Síntese de biocompatíveis cristal líquido de elastómero Espumas como andaimes celulares para cultura de células 3D espaciais

Resumo

Este estudo apresenta uma metodologia para preparar 3D, andaimes, células do tipo espuma biodegradáveis ​​à base de elastómeros biocompatíveis cristal líquido de cadeia lateral (LCES). expericias de microscopia confocal demonstram que LCEs do tipo espuma para permitir a ligação de células, proliferação, e o alinhamento espontânea de mioblastos C2C12s.

Resumo

Aqui, nós apresentamos uma preparação passo-a-passo de um,, andaime célula semelhante a espuma biodegradáveis ​​3D. Estes suportes foram preparados por ligação cruzada bloco em estrela de co-polímeros caracterizam unidades de colesterol como grupos pendentes da cadeia lateral, resultando em esmética-A (SmA) elastómeros de cristais líquidos (LCES). andaimes do tipo espuma, preparados utilizando moldes de metal, apresentam microcanais interligados, tornando-as adequadas como suportes de cultura celular 3D. As propriedades combinadas da estrutura regular da espuma metica e do resultado elastómero num andaime célula 3D que promove a proliferação de células não só mais elevado em comparação com películas convencionais porosas de modelo, mas também uma melhor gestão de transporte de massa (isto é, nutrientes, gases, resíduos , etc). A natureza do molde de metal permite a manipulação fácil de formas de espuma (isto é, rolos ou películas) e para a preparação de andaimes de diferentes tamanhos de poros para diferentes estudos de células embora preservando a interconnected natureza porosa do molde. O processo de corrosão não afeta a química dos elastômeros, preservando a sua natureza biocompatível e biodegradável. Mostramos que essas LCEs esméticos, quando cultivadas por períodos de tempo extensos, permitem o estudo de construções de tecido clinicamente relevantes e complexos, promovendo o crescimento e proliferação de células.

Introdução

Existem vários exemplos de materiais sintéticos e biológicos biocompatíveis para aplicação em estudos de células e para a regeneração de tecidos com vista a fixação de células e proliferação de ^{1, 2, 3, 4, 5.} Tem havido alguns exemplos de materiais biocompativeis, conhecidos como elastómeros de cristais líquidos (LCES), que poderiam responder aos estímulos externos com anisotrópica molecular encomendar ^{6, 7.} LCEs são materiais estímulos-sensíveis que combinam as propriedades mecânicas e elásticas de elastómeros com a funcionalidade óptica e de ordenação molecular de cristais líquidos ^{8, 9.} LCEs pode sofrer alterações de forma, a deformação mecânica, o comportamento elástico, e propriedades ópticas, em resposta a STIM externosuli (isto é., calor, tensão, luz, etc) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Estudos anteriores demonstraram que os cristais líquidos (LCS) pode detectar o crescimento e a orientação de células ^{4, 17.} É possível, então, assumir que LCEs podem ser adequados para aplicações biológica e medicamente relevantes, incluindo andaimes célula e alinhamento. Descrevemos previamente a preparação de filmes esméticos biocompatíveis, biodegradáveis, lançou-moldados, e LCES finas apresentando um "tipo Swiss-queijo" morfologia porosa ^{6, 18.} Nós também preparado LCEs biocompatíveis nemáticos com morfologia globular como suportes para o crescimento de células ^{19 , 20. Nosso trabalho teve como objetivo ajustar as propriedades mecânicas dos materiais para coincidir com as do tecido de interesse 21. Além disso, estes estudos focam a compreensão das interacções célula-elastómero, assim como resposta celular em que os elastómeros são sujeitos a estímulos externos.}

