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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

Resumo

A principal preocupação no transplante é alcançar tolerância específica através da indução de células reguladoras. A compreensão dos mecanismos de tolerância requer modelos confiáveis. Aqui, descrevemos modelos de tolerância ao enxerto cardíaco em ratos, induzido pelo bloqueio dos sinais costimulation ou upregulation das moléculas imunorreguladores, através da transferência de genes. Cada um desses modelos permitidos na vivo a geração de células reguladoras, tais como pilhas de T reguladoras (Tregs), células B regulamentares (Bregs) ou células mieloides regulamentares (RegMCs). Este manuscrito, descrevemos dois protocolos complementares que foram usados para identificar e definir a atividade das células reguladoras in vitro e in vivo para determinar a sua responsabilidade na indução de tolerância e manutenção. Primeiro, um ensaio supressiva em vitro permitiu a rápida identificação de células com capacidade supressiva sobre efetoras imune respostas de forma dose-dependente e pode ser usado para uma análise mais aprofundada como medição de citocinas ou citotoxicidade. Em segundo lugar, a transferência adotiva de células de um destinatário Tratado tolerante para um destinatário transplantado recentemente irradiado, destaque as propriedades de tolerogenic dessas células em respostas imunes de enxerto dirigido de controlo e/ou convertendo novas células reguladoras ( denominado tolerância infecciosa). Esses métodos não são restritos às células com marcadores fenotípicos conhecidos e podem ser estendidos para qualquer população celular. Além disso, o doador dirigido allospecificity de células reguladoras (uma meta importante no campo) podem ser avaliados usando células de doador de terceiros ou do enxerto em vitro ou na vivo. Finalmente, para determinar a capacidade de tolerogenic específicos destas células reguladoras, nós fornecemos protocolos para avaliar as respostas humoral anticorpo antidoador e a capacidade do destinatário para desenvolver respostas humorais contra antígenos conhecidos novos ou antigos. Os modelos de tolerância descrito podem ser usados para caracterizar mais células reguladoras, para identificar novos biomarcadores e imunorreguladores moléculas e são adaptáveis a outros modelos de transplante ou doenças auto-imunes em roedores ou humanos.

Introdução

Aloenxerto cardíaco em ratos é um modelo de transplante de órgão confiável para avaliar tratamentos de indução de tolerância, para decifrar os mecanismos de indução de tolerância e de manutenção e tem o potencial para induzir as células reguladoras funcionalmente competentes e dominantes. Os protocolos abaixo descrevem um totalmente incompatibilidade heterotópica cardíaca enxerto de um rato de doador de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) em um rato de destinatário Lewis 1A (LEW.1A, RT1um). Nesta combinação de enxerto, rejeição aguda ocorre rapidamente (em cerca de 7 dias) e pode ser facilmente avaliada pelo enxerto batendo medição através de palpação do abdômen. Aqui propomos três protocolos para induzir a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos. Nestes modelos, tolerância é induzida e/ou mantida por tipos de diferentes células reguladoras. Primeiro, o bloqueio de CD40-CD40L interações com um adenovírus codificação CD40Ig (AdCD40Ig) induziu a geração de CD8+ Tregs capazes de induzir tolerância quando enviaram transferidos para destinatários secundários enxertados1. Além disso, a depleção de CD8 em destinatários AdCD40Ig-Tratado gerados Bregs e RegMCs2,+ células (com anticorpos anti-CD8α). Análise profunda de CD8+ Tregs Propriedades destacou o papel fundamental de várias moléculas de imunorreguladores definido como interleucina-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando que a superexpressão de IL-34 (com um vetor de vírus adeno-associados) induzida por Tregs através de geração de RegMCs, superexpressão da FGL-2 induzida Bregs, subjacentes a complexa rede de células reguladoras.

Rejeição crônica se desenvolve lentamente e é a longo prazo, uma análise aprofundada é necessário para distinguir tolerância contra rejeição crônica. Enxerto é geralmente avaliado por infiltração celular, fibrose, espessamento da deposição de C4d vascular da parede e complemento por immunohistology7. Enquanto histologia métodos requerem o sacrifício de animais ou biópsia do enxerto, aqui nós descrevemos um método simples para avaliar diferentes características do aloenxerto tolerada: o surgimento e a função das células reguladoras e as respostas de anticorpos específicos antidoador de sangue amostra por citometria de fluxo (aqui, nós usamos a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação).

