hardware acessório estão ligados.
   1. Preparar a solução de trabalho I: Diluir a solução de reserva 7M 70x a 100 mM (10 μL de stock em 690 μL de tampão HH).
   2. Preparar a solução de trabalho II: Diluir WS I 100x a 1 mM (10 μL de WS I em 990 μL de tampão HH).
   3. Preparar a solução de trabalho III: Diluir WS III 25x a 40 μM (para 60 poços adicionar 300 μL de WS II em 7200 μl de tampão HH).
8. Ap� 25 min, lavar as c�ulas novamente duas vezes com 100 � de tamp� HH como descrito antes.
9. Adicionar 100 μL de tampão HH a todos os 60 poços internos.

5. Primeira Rastreabilidade de Imagem ao Vivo para Medir Níveis Basais de ROS e Morfofunção Mitocondrial (± 15 min)

1. Certifique-se de que o software de aquisição está operacional eo protocolo de imagem é carregado.
2. Instale a placa no microscópio, ligue o hardware baSed autofocus sistema e usar bem B01 para ajustar o deslocamento de foco automático usando o canal TMRM. Como este procedimento induz um aumento na intensidade do sinal CM-H ₂ DCFDA, este poço é excluído da análise de imagem a jusante.
3. Execute o protocolo de imagem.

6. Segunda ronda de imagens ao vivo após a adição de TBHP para medir os níveis de ROS induzidos (± 20 min)

1. Remova cuidadosamente a placa de 96 poços do microscópio.
2. Adicionar 100 μL de TBHP WS III (40 μM) a cada poço utilizando uma pipeta multicanal (Isto resulta numa concentração de 20 μM de TBHP nos poços). Este composto é utilizado como um controlo positivo interno para a coloração CM-H ₂ DCFDA (o sinal deve subir) assim como um meio para medir os níveis de ROS induzidos.
   NOTA: H ₂ O ₂ também pode ser usado em vez de TBHP, mas este composto é menos estável e, portanto, menos confiável.
3. Aguarde pelo menos 3 min para permitir a reação completa de TBHP wCom CM-H ₂ DCFDA.
4. Durante este tempo, adicione 100 μL de solução de trabalho de anticorpos (1/1 000) ao poço A01.
5. Monte a placa de volta no microscópio e verificar o foco novamente usando o poço B01.
6. Adquirir as mesmas posições que na primeira ronda de imagens usando o mesmo protocolo de imagem.
7. Exportar os conjuntos de dados adquiridos em uma única pasta como arquivos tiff individuais usando uma nomenclatura padronizada que inclui referência à placa, tratamento pré e pós-TBHP, poço, campo e canal, separados por sublinhados, ex . 'P01_Pre_B02_0001_C1' para a placa 1, tratamento pré-TBHP, poço B02, campo 1 e canal 1. Esta informação será utilizada durante a análise de imagem ( por exemplo, para seleccionar as definições de segmentação apropriadas), bem como durante a análise de dados Com os tratamentos corretos).
8. Adquirir imagens de campo plano para ambos os canais em todas as quatro posições em torno do centro do poço A01 usando o protocolo de aquisição. SalvaEm como arquivos tiff individuais na mesma pasta que as outras imagens usando a seguinte nomenclatura padronizada: 'P01_FF_A01_0001_C1' para a placa 1, campo 1 e canal 1. Certifique-se de que os sinais estão bem dentro da faixa dinâmica; Em caso de saturação, utilizar uma concentração mais baixa de solução de trabalho de anticorpos.
9. Descarte a placa ou salve para processamento posterior.
   NOTA: Em vez de remover a placa do microscópio e usar uma pipeta multicanal para adicionar a solução TBHP, uma pipeta automatizada pode ser instalada no estágio do microscópio e conectada com o software de aquisição de modo a funcionar ao receber um gatilho. Isso permite adicionar TBHP a cada poço diretamente após a primeira aquisição, antes de passar para o próximo poço. Desta forma, quando a primeira ronda de imagens é concluída, a segunda pode começar imediatamente e todos os poços terão tido um tempo de incubação igual com o TBHP.