Os principais desafios foram, em parte, para adaptar a porosidade das LCEs para permitir a fixação das células e a permeação através da matriz de elastómero e de uma melhor transferência de massa. A porosidade destes filmes finos ⁶ permitido para a permeação celular através da maior parte da matriz, mas nem todos os poros eram totalmente interligado ou tinham um tamanho mais regular (homogénea) poros. Em seguida, apresentou um relatório sobre biocompatíveis elastômeros LCE nemáticos com morfologias globulares. Estes elastómeros nemáticos permitido para a adesão e proliferação de células, mas o tamanho dos poros variou somente de 10-30 um, o qual impedido ou limitado a utilização desteselastómeros com uma ampla variedade de linhas de células ^{19, 20.}

Os trabalhos anteriores por Kung et ai. sobre a formação de espumas de grafeno usando um molde de metal "sacrificial" mostrou que a espuma grafeno obtido tinha uma morfologia porosa muito regular ditada pelo molde do metal escolhido ^22. Esta metodologia oferece controle total de porosidade e poros tamanho. Ao mesmo tempo, a maleabilidade e flexibilidade do molde do metal permitir a formação de molde diferentes formas antes da preparao da espuma. Outras técnicas, tais como lixiviação de material ^23, de templates ^de gás ^24, ou fibras fiadas electrodepositadas ^{25, 26} também oferecer o potencial para a preparação de materiais porosos, mas eles são mais demorado e, em alguns casos, o tamanho de poro está limitado a apenas alguns micrômetros. Espuma-como LCEs 3D preparadas utilizando moldes de metal permitir uma carga maior de células; uma taxa de proliferação melhorada; co-cultura; e, por último mas não menos importante, uma melhor gestão de transporte de massa (ou seja, nutrientes, gases e resíduos) para garantir o desenvolvimento do tecido completo ^27. LCEs 3D-espuma como também parece melhorar o alinhamento das células; esta é mais provável em relação aos pingentes LC detecção do crescimento celular e a orientação da célula. A presença de porções LC dentro do LCE parece aumentar o alinhamento das células no que diz respeito à localização de célula dentro do andaime LCE. Células alinhar dentro das escoras do LCE, enquanto nenhuma orientação clara é observada onde as escoras unir (cruzamentos) ^27.

No geral, a plataforma de andaime célula LCE de um meio de suporte de células oferece oportunidades para afinar a morfologia elastómero e propriedades elásticas e para dirigir especificamente o alinhamento de tipos de células (individuais) para criar uma forma ordenada, o arranjos espaciaiscélulas de f semelhantes aos sistemas vivos. Para além de proporcionar uma estrutura de suporte capaz de suportar e direccionar o crescimento celular a longo prazo e a proliferação, LCEs também permitir experiências dinâmico, onde a orientação das células e as interacções podem ser modificados em tempo real.

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Protocolo

NOTA: As etapas a seguir para a preparação do tipo espuma LCE 3D utilizando o copolímero em bloco em estrela 3-braço são mostrados na Figura 1. Para a caracterização de ressonância magnética nuclear (RMN), os espectros são registados em clorofórmio deuterado _(CDCl3) à temperatura ambiente num instrumento Bruker DMX 400 MHz e internamente referenciadas picos residuais a 7,26. Transformação de Fourier espectro de infravermelho (FT-IV) são registados utilizando um Bruker Vector 33 FT-IR espectrómetro usando o modo de reflectância total atenuada. Para cada passo do seguinte protocolo, é importante usar roupas de proteção pessoal adequado (EPI).