Manutenção da tolerância para o enxerto após a detenção do tratamento é geralmente associada com a indução de células reguladoras8. Nas últimas décadas, os estudos enfocaram CD4+Tregs caracteriza-se por unanimidade-los por marcadores de chave Foxp3+, CD25altae CD127–9,10,11. Da mesma forma, vários marcadores foram atribuídos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaixo, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre os anos, a expressão de GITR, CTLA4 e citocinas (IL-10, 34-TGFβ, IL, IL-35, FGL-2) foram adicionalmente associados a um Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. No entanto, populações de células reguladoras emergentes, tais como Bregs, RegMCs ou NKTregs, faltam de marcadores específicos relevantes. Com efeito, Bregs principalmente são relatados como imaturo CD24+ células, com expressão de CD27 ambígua e, por vezes, produção de IL-10, TGFβ ou granzime B22,23,24. A complexidade da linhagem mieloide célula requer uma combinação de vários marcadores para definir seu perfil de regulamentar ou proinflammatory como CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Finalmente, alguns marcadores têm sido relatados para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, mas mais estudos são necessários para fenotipicamente eles descrever27,28,29 ,30,31,32. Assim, evidências de atividade supressiva são necessários para legitimar ainda mais descrição fenotípica para a identificação de novos biomarcadores, novos mediadores imunorreguladores e alargar o âmbito de aplicação de novas terapias celulares.

Propomos dois métodos complementares para avaliar a atividade supressora de células. Primeiro, o método em vitro consiste de células supressivas com células efetoras rotulada T estimuladas pelo doador alogênico células apresentadoras (APCs) em diferentes proporções ao longo de 6 dias de cultivo, e analisando o efetor proliferação de células T que reflete a imunossupressão doador-dirigido. Células de ratos tratadas podem ser comparadas diretamente às células de ingênuo ratos e ratos enxertados não tratados para atividade supressora (ou para qualquer outra população de celular regulamentar), em uma variação da proporção de supressor: effector. Além disso, este método não requer qualquer transplante, e os resultados são obtidos dentro de 6 dias. Em segundo lugar, o método na vivo consiste em transferir as células reguladoras pretendidas de um rato Tratado para um destinatário transplantado recentemente irradiado. Enquanto as células B, células mieloides ou T células de ratos não tratados ingênua são geralmente incapazes para inibir a rejeição aguda e para prolongar a sobrevivência do enxerto após transferência adotiva, células com atividade supressora potentiated de destinatários tratados têm esses atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia induzida pela irradiação do destinatário é recomendada para permitir que as células enviaram transferidas para ser afectada pela homeostase do sangue e dominar mais facilmente as respostas imunes do anti doadores. Para ambos os métodos, a utilização em vitro de alogênico de terceiros APCs ou na vivo transferência adotiva de supressiva células em destinatários enxertados com um coração de terceiros permitem análise da especificidade antidoador. Considerando que o método na vivo requer um número substancial de células, mal representado subpopulações de células podem ser mais facilmente avaliadas para atividade supressiva em vitro33.

Respostas humorais também podem ser medidas para avaliar o estado de tolerância e o controle de respostas de anticorpos direcionados aos antígenos do doador. Com efeito, a tolerância pode ser caracterizada por ausência de resposta humoral em direção o doador mas a conservação da capacidade para os destinatários desenvolver a resposta humoral a antígenos novos e preservação da memória respostas. Em primeiro lugar, o princípio da deteção de Alo-anticorpo baseia-se no reconhecimento de células do doador por destinatários anticorpos após incubação do tipo de célula do doador com soro de um destinatário enxertado. Respostas humorais, segunda dirigidas aos antígenos exógenos podem ser avaliada seguir estimulação de destinatários tolerantes a longo prazo com Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionado com adjutor de Freund completo. A presença de anticorpos IgM e IgG específicos contra antígenos pode ser detectada dias 4 e 13, respectivamente, após a imunização, com o ensaio de imunoabsorção ligado enzima (ELISA)34. Em terceiro lugar, a preservação da memória imune respostas pode ser avaliada pela injeção de xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) em dias -7 e + 3 de transplante e hemácias coloração com destinatário soro coletado em dias + 8 e + 17 após o transplante. Todos estes métodos permitem a identificação de subtipos de imunoglobulinas usando anticorpos específicos do secundários e aquisição rápida dos resultados em menos de 1,5 h por FACS coloração ou algumas horas por ELISA.

Finalmente, esses protocolos são projetados para a caracterização de modelos de transplante e podem ser, em certa medida, aplicada aos modelos de doença auto-imune. Os princípios do método podem ser transpostos para todas as espécies.

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Protocolo

Nota: Todos os protocolos aqui tenham sido aprovados por um Comitê de ético e devem ser realizados de forma estéril.