7. Processamento e Análise de Imagens (± 30 min porPlaca de 96 poços)

NOTA: Todo o processamento de imagem é executado em FIJI (http://fiji.sc), uma versão empacotada do freeware ImageJ. Um script dedicado foi escrito para análise automatizada de ROS intracelular e sinais mitocondriais, bem como parâmetros morfológicos (RedoxMetrics.ijm, disponível mediante solicitação). Os algoritmos subjacentes são descritos em Sieprath et al. ¹ .

1. Certifique-se de que o FIJI está instalado e operacional.
2. Inicie o FIJI e instale o conjunto de macros (Plugins -> Macros -> Install ...). Isso irá chamar um número de novos comandos de macro, bem como um conjunto de ferramentas de ação para otimizar as configurações de análise, como mostrado na Figura 3A .
3. Abra a interface de configuração para definir as configurações de análise clicando no botão 'S' ( Figura 3B ).
   1. Selecione o tipo de imagem, o número de canais eo poço que foi usadoPara aquisição de imagens flatfield.
   2. Indique qual canal contém células (canal CM-H ₂ DCFDA) ou mitocôndrias (canal TMRM) e ajuste os parâmetros de pré-processamento e segmentação para cada canal dependendo da qualidade da imagem ( Figura 3B ). Marque as caixas de seleção 'Fundo' e 'Contraste' para efetuar a subtração de fundo ou a equalização do histograma adaptável limitada pelo contraste ¹⁶ , respectivamente. Definir um sigma para Gaussian blurring de células e Laplacian realce das mitocôndrias. Selecione um algoritmo de thresholding automático e preencha os limites de exclusão de tamanho (em pixels). Se um limite fixo for escolhido em vez de um algoritmo de thresholding automático, preencha o limite superior.
   3. Teste as configurações de segmentação em algumas imagens selecionadas dos conjuntos de dados adquiridos, abrindo-os e clicando nos botões 'C' ou 'M' no menu para segmentação de células ou mitocôndrias, respectivamente,E ajuste as definições, se necessário. Um exemplo de resultado é mostrado na Figura 3C .
4. Execute a análise de lote na (s) pasta (s) de interesse clicando no botão '#' e selecionando a pasta com as imagens. Por pasta, isso produzirá um novo diretório 'Output', contendo conjuntos de ROI individuais (arquivos zip) e arquivos de resultado (.txt) por imagem. Para ambos os canais o arquivo de resultados contém intensidade e descritores morfológicos. O arquivo de resultados do canal CM-H ₂ DCFDA (células) contém, por descritor, o valor médio dos ROIs combinados dentro de uma imagem. Para o canal TMRM, o arquivo de resultados contém por descritor o valor para cada ROI mitocondrial segmentado individualmente.
5. Após a análise do lote, verifique visualmente o desempenho de segmentação em uma 'Pilha de verificação', uma hiper-pilha de todas as imagens com a respectiva sobreposição de ROI clicando no botão 'V'. Desta forma, artefatos como over-/ Undersegmentation, imagens fora de foco ou partículas de poeira / fibras em imagens já podem ser manchadas rapidamente. Pode-se realizar uma cura adicional durante o controle da qualidade dos dados (cfr.

8. Análise de Dados, Controle de Qualidade (QC) e Visualização

Processamento e análise dos dados em bruto é feito usando R estatística freeware (http://www.rproject.org - versão 3.3.2) e RStudio (http://www.rstudio.com/ - versão 1.0.44). Para obter e visualizar rapidamente os resultados, foi concebida uma aplicação intuitiva Shiny ¹⁷ (disponível a pedido) que integra e visualiza os dados em heatmaps e boxplots, além de realizar análises estatísticas. Em geral, o fluxo de trabalho compreende dois passos consecutivos. Primeiro, os dados são processados ​​e inspecionados por placa de 96 poços para detectar pontos de dados aberrantes. Em segundo lugar, os dados curados de todas as placas de um dado experimento são combinados e analisados ​​usando multi-paramétricosVariáveis ¹⁸ e uma análise de componentes principais.