1. Síntese de α-Cloro-ε-caprolactona (monómero) (de acordo com o Procedimento em Jerome et ai. ²⁸⁾

1. Antes de iniciar a síntese, purificar 27 g de ácido 3-cloroperbenzóico como se segue:
   1. Em 800 mL de água destilada, adicionar 1,28 g de sódiomono-hidrato monobásico de fosfato e 8,24 g de fosfato de sódio dibásico hepta-hidratado. Ajustar o pH para 7,4 (utilizando hidróxido de sódio ou ácido clorídrico) e de reserva de 30 ml desta solução; esta é a solução tampão.
   2. Utilizando um funil de separação, dissolve-se o ácido 3-cloroperbenzóico em 35 ml de éter dietílico. Lava-se a solução orgânica com 10 mL de solução tampão (preparado no passo 1.1.1.). Repetir a lavagem três vezes.
   3. Adicionar 3 g de sulfato de sódio directamente para a solução orgânica; este agente de secagem absorve a água a partir da solução orgânica.
   4. Filtra-se a solução para remover o agente de secagem. Concentra-se o filtrado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C.
2. Solubiliza-se 18,5 g de ácido 3-cloroperbenzóico purificado em 150 mL de diclorometano seco por agitação em um banho de ultra-sons; este processo normalmente leva 20 minutos. Coloque a solução dentro de um funil de separação.
3. Dentro de um dois-neck, balão de fundo redondo,dissolver 13,1 g de 2-chlorocyclohexanone em 15 mL de diclorometano anidro usando um agitador magnético sob azoto gasoso. Continue mexendo.
4. Montar o funil separador contendo uma solução de ácido 3-cloroperbenzóico (a partir do passo 1.2) para o balão de duas tubuladuras no passo 1.3. Lavar o sistema com azoto gasoso. Ajustar a abertura do funil de separação de modo a que a solução de ácido cloroperbenzoico cai gota a gota à solução 2-chlorocyclohexanone (1 gota em cada dois segundos) e continuar a agitar a mistura sob atmosfera de azoto durante 96 h.
5. Arrefece-se a mistura de reacção a -20 ° C durante 1 h para precipitar o subproduto ácido m-clorobenzóico (m -CBA).
6. Filtra-se o ácido clorobenzóico m (m -CBA) e lava-se a solução remanescente com soluções saturadas de tiossulfato de sódio, bicarbonato de sódio, e cloreto de sódio.
7. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C. Purifica-se o amarelo, viscoso pálido LiquID por destilação sob pressão reduzida a 2,3 Torr e 96 ° C.
8. Monitorizar o sucesso da stese utilizando os seguintes picos de ¹ H RMN. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, C H CLCO), 4,37-4,26 (m, 1H, C H ₂ O), 4,18-4,05 (m, 1H , C H ₂ O), e 2,06-1,58 (m, 6H, -CH ₂ -) ^{6, 27.}

2. Síntese de α-três braços da estrela de Copolímero de Bloco (SBC-αCl) por Anel A copolimerização de abertura (Sharma et al. ⁶ e Amsden et ai. ²⁹⁾