1. geração de tolerância em um modelo de aloenxerto cardíaco em ratos

  1. Lew.1W para procedimento de aloenxerto LEW.1A
    1. Anestesiar um macho dador LEW.1W rato utilizando isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O após 5 min. lugar o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para realizar uma toracotomia (ou seja, a incisão para a espaço pleural do peito).
      1. Fixar a superior e inferior da veia cava, ligadura-los e cortá-los. Em seguida, cortar a artéria pulmonar e a aorta e salvar o enxerto no frio 0,9% NaCl.
    2. Anestesiar um 250 g masculino LEW.1A destinatário rato (de 8 a 12 semanas) utilizando isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O, depois de 5 min. Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para realizar uma laparotomia xyphopubic (ou seja, grande incisão do processo xifoide a sínfise púbica).
      1. Exteriorizar o intestino, fixar os vasos abdominais, realizar uma anastomose anastomose término-lateral (ou seja, a conexão entre o fim de um canal e a parede do outro) entre a aorta do enxerto e a aorta abdominal e entre o pulmonar artéria e veia cava abdominal e remover grampos.
    3. Suturar o plano muscular e pele e desinfectar com betadine.
    4. Injetar nalbufina (analgésico) 6 mg/kg por via subcutânea (s.c.) e oxitetraciclina (antibiótico) por via intramuscular (i.m.) e colocar o animal sob uma lâmpada de calor até que o animal desperta. Injetar a buprenorfina (opioides) (50 µ g/kg) i.m. e meloxicam (antiinflamatórios não-esteroides anti-inflamatórias) (0,3 mg/kg) s.c. o dia do transplante e um dia depois.
  2. Indução de tolerância pelo bloqueio da co-estimulação interações
    1. Siga os passos 1.1.1. a 1.1.2.
    2. Em uma área de A2 classificada da instalação de animais, diluir 2 x 1010 partículas infecciosas de AdCD40Ig (um adenovírus codificação CD40Ig, uma molécula quimérico que bloqueia as interações CD40-CD40L) em solução de lactato de Ringer para atingir um volume final de 150 µ l e injetar em 3 pontos (3 x 50 µ l) na parede ventricular do ápice do enxerto.
    3. Siga os passos de 1.1.3 para 1.1.4.
      Nota: Tratamento de AdCD40Ig pode ser associado com anti-CD8α, anti-ICOS ou anticorpo anti-CD28 injeções2,35,de36.
  3. Indução de tolerância pela superexpressão de uma proteína recombinante
    1. Diluir 1 x 1012 genoma viral do rato AAV IL34-recombinante em solução de lactato de Ringer para atingir um volume final de 100 µ l. anestesiar um rato LEW.1A 150g com isoflurano-O2 inalação e injetar por via intravenosa (i.v.) na veia do pênis.
    2. Um mês depois da injeção de AAV-IL34, realize um enxerto LEW.1W ao beneficiário de LEW.1A de acordo com o protocolo 1.1.

2. avaliação in Vitro da atividade supressora de células por reações mistas de linfócitos (MLRs)

Nota: Atividade supressora de células de ratos tolerantes tratados deve ser comparada com a população equivalente de syngeneic destinatários enxertados ou ratos de ingênuo.