1. Verifique se R e RStudio estão instalados e operacionais.
2. Inicie o RStudio.
3. Abra o aplicativo RedoxMetrics brilhante e execute o aplicativo (escolha para executá-lo em um navegador externo).
4. Na página 'entrada', selecione o diretório onde os arquivos de resultados de RedoxMetrics.ijm estão localizados.
5. Certifique-se 'Setup.xlsx' (criado no passo 3.15) também está presente dentro deste directório.
6. Os arquivos de resultados e as informações de configuração são automaticamente importados, reorganizados e visualizados.
   1. A página "Configuração experimental" mostra o layout da experiência. Use esta página para verificação.
   2. Na página seguinte, 'results per plate' mostra os dados de cada placa separadamente em um layout de placa multi-poço codificado por cores, bem como em boxplots com outliers marcados com o nome do poço eo número da imagem. Este último permite fácil inspecção e identificaçãoÇão de pontos de dados aberrantes (valores extremamente altos ou baixos comparados com os valores médios medidos para esse tratamento específico - veja a Figura 4 para um exemplo).
      Usando esta informação, verifique as imagens correspondentes aos pontos aberrantes. Se forem detectadas anormalidades, elas devem ser removidas da análise. A maioria das anormalidades é causada por segmentação imprópria quando (parte) da imagem está fora de foco, ou quando partículas de pó altamente fluorescentes perturbam a segmentação adequada. Os casos extremos já podem ser detectados rapidamente usando a ferramenta de pilha de verificação (etapa 7.5), mas descobertas mais sutis nesta etapa. Quando nenhuma razão aparente ou técnica pode ser encontrada para o valor aberrante, a imagem não deve ser removida da análise.
   3. Opcional: crie uma nova planilha chamada 'Drop.xlsx' com apenas uma coluna chamada 'Drop'. Nesta coluna, liste os nomes dos arquivos (incluindo a extensão ".tif") de todas as imagensQue devem ser removidos da análise (identificados no passo 7.5 ou no passo 8.6.2). Carregue este arquivo usando a página 'entrada'.
   4. A página "resultados de toda a experiência" mostra os resultados de todas as placas combinadas. Se um arquivo drop foi carregado, este arquivo é usado para remover os pontos de dados especificados da análise.
      Para cada parâmetro individualmente, os dados são normalizados por placa de acordo com seus respectivos controles. Os dados de todas as placas são então combinados, seguidos por testes multivariados não paramétricos do pacote nparcomp ¹⁸ . Se apenas dois tratamentos forem comparados, serão realizados dois testes de amostra para o problema de Behrens-Fisher não paramétrico. Para mais de 2 tratamentos, é utilizado um teste de comparação múltipla não paramétrico baseado em contraste. Os resultados são visualizados usando blocos de caixa.
   5. A página 'análise de cluster' mostra os resultados de uma análise de componentes principais (pacote de 'estatísticas' do PCA - R). Dados de 5 parâmetros (baSal e ROS induzido e potencial de membrana mitocondrial, tamanho e circularidade) são combinados para discriminar os diferentes tratamentos com base em um perfil redox sensível. Para este fim, realiza-se uma análise de componentes principais (PCA) (pacote R stats 'core'). Os resultados são visualizados usando um biplot (pacote ggbiplot - http://github.com/vqv/ggbiplot).
   6. Use a página "download de dados" para baixar os quadros de dados de back-end contendo os dados processados ​​e reorganizados, de modo que possam ser reutilizados para visualização mais avançada de dados ou análises estatísticas.
      NOTA: As armadilhas típicas e soluções potenciais estão listadas na Tabela 1 .

Resultados

O ensaio foi comparado utilizando várias experiências de controlo, cujos resultados estão descritos em Sieprath et al. ¹ . Em resumo, a resposta de fluorescência de CM-H ₂ DCFDA e TMRM a induzido extraneamente alterações no ROS intracelular e Δψ _m, respectivamente, foi quantificada para determinar o intervalo dinâmico. Para o DCFDA CM-H ₂ , o NHDF mostrou um aumento linear no sinal de fluorescência quando tratado...

Discussão

Este artigo descreve um método de microscopia de alto conteúdo para a quantificação simultânea de níveis intracelulares de ROS e morfofunção mitocondrial em NHDF. O seu desempenho foi demonstrado com um estudo de caso sobre NHDF tratado com SQV. Os resultados suportam evidências anteriores da literatura em que se observaram níveis elevados de ROS ou disfunção mitocondrial após tratamento com inibidores de protease de HIV tipo 1, embora em experiências separadas ^{19 ,}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2