1. Antes de síntese, silanizar uma ampola de 20 ml, preenchendo-o com um (v / v) de solução a 2% de 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane em tolueno e agitação durante cerca de 24 h. Lavar com álcool isopropílico e secá-lo, colocando-o num forno a 140 ° C durante 30 min.
2. Adicionar 30,64 g de destilado ε-caprolactona, 0,5 g de α-cloro-ε-caprolactona, e 0,25 mL de glicerol para a ampola. Misturar utilizando um vortex durante 1 min.
3. Adicionar 4,90 g de D, L -lactide para a ampola e purgar com azoto. Coloque a ampola num forno a 120 ° C para fundir o D, L -lactide; este processo demora tipicamente cerca de 2 h. Misturar novamente utilizando um vortex para certificar-se de que todos os conteúdos são bem misturados e adicionar 66 uL de estanho (II), 2-etil-hexanoato de (Sn (Oct) ₂₎ para a ampola.
   NOTA: D, L -lactide vai arrefecer durante este processo e terá de ser re-aquecida no forno para derreter.
4. Misture vigorosamente uma última vez usando o vórtice e lave com nitrogênio.
5. Feche a ampola com uma tampa de borracha. Coloque uma agulha ligada a um tubo de vácuo (a câmara de vácuo é geralmente suficiente) através da rolha de borracha. Ligar o vácuo e, usando uma chama, derreter o pescoço longo do vidro, torcendo-se lentamente até que o gmoça entra em colapso sobre si mesmo. Tenha cuidado para não derreter a tampa de borracha. Uma vez que a ampola é chama-selado, colocá-lo em um banho de areia, um forno, ou apropriado elemento de aquecimento a 140 ° C durante 48 h.
6. Retire a ampola e deixe esfriar à temperatura ambiente.
7. Quebrar a ampola na marca selado e dissolve-se o líquido altamente viscoso através da adição de 10 mL de diclorometano. Transferir a solução para um funil de separação.
8. Preparar um frasco contendo 100 mL de metanol frio (arrefecido utilizando um banho de gelo / acetona seco a uma temperatura de cerca de -78 ° C). Corrigir o funil de separação (passo 2.7) na parte superior do frasco. Ajustar a abertura do funil de separação de modo a que cerca de duas gotas cair cada segundo (gota a gota).
9. Recolhe-se o precipitado branco por filtração (através de um filtro de papel) e secá-lo numa estufa de vácuo entre 50 e 60 ° C.
10. Monitorizar o sucesso da stese utilizando as seguintes ¹ H RMN e FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, Δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCH C _CH3), 4,43-4,25 (m, C H Cl), 4,24-4,12 (m, C H ₂ O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, C H ₂ O), 3,80-3,68 (m, C H C H _2), 3,09-2,64 (largo, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α- H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, H α-), e 1,77-1,25 (m, C H _2, C H _3); FT-IV (1 / λ ^[cm-1]): 2932 (s), 2869 (m), 1741 (s), 961 (s), 866, e 735 (m), ^{6, 27.}
    Nota: Para preparar um LCE 3D mais hidrófilo, preparar um copolímero de bloco linear (LBC) em vez de um SBC, seguindo o procedimento de abertura de anel de copolimerização (ROP) descrito acima.
    1. Adicionar 0,3 g de polietileno glicol (PEG), 3,15 g ε-caprolactona, 1,0 g de α-cloro-ε-caprolactona, e 5,0 g de D, L-lactido à mistura frasquinho silanizado.

3. A modificação sintética de α-Cl-Três Braço SBC para αN ₃ -três Braço SBC (SBC-αN ₃₎ (de acordo com Silva et ai. ⁶⁾

1. Em um balão de fundo redondo e sob atmosfera de azoto, dissolve-se 5 g de SBC-αCl em 30 ml de N, N-dimetilformamida'.
2. Adicionar 0,22 g de azida de sódio e deixa-se reagir durante a noite à temperatura ambiente.
   Cuidado: A azida de sódio é tóxico; usar roupas de proteção pessoal adequado (EPI).
3. Remover o N, N-dimetilformamida' sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 11 mbar e 40 ° C. Dissolve-se a mistura em 30 mL de tolueno. Centrifugar a solução três vezes a 2800 xg durante 15 min para remover o sal formado. Evapora-se o tolueno sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 77 mbar e 40 ° C.
4. Monitorizar o sucesso da substituição de azida usando ¹ H NMR e de FT-IR picos.
   NOTA: ^{Espectro de 1H RMN foi similar ao progenitor SBC-αCl, com a excepção do aparecimento de um pico a 3,90 ppm em relação ao grupo azida; FT-IV (1 / λ [cm-1]): 2928, 2108 (s, azida), 1754 (s), 1450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s), e 696 (m).}