  1. Isolamento de APCs alogênico: as células dendríticas plasmocitoide (pDCs)
    1. Anestesia um rato masculino de doador ingênuo LEW.1W uso de isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O, depois de 5 min. Coloque o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para executar uma esplenectomia. Remover o baço por cruza os vasos, salvar o baço em frio 1x tampão fosfato salino (PBS) e suturar o animal.
    2. Transferir o baço em um prato, retire o 1X PBS e perfundir com 5 mL de 0.2% colagenase D. Para melhorar a digestão enzimática, corte o baço em pedaços pequenos e incubar 15 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 500 µ l de 0,1 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), transferir as peças de baço em uma peneira e esmagar o baço com êmbolo de uma seringa para dissociar as células. Transferir para um tubo e lavar as células com 15 mL de 1X PBS. Centrifugar 10 min a 430 g de x. descartar o sobrenadante.
    4. Para eliminar glóbulos vermelhos e plaquetas, resuspenda o pellet de splenocyte em 10 mL de solução hipotônica e incubar 5 min à temperatura ambiente (RT). Lavar com 1X PBS e centrifugar 10 min a 190 x. g. descartar o sobrenadante.
    5. Remova fibras colágenas filtrando em um filtro de tecido 100 µm. Conte as células para ajustar a concentração de células a 5 x 107 células/mL no soro de vitela fetal 1 X PBS/2% (FCS) / 0,5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve ser entre 4 x 108 e 7 x 108 células.
    6. Enriquece para células de interesse pela seleção negativa antes de célula de triagem. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos de células T (anti-TCRαβ, clone do R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone) e células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x g . Desprezar o sobrenadante.
    7. Lavar com grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA. Usar 3,5 µ l grânulos/106 splenocytes, lave adicionando 30ml 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA, lugar para 1 min sobre o ímã e descartar o sobrenadante. Repita duas vezes. Resuspenda as contas em 10 volumes de 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA (por exemplo, 35 grânulos µ l é diluída em 350 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA).
    8. Remover células indesejáveis misturando os splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes enriquecido deve variar entre 5 x 107 e 9 x 107.
    9. Manchar as células usando anticorpos etiquetados para classificar mais de pDCs: excluir o restante nas células T (anti-TCRαβ, clone do R7/3) ou B (anti-CD45RA, OX33 clone) e classificar CD4+ (anti-CD4, clone OX35) CD45R+ células (anti-CD45R, His24 clone). Grânulos de rótulo com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
    10. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm, por retenção na DAPI––de TCR CD45RA–CD4+CD45R+ , como mostrado na Figura 1.
  2. Isolamento de células efetoras T de respondente (CD4 + CD25 pilhas de T – )
    1. Colher o baço de um rato LEW.1A não tratados não enxertadas ingênuo e salve-o no frio 1 X PBS.
    2. Transferir o baço em uma peneira colocada em um prato e adicionar 10 mL de 1X PBS. Esmaga o baço com êmbolo de uma seringa para dissociar as células. Transferir as células para um tubo de 50 mL, lavar com 1X PBS e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
    3. Para eliminar glóbulos vermelhos e plaquetas, resuspenda o pellet de splenocyte em 10 mL solução hipotônica durante 5 min à RT, depois lave em 1 X PBS e centrifugar 10 min x 190 g. descartar o sobrenadante.
    4. Retire as fibras de colágeno filtrando em um filtro de tecido 100 µm. Conte as células para ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve ser entre 5 x 108 células e 3 x 108 .
    5. Enriquece as células de interesse antes de classificação. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos para células CD8 (anti-CD8α, OX8 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone), células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), células de delta T gama (anti-TCRγδ, V65 clone). Em seguida, lave com PBS/2% X 1 FCS/0.5 mM EDTA e centrifugação 10 min a 430 g. x descartar o sobrenadante.
      Nota: Para classificar natural CD8 + Tregs de ingênuo ratos ao mesmo tempo como CD4+ células efetoras T, não adicione anti-CD8α Ab durante a prostração.
    6. Lave os grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
    7. Remover as células indesejáveis misturando splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      Nota: O número de splenocytes deve variar entre 5 x 107 e 8 x 107 células.
    8. Acrescente os anticorpos etiquetados para tipo CD4+CD25 pilhas de T– : anti-TCRαβ (clone do R7/3), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD25 (clone de OX39) e incubar 15 min a 4 ° C. Para classificar simultaneamente CD8 +CD45RCbaixo Tregs, adicionar anti-CD45RC Ab (OX22 clone). Etiqueta de grânulos com cada Ab para montar uma matriz de compensação para posterior processamento na citometria de fluxo. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
    9. Ressuspender as células a 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na TCR DAPI –+CD4+CD25– células, como células de respondente (e se necessário TCR DAPI –+CD4–CD45RCbaixa como CD8+ Tregs células supressivas) conforme mostrado na Figura 2.
  3. Isolamento de células supressivas
    Nota: Dividir o baço em duas alíquotas: classificar um em células B, células mieloides e as células NK e o outro no CD4+ e CD8 + CD45RCbaixo T células, para avaliar sua função supressora.
    Nota: Para transferência de células adotivo, salve 1 x 108 splenocytes para servir como o controlo positivo de tolerância por transferência adoptiva, se necessário.
    1. Classificação de células B, células mieloides e células NK
      1. Segui o protocolo 2.1.1 para 2.1.5.
      2. Incubar 15 minutos a 4 ° C com 2 µ g/mL células T específicas unlabeled anticorpos (anti-TCRαβ, clone do R7/3 e anti-TCRγδ, V65 clone), lave com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
      3. Lavar com grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
      4. Misture os splenocytes com os grânulos magnéticos para remover células indesejáveis e incubar durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      5. Acrescente os anticorpos etiquetados para os splenocytes para classificar as células com atividade supressora suspeita como células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), células B (anti-CD45RA, OX33 clone) ou células NK (anti-CD161, 3.2.3 clone). Rotule os grânulos com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
      6. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um filtro de tecido 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na DAPI–CD11b/c+ para células mieloides, CD45RA+ para as células B e CD161+ para as células NK, como mostrado na Figura 3.
    2. Classificação de CD4 + e CD8 + CD45RC células de baixa T
      1. Segui o protocolo 2.2.1 a 2.2.4.
      2. Para seleção negativa em uma coluna magnética, incubar as células 15 min a 4 ° C com 2 µ g/mL purificada de anticorpos específicos para células B (anti-CD45RA, OX33 clone), células NK (anti CD161, 3.2.3 clone), células mieloides (anti-CD11b/c, OX42 clone), gama delta T células ( anti-TCRγδ, V65 clone), lave-os com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e centrifugar 10 min a 430 x. g. descartar o sobrenadante.
      3. Lave os grânulos magnéticos 3 vezes com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA conforme descrito na etapa 2.1.7.
      4. Remover as células indesejáveis misturando os splenocytes com os grânulos magnéticos durante 10 minutos a 4 ° C, sob agitação, em seguida, colocar o tubo sobre o ímã para 1 min e transferir o sobrenadante para um tubo novo. Repita duas vezes. Contar as células e ajustar a concentração de células 5 x 107 células/ml em 1 PBS/2% X FCS/0.5 mM EDTA.
      5. Acrescente os anticorpos etiquetados para as células para classificar Tregs: anti-TCRαβ (clone do R7/3), anti-CD4 (OX35 clone), anti-CD45RC (OX22 clone). Rotule os grânulos com cada Ab para estabelecer uma matriz de compensação na FACS. Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA.
      6. Ressuspender as células em uma concentração de 5 x 107 células/mL, filtro em um tecido de 60 µm e rotular as células mortas, adicionando DAPI em uma concentração final de 0,1 µ g/mL. Classificar as células com um classificador de pilha de bocal de 70 µm por retenção na DAPI–TCR+CD4 CD45RCbaixa como CD4++Tregs e DAPI–TCR+CD4–CD45RC baixa como CD8+Tregs ( Figura 4).
        Nota: O anti-CD8α Ab (clone OX8) pode ser usado em vez do anti-CD4 Ab se as células T são discriminadas de CD4+não-T células através da marcação de anti-TCR. Um excesso de CD4+Tregs devem ser classificados em antecipação de morte celular devido a rotulagem de tintura de proliferação celular (CPD).
  4. Carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE) rotulagem das células do Respondente para medir a proliferação
    1. Após a célula de respondente classificação, lave duas vezes as células com 1X PBS.
    2. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 107 células/mL de 1X PBS e incubar com 0,5 µM CFSE durante 5 min à RT no escuro. Pare a reação adicionando FCS em 1.5 X o volume e centrifugar 10 min a 430 x g a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
    3. Lave duas vezes as células com meio completo e contar as células.
      Nota: Espere 30% de morte de células neste passo.
  5. CPD rotulagem de CD4 + Tregs para ensaio supressivo em CD4 + células efetoras
    Nota: Este passo é necessário para discriminar CD4 CFSE–+Tregs do Respondente proliferação de CFSE– CD4+células T no dia 6 de coculture por retenção de células CPD– .
    1. Depois de CD4+ Tregs célula classificação, lavar duas vezes as células com 1X PBS.
    2. Ressuspender as células em uma concentração de 1 x 107 células/mL de 1X PBS e incubar com 10 µM de CPD V450 por 20 min no RT no escuro.
    3. Lave duas vezes as células com meio completo e contar as células.
      Nota: Espere 30% de morte de células neste passo.
  6. Conselhos para coculture
    1. Usar cultura no médio compreendendo: RPMI 1640 meio suplementado com beta-mercaptoetanol (5 x 10-5 M), penicilina (100 U/mL), estreptomicina (0,1 mg/mL), piruvato de sódio (1 mM), glutamina (2 mM), tampão HEPES (1 mM), não aminoácidos essenciais (1x), (FCS 10%).
    2. Células de cultura em U de 96 poços de fundo placas.
    3. Adicionar células na seguinte ordem: células supressivas, Respondente células e células alogénicas.
    4. Manter constante o número de células T de respondente e APCs alogênico e testar um número de série de Tregs. Por exemplo, o rácio 4:4:1, 5 x 104 células supressiva, 5 x 104 células de respondente e 1,25 x 104 células alogénicas e proporção 4:2:1, 2,5 x 104 células supressiva, 5 x 104 células de respondente e 1,25 x 104 alogênico células.
    5. Manter a proporção de 5 x 104 Respondente células por meio de 200 µ l/poço.
    6. Para controles, incluem alguns poços com células de respondente T sem APCs alogênico (controle negativo) e Respondente T células com APCs alogênico sem células reguladoras (controle positivo) para CFSE gating no dia 6 (consulte a etapa 2.7.6.).
  7. FACS manchando e análise após 6 dias de coculture
    Nota: A proliferação de células efetoras pode ser avaliada em vários pontos do tempo. Observe que a proliferação é exponencial: com o aumento da divisão celular, mais diferenças entre as condições supressivas e controlo negativo podem ser observadas.
    1. Transferir as células desde o U-96 poços placas de fundo para 96 poços V placas de fundo e centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    2. Salve o sobrenadante em um novo prato a-20 ° C para medir os níveis de citocinas, se necessário.
    3. Lavar as células com 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA por bem e centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C.
    4. Acrescente os anticorpos para as células à mais gate em células de respondente T: anti-TCRab (clone do R7/3) e anti-CD4 (OX35 clone). Incubar 15 minutos a 4 ° C e lavar duas vezes com 200 µ l 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA por bem. Desprezar o sobrenadante.
    5. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de 1X PBS e ler a placa com um analisador de FACS.
    6. Analisar o perfil CFSE pelo gating na DAPI negativo (células vivas) CPD negativo (não-CD4+Tregs) TCR+CD4+ células. Respondente unstimulated células têm máximo brilho CFSE como mostrado na Figura 5 histograma de esquerda inferior. Na presença de células alogénicas APCs, as células de respondente tem proliferação de máxima e mínima CFSE brilho (inferior, médio). Na presença de células alogénicas APCs e células reguladoras, as células efetoras tem proliferação média e brilho CFSE (canto inferior direito).