4. Síntese de Colesterilo 5-hexinoato (LC Moiety) (De acordo com Sharma et al. ⁶ e Donaldson et al. ³⁰⁾

1. Em um balão de fundo redondo, mistura de 3 g de ácido 5-hexinóico e 130 mL de diclorometano. Arrefece-se até 0 ° C utilizando um banho de gelo.
2. Num outro balão de fundo redondo, misturar 8,28 g de N, N-diciclohexilcarbodiimida', 10,3 g de colesterol e 0,2 g de 4-dimetilaminopiridina.
3. Transferir o 5-hexinóico gota a gota uma solução de ácido para o frasco contendo a mistura de colesterol e manter a mistura final, a 0 ° C durante 1 h.
4. Deixar a mistura aquecer até à temperatura ambiente durante a noite.
5. Remover o precipitado resultante diciclohexilureia por filtração, utilizando um filtro de papel de grau 415 e descartá-lo.
6. Concentra-se o filtrado sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 850 mbar e 40 ° C. Dissolve-se o resíduo recolhido em 150 ml de hexano.
7. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 335 mbar e 40 ° C. Adicionar 350 ml de etanol ao resíduo oleoso para recolher o produto final. Lavar o sólido esbranquiçado formado com etanol e secar o produto sólido sob vácuo a 50 ° C.
8. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes ¹ H RMN e FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, H C = C), 4,70-4,58 (m, 1H, C H OCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, C H ₂ CO), 2,34 (m, 2H, _CH2-C = H), 2,31 (m, 2H, C H ₂ C H ₂ -COO-), 2,28 (s, 1H, HC = C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡CC H _2), 2,07-1,06 (m, 2H, C H _2, C H), 0,94 (s, 3H, C-CH _3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, C H ₃ C H), e 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, C H ₃ C H), 0,67 (s, 3H, C H _3). FT-IV (1 / λ ^[cm-1]): 2,830-2,990 (largo e pico forte), 2104 (m), 1695 (s), 1428 (m), 1135 (m), 999 (s), 798 (s), e 667 (s).

5. modificação sintética de α-N ₃ -três Braço SBC para ácido a-colesterilico-Três Braço SBC (SBC-αCLC) através de uma reacção Azida-alcino Huisgen Ciclo-adição ( "clique" Reaction) para obter SBC-Chol (Segundo Sharma et al. ⁶⁾

1. Em um balão de fundo redondo, dissolvem 1 equivalente molar de SBC-αN ₃ (1,5 g) em 100 mL de tetra-hidrofurano acabado de destilar (THF). Adicionar 1,2 equivalen molarest de colesterilo 5-hexinoato (1,94 g), 0,1 equivalentes molar de cobre (I) iodeto (0,06 g), e 0,1 equivalente molar de trietilamina (0,03 g). Agita-se a mistura durante a noite a 35 ° C sob azoto.
2. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 357 mbar e 40 ° C.
3. Dissolve-se a mistura residual em 80 mL de diclorometano e centrifuga-se durante 5 min a 2800 xg à temperatura ambiente para remover os materiais que não reagiram e os produtos secundários.
4. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes ¹ H RMN e FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH = C-triazole), 5,43-5,34 (m, C = CH colesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH _3), 4,68 -4,55 (m, O-CH colesterol), 4,24-4,19 (m, CH ₂ O), 4,18-4,13 (t, J = 5,0 Hz, _CH2O), 4,11-4,05 (t, J = 4,4 Hz, CH ₂ O), 2,47-2,41 (t, J = 4,9 Hz, _COCH2), 2,31-2,25 (m, _COCH2), 2,07-1,02 (m, CH ₂ , _CH3), 1,05-1,03 (s, CH _2, CH _3), 0,96-0,92 (d, J = 3,3 Hz, CH _2, CH _3), 0,91-0,87 (dd, J = 1,9 Hz, J = 1,8 Hz, CH _3), e 0,71-0,68 (s, _CH3). FT-IV (1 / λ ^[cm-1]): 3260 (s), 2920 (s), 1710 (s), 1460 (s), 1370 (s), 1240 (m), 1190 (s), 733 (s), e 668 (s).

6. Síntese de 2,2-bis (1-caprolactona-4-il) propano (Reticulador, BCP) (de acordo com Gao et al. ²⁷ e Albertsson et ai. ³¹⁾

1. Em um balão de fundo redondo, preparar uma solução contendo 10,8 g de 2-bis (4-hidroxi-ciclo-hexil) propano e 52 mL de ácido acético.
2. Prepara-se uma solução contendo 11 g de trióxido de crómio em 50 ml de ácido acético e 8 mL de água destilada. Adicionar esta solução gota a gota, à solução preparada no passo 6.1, mantendo a temperatura da mistura entre 17 e 20 ° C (por exemplo, numabanho d'água); este processo leva gota a gota 2 h. Uma vez que o processo é completa, deixar a solução a agitar durante cerca de 30 min.
3. Adicionar 50 ml de 2-propanol. Agita-se a solução durante a noite à temperatura ambiente.
4. Concentra-se a solução de cor púrpura escura sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo a 137 mbar e 40 ° C. Adicionar 300 mL de água destilada para precipitar; O precipitado deve ser leve roxo.
5. Filtrado o produto em bruto utilizando um filtro de papel de grau 415. Lavar o material sólido com ~ 250 mL de água destilada ou até o sólido se torna branco.
6. Dissolve-se o material sólido em 15 mL de benzeno a 40 ° C e deixá-lo recristalizar a 25 ° C.
7. Adicionar 8,34 g de dicetona seco dissolvido em diclorometano seco e uma solução contendo 6,0 g de ácido 3-cloroperbenzóico em 75 mL de diclorometano para o balão.
8. Refluxo a solução a 40 ° C durante 24 h.
9. Arrefece-se a mistura de reacção a -20 ° C durante 10 min para precipitar a m subproduto ácido clorobenzóico.
10. Remover o ácido m-clorobenzóico por filtração (através de um filtro de papel) e concentra-se a solução sob pressão reduzida.
11. Lavar o produto em bruto de viscose com 200 mL de 2-heptanona e secar o precipitado sob vácuo a 50 ° C durante a noite.
12. Monitorizar a síntese utilizando os seguintes ¹ H RMN e FT-IR picos. ¹ H RMN (400 MHz, _CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, C H ₂ OC = O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, C H ₂ OC = O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, C H ₂ COO), 2,04-1,93 (m, 4H, -CH ₂ CH ₂ OC = O), 1,70-1,56 (m, 4H, -CH ₂ C H ₂ COO), 1,48-1,38 (m, 2H, - C H C _{(CH3) 2),} e 0,84 (s, 6H, C H ₃ C).

7. Criação de Poroso 3D Elastomer andaime Usando qualquer diisocianato de hexametileno (HDI) ou 2,2-bis (1-caprolactona-4-il) propano (BCP) ²⁷ como Reticuladores (De acordo com Gao et ai. ²⁷⁾

1. Prepare de três braços mistura de elastómero usando 0,75 g de SBC-αCLC por adição de 0,25 mL de HDI (ou 0,45 mL de BCP) e 0,24 mL de água destilada monómero ε-caprolactona. Adicionar 60? L de Sn (Oct) _2. Se usando BCP em vez de HDI, misturar SBC-αCLC e BCP usando um vórtice e colocá-los num forno a 140 ° C até que o BCP funde e se dissolve totalmente (este passo pode levar até 2 h). Uma vez que o BCP foi dissolvido, levá-la para fora do forno e, a Sn (Oct) _2, e vortex.
2. Preparar um molde de espuma de níquel "sacrificial" cortando um pedaço de metal cm 1 x 4. Enrolá-lo a partir de uma das extremidades curtas de modo a que o rolo final é, aproximadamente, um pedaço de metal 1 x 1 cm (ver Figura 4).
3. Coloque a espuma de níquel em um frasco de vidro ou de alumínio pacote de folha e verter a mistura preparada no passo 7.1 para cobrir totalmente a espuma durante 2 min. Remover o excesso de mistura com uma pipeta de Pasteur. Deixá-lo em um dia para o outro forno a 80 ° C.
4. Descascar a folha de alumínio ou quebrar o vidro. Usando uma lâmina de barbear, barbear o elastómero em torno da espuma metica para expor o metal de níquel.
5. Prepare M de ferro (III), cloreto de 1 _(FeCl3) solução em 100 mL de água. Coloque a espuma num frasco e adicionar 70 ml de solução de _FeCl3. Agita-se durante três dias à temperatura ambiente e mudar a solução de FeCl ₃ todos os dias. Antes de cada mudança, agita-se a espuma com água de ionizada durante 0,5 h.
   NOTA: O processo de corrosão é normalmente concluído após três dias. Para assegurar que o processo de corrosão, efectue a testes de compressão tácteis até que as espumas se sentir suave. resistência espuma para ensaios de compressão tácteis indica a presença de um molde de metal residual.
6. Lavar o elastomer espuma com etanol e colocar num forno de vácuo durante a noite a 40 ° C.
7. Caracterizar os materiais por meio de microscopia electrónica de varrimento (SEM), calorimetria de varrimento diferencial (DSC), ensaios de compressão mecânicas, e a análise gravimétrica térmica (TGA) ^27.
   NOTA: Para a preparação de um LCE 3D mais hidrófilo, substituir o SBC com LBC (certificando-se de que o LBC também contém uma porção LC) seguindo as etapas descritas no passo 7.5.