3. avaliação in Vivo da atividade supressora células por transferência adotiva de célula em um coração transplantado destinatário

Nota: Irradiação é necessário para eliminar as células hospedeiras e favorecem a proliferação e a enxertia de célula do doador.

  1. Irradiar os destinatários de enxerto cedo no dia antes do enxerto para a condição do destinatário. ANESTHETIZE ratos com injeção im. de xilazina (8 mg/kg)-cetamina (80 mg/kg) e irradiar-lhes na dose de 4.5 Gy com raios-X.
  2. Segui o protocolo 2.3 para isolar as células de interesse.
    Nota: Guarde 1 x 108 splenocytes para servir como um controle positivo de tolerância por transferência adoptiva, se necessário.
  3. 12 h após a irradiação (um dia antes do enxerto, à noite), anestesiar os ratos por inalação de 4% de isoflurano-O2 e infundir as células (5.0 x 107 T de células, 3,0 x 10 células7 B, 3.0 x 107 células mieloides ou 1,50 x 108 splenocytes como controlo positivo de tolerância por transferência adoptiva) soro na veia do pênis.
    Nota: O número de células necessárias para tolerância por transferência adotiva depende da atividade supressora das células.
  4. No dia seguinte, segui o protocolo 1.1 para executar o aloenxerto. Siga a evolução do enxerto por palpação do abdômen.

4. o doador pesquisa de anticorpos específicos

Nota: IgG respostas direcionadas para o doador do enxerto são medidas por incubação das células do doador com o soro do receptor. Subtrai o fundo induzido pela coloração direta das células B LEW.1W incubando-se as células com syngeneic LEW.1W de soro.

  1. Colheita de sangue de ratos e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salve o soro. Soro pode ser armazenado a-20 ° C ou usado imediatamente. Desativar o complemento no sera incubando durante 30 min a 56 ° C.
  2. Colher o baço de rato LEW.1W um doador e salve-o no frio 1 X PBS. Siga os passos 2.2.1. a 2.2.4. Adicione 2 x 105 células/poço em uma placa de fundo V 96 poços. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante.
  3. Diluir os soros em série de 1/10 a 1/270 em 1X PBS (4 diluições/amostra). Incube as celulas para 1 h a 4 ° C, com 25 µ l de soro diluído/poço. Antecipe o número de doadores específicos IgG subtipos (IgG IgG1, IgG2a, IgG2b) respostas imunes para analisar por amostra (subtipos de IgG de diluições x 4 1 soro x 4). Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
  4. Incube as celulas com cada subtipo de IgG antirato rato Ab fluorocromo-rotulado por 30 min a 4 ° C, um subtipo/bem.
    Nota: Se marcado fluorocromo anti-rato Ig Ab está disponível, é possível usar o subtipo de IgG antirato rato sem rótulo purificada Ab e um fluorocromo-rotulado secundário anti-rato AB. dependendo no citômetro de configuração e fluorochromes disponíveis vários subtipos de IgG antiratos podem ser testados em um poço com configurações apropriadas.
  5. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA duas vezes e descartar o sobrenadante.
  6. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de PBS e ler a placa com um analisador de FACS.
  7. Leia a intensidade média de fluorescência (IFM) do subtipo de IgG de anti-rato Ab marcado com fluorocromo em todas as células DAPI– . Subtrair a IMF obtida com soro LEW.1A ingênua sobre as células LEW.1W (coloração de fundo, no canto inferior esquerdo) de IFM obtido com o sera de cada destinatário nas células LEW.1W na diluição correspondente (inferior médio para destinatários rejeitar não tratados que Exibir máxima das IFM e inferior direito para tratados destinatários tolerantes que exibem IFM intermediária) (Figura 6).