8. Sementeira de Elastómero andaime com culas SH-SY5Y neuroblastoma e de cultura usando técnicas estéreis

1. Esteriliza-se o elastómero, lavando-o duas vezes com 1 mL de etanol a 70%. Realizar a irradiação UV durante 10 min e lava-se com 1 mL de etanol a 70%. Lave-o duas vezes com 1 mL de água estéril e 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Colocar os elastómeros em placas de cultura de 24 poços.
2. Preparar o meio de crescimento de células para SH-SY5Y contendo 90% Dulbecco Modified Eagle Médium Supplem (DMEM)ented com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep).
3. Após a contagem das culas utilizando um hematocytometer, preparar 1,5 x 10 ⁵ culas SH-SY5Y em suspensão em 100 uL de meio de crescimento (solução semente). Adicionar a solução em cima dos elastômeros, certificando-se para formar uma gota.
4. Incubar os elastómeros semeadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 h para promover a adesão celular. Adicionar 0,5 ml de meio de crescimento. Incubar outra vez a 37 ° C com 5% de CO _2.
5. Mudar o meio todos os outros dias após a lavagem com 1 mL de PBS.

9. imagem microscópica de Elastómero Construto

1. Fixar as células cultivadas em elastómeros com 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS durante 15 min. Lavar com 3 ml de PBS três vezes durante 5 min cada e colocar o elastómero com as células fixadas em uma placa de cultura com uma lamela em anexo.
   Cuidado: PFA é tóxico. Usar vestuário de protecção pessoal adequado (EPI).
2. Stanas amostras fixadas com 0,1% de 4' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 500 ul de PBS durante 10 minutos e lavar duas vezes com 1 ml de PBS durante 5 min.
3. Imediatamente imagem os elastómeros utilizando microscopia confocal de fluorescência com DAPI, a aquisição de pilhas de imagens que se estendem a amostra.
   NOTA: Aqui, pilhas de imagens foram adquiridas usando uma objetiva de 20X e um objetivo 60X.
4. Analisar as pilhas de imagem confocal óptica utilizando o ImageJ ^32.

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Resultados

Este relatório mostra o método de preparação de um LCE 3D poroso como um andaime para cultura de células utilizando um molde de metal de níquel. O 3D LCE obtido demonstra um complexa rede interligada canal que permite a infiltração de células fácil, bem como o transporte de massa mais adequado ^27. Verificou-se que as células são capazes de penetrar completamente a rede de canais interligados e também é capaz de alinhar dentro do LCE. Aqui, uma espuma...

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Discussão

elastómeros líquidos cristalinos têm sido recentemente estudada como andaimes de células biocompatíveis, devido à sua capacidade de resposta estímulos. Eles têm provado ser plataformas ideais como andaimes celulares. No entanto, um factor importante a ter em mente quando preparar e projetar um novo andaime LCE é a porosidade. A incorporação de sólidos lixiviáveis ²³ ou gases nem sempre resultar em porosidade homogénea ou poros totalmente interconectados. O uso de um modelo de metal ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000