5. avaliação das respostas Humoral a antígenos exógenos (Naive e memória)

Nota: Soro de ratos antes de transplante, tratamento e imunização deve ser usado como controles negativos de respostas humorais. Caso contrário, podem ser usados não-imunizadas ingênuo ratos. Soro de destinatários imunocompetentes, ou seja, transplantados destinatários exoantigen-imunizados e rejeição, são usados como controles positivos de respostas humorais.

  1. Capacidade de desenvolver resposta humoral para um novo antígeno (Figura 7)
    Nota: Este método é uma quantificação relativa de respostas humorais como não inclui um padrão. Seria possível uma quantificação absoluta do Ig, adicionando uma série de diluições de rato IgG ou IgM anti-KLH Ab com concentração conhecida na etapa 5.1.6.
    1. Emulsionar a 50 µ g de KLH em 200 µ l de adjutor de Freund completo e injetar na cauda dos destinatários long-sobrevivendo/tolerante, controle destinatários rejeitar não tratados ou ingênuo ratos como controle positivo de respostas humorais.
    2. Colheita de amostras de sangue cada 4 e 13 dias após a imunização e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C. Salve a fase superior que é o soro. Colha o soro de ratos não-imunizados para um controlo negativo. Soro pode ser congelado a-20 ° C até o ensaio de ELISA.
    3. Revestimento de placas de ELISA (fundo plano) com 50 µ l/poço KLH diluído a 10 µ g/mL de 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Certifique-se que a solução de revestimento abrange todos os poços.
    4. Remova o excesso KLH não revestido por lavagem. Para lavar, adicione 150 µ l/poço de tampão de lavagem (1X PBS contendo 0,1% Tween) e flick.
    5. Vinculação de bloco inespecífica de Ig do destinatário incubando durante 1 h a 37 ° C com 100 µ l/poço de tampão de lavagem, contendo 10% FCS. Lave uma vez.
    6. Diluir o destinatário sera em tampão de lavagem a partir 1/40 a 1/512 em série, adicionar 50 µ l/poço em duplicatas de diluição serial à placa revestida e incubar durante 2 h a 37 ° C. Manter alguns poços livres de soro para um controlo negativo. Lave duas vezes.
    7. Adicionar 50 µ l de 1 µ g/mL de conjugado biotina anti-rato IgM Ab em poços contendo o soro colhido no dia 4, em recipientes ou 50 µ l de conjugado biotina de anti-rato IgG em poços contendo o soro colhido no dia 13 e incubar 1 h a 37 ° C. Lave duas vezes.
    8. Adicionar 50 µ l/poço de estreptavidina conjugado HRP a 1 µ g/mL por 45 min a 37 ° C. Lave 3 vezes.
    9. Adicionar 50 µ l de 3, 3 ', 5, 5 '-tetrametilbenzidina (TMB) substrato para < 30 min em RT e parar a reação com 25 µ l de ácido sulfúrico de 2m quando positivo controles estão saturados.
    10. Ler a absorbância em 405 nm. Compare a densidade óptica obtida com o soro do destinatário para aquele obtido com o soro de controlo do rato de ingênuo.
  2. Avaliação da capacidade de resposta humoral da memória (Figura 8)
    1. 7 dias antes do transplante, injete soro 109 de hemácias xenogénicas diluído em 800 µ l de 1X PBS em ratos o ingênuo. Glóbulos vermelhos podem ser de ovelha, cavalo ou qualquer outra espécie.
    2. Realizar o transplante e administrar o tratamento tolerogenic.
    3. 3 dias após o enxerto, injete novamente i.v.109 RBC diluído em 800 µ l de 1X PBS nos destinatários de enxerto e ratos não enxertadas.
    4. Dias de sangue amostras 5 e 14 da colheita após a segunda imunização e centrifugar 15 min a 1.200 x g a 4 ° C para recuperar a fase superior de soro. Soro pode ser armazenado a-20 ° C ou usado imediatamente. Inativar o complemento em soros de rato por Incubar 30 min a 56 ° C antes do uso.
    5. Adicione 2 x 105 RBC/bem de uma placa de fundo V 96 poços. Centrifugar 1 min a 1.200 x g a 4 ° C e descartar o sobrenadante cuidadosamente por aspiração.
    6. Serialmente diluir os soros 2 dobras de 1/10 a 1/1280 em 1X PBS (8 diluições/amostra). Incube as celulas para 1 h a 4 ° C, com 25 µ l de soro diluído/poço. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA e descartar o sobrenadante.
    7. Incube as células com o RBC espécie-adsorvido anti-rato IgG ou IgM subtipos rotulados com fluorocromo por 30 min a 4 ° C, um subtipo/bem. Avaliar o rato IgM e IgG anti-RBC no soro colhido 5 e 14 dias após a imunização, respectivamente. Lavar as células com 1 X PBS/2% FCS/0.5 mM EDTA duas vezes e descartar o sobrenadante.
      Nota: Se o fluorocromo-rotulado anti-rato Ig Ab não está disponível, é possível usar o subtipo de IgG antirato rato sem rótulo purificada Ab e um fluorocromo-rotulado secundário anti-rato Ab.
    8. Adicione 100 µ l de DAPI diluído a 0,1 µ g/mL de 1X PBS e analisar as células com um analisador de FACS.
    9. Representam o IFM em função da diluição para cada grupo.

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Resultados

A avaliação da atividade supressora seguindo a classificação da APCs (Figura 1), células do Respondente e Tregs simultaneamente (Figura 2), ou individualmente (Figura 4), e qualquer outras putativos regulamentar as células (Figura 3), pode ser feito na vivo por injecção directa das células reguladoras e em vitro por medida do brilho CFSE (

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Discussão

Transferência adotiva de splenocytes total para um destinatário recentemente transplantada é uma maneira eficiente para detectar a presença de células reguladoras induzido ou potencializadas por um tratamento. Linfopenia transitória induzida por irradiação de anfitrião promove a sobrevivência da pilha após a transferência e o estabelecimento da tolerância. Além disso, a irradiação sub-letais deixa tempo para células com propriedades tolerogenic para converter para novas células reguladoras durante recon...

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Divulgações

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado no contexto do projeto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que é parte do programa de governo francês "Investissements d'Avenir" gerenciado pela ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e pelo projeto IHU-Cesti financiado também pelo " Programa de governo francês investissements d'Avenir", gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
animals
LEW.1W and LEW.1A ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
BN third party donor ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
namecompanycatalogue numbercomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
anti-TCRabHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KR7/3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX39 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX8 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RAHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX33 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K3.2.3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/cHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX42 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgdHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KV65 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RCHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX22 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX35 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
anti-rat IgG1Serotec#MCA 194
anti-rat IgG2aSerotec#MCA 278
anti-rat IgG2bSerotec#MCA 195
anti-rat IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptavidin HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc, USAPhosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
TMB substrate reagent kitBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kitThermo Fisher Scientific Inc, USA#C34554
RPMI 1640 medium 1XThermo Fisher Scientific Inc, USA#31870-025
penicilline streptomycineThermo Fisher Scientific Inc, USA#15140-122
Hepes BufferThermo Fisher Scientific Inc, USA#15630-056
non essential amino acidsThermo Fisher Scientific Inc, USA#11140-035
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta mercaptoethanolSigma, Saint-Louis, USA#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 CellThermo Fisher Scientific Inc, USA#65-0842-85
GlutamineSigma, Saint-Louis, USA#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc, USA#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Germany#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, USA#E5134
NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineRefer to the institutional guidelines
IsofluraneRefer to the institutional guidelines
NaplbuphineRefer to the institutional guidelines
TerramycineRefer to the institutional guidelines
BuprenorphineRefer to the institutional guidelines
MeloxicamRefer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
RompunRefer to the institutional guidelines
Ringer lactateRefer to the institutional guidelines
KetamineRefer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solutionDilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase DDilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
namecompanycatalog numbercomments
equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sieve
Corning plastic culture dishesVWR, Pessac#391-0439
100µm and 60µm tissue filtersSefar NITEX, Heiden, Switzerland#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning#353077
96 wells V bottom plates for FACS stainingThermoScientifique, Danemark#249570
96 wells flat bottom ELISA platesNunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Tecan, SwitzerlandSPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiatorLincolshire, EnglandFaxitron CP160
solar agitator
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnetThermo Fisher Scientific Inc, USA12302D

Referências

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