Os métodos in vitro para Comparando meta vinculativa e CDC indução Entre anticorpos terapêuticos: Aplicações em Análise Biosimilarity

Resumo

Este protocolo descreve a comparação in vitro de duas características funcionais chave de rituximab: ligação ao alvo e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) de indução. Os métodos foram utilizados para uma comparação lado-a-lado entre o rituximab referência e um biossimilar rituximab. Estes ensaios podem ser empregues durante o desenvolvimento biológico similar, ou como um controlo de qualidade na sua produção.

Resumo

Os anticorpos monoclonais (mAbs) terapêuticas são relevantes para o tratamento de diversas patologias, incluindo cancros. O desenvolvimento de mAbs biossimilares pelas empresas farmacêuticas é uma oportunidade de mercado, mas também é uma estratégia para aumentar a acessibilidade de drogas e reduzir os custos associados de terapia. Os protocolos detalhados aqui descrever a avaliação da ligação ao alvo e a indução por CDC rituximab em células Daudi. Estas duas funções requerem diferentes regiões estruturais do anticorpo e são relevantes para o efeito clínico induzido pelo rituximab. Os protocolos permitem a comparação lado-a-lado de uma rituximab referência e um biossimilar rituximab comercializado. Os produtos avaliados apresentaram diferenças tanto na ligação ao alvo e indução CDC, sugerindo que existem diferenças físico-químicas subjacentes e destacando a necessidade de analisar o impacto de tais diferenças no ambiente clínico. Os métodos aqui apresentados constituem simples e barato in vitro </ Em> para a avaliação da atividade dos biossimilares de rituximab. Assim, podem ser úteis durante o desenvolvimento biossimilar, bem como para o controle de qualidade na produção biosimilar. Além disso, os métodos apresentados podem ser extrapolados para outros mAb terapêuticos.

Introdução

Os anticorpos terapêuticos são anticorpos monoclonais recombinantes (mAbs) desenvolvidos para o tratamento de diferentes patologias, incluindo cancros, doenças autoimunes e crónicas, distúrbios neurológicos e outros ¹ . Atualmente, a FDA concedeu a aprovação de mais de 40 mAbs terapêuticos, e mais se espera que cheguem ao mercado nos anos seguintes.

Rituximab é um anticorpo IgG1 monoclonal quimérico de alta afinidade aprovado para o tratamento de linfoma não Hodgkin de células B CD20 ⁺ (NHL), LNH folicular CD20 ⁺ , leucemia linfocítica crónica e artrite reumatóide ^{2 , 3} . O reconhecimento de CD20, que é sobre-expresso em células B, pelo rituximab induz apoptose; Ativação do complemento; E citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ³ . As patentes desta droga expiraram na Europa e nos EUA em 2013 e 2016, Respectivamente. Assim, as empresas farmacêuticas em todo o mundo estão desenvolvendo rituximab biosimilares. Como em qualquer outro medicamento para consumo humano, biosimilares requerem aprovação de agências reguladoras. As diretrizes internacionais indicam que, para os mAbs, a biosimilaridade deve ser demonstrada através da comparação das características físico-químicas, farmacocinéticas, eficácia e segurança dos produtos novos e de referência ⁴ .

Consequentemente, as metodologias utilizadas nestas comparações devem avaliar as características estruturais e funcionais dos mAb, especialmente aqueles com relevância clínica. Para este fim, os ensaios in vitro mostram várias vantagens em relação às experiências in vivo (revisto em Chapman et al. ) ⁵ : i) os estudos in vitro são mais sensíveis às diferenças entre o biosimilar proposto eo produto de referência; Ii) estudos in vivo devem ser realizados em espécies relevantes, o que para muitos mAbs éprimatas não-humanos; e iii) uma vez que o mecanismo de acção, a toxicologia pré-clínicos, e os efeitos clínicos do produto de referência são bem conhecidas, em estudos in vivo com biosimilars pode não fornecer informação útil adicional. Assim, a orientação da União Europeia para biosimilares permite que os candidatos a entrar ensaios clínicos com base em robusta dados in vitro sozinho ^6.

Aqui, apresentamos dois ensaios rápidos, econômicos e simples que avaliam a atividade biológica do rituximab usando células cultivadas CD20 ^+. Estes ensaios podem ser incluídos como parte do exercício de comparabilidade para os candidatos biossimilares rituximab.

Protocolo

1. Avaliação da ligação alvo por citometria de fluxo

1. Preparação de materiais biológicos e reagentes
   1. Preparar 500 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino inactivado pelo calor (H-IFBS).
   2. Cultura Daudi Burkitt Linfoma (Daudi) células e Daudi GFP ⁺ células utilizando RPMI e 75 cm ² cultura frascos. Manter as culturas a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2 até atingir 6 - 9 x 10 ⁵ células / mL.
   3. Fazer 50 mL de tampão de coloração diluindo 1/100 H-IFBS em PBS; Este tampão é estável a 2-8 ° C durante pelo menos um mês.
   4. Preparar as soluções de teste para os mAbs biosimilares e de referência. Faça dez diluições em série 1: 2 (500 μL cada) em tampão de coloração, a partir de 5 μg / mL.
   5. Utilizar tampão de coloração para diluir a IgG humana (controlo do isotipo) para 5 μg / mL e IgG anti-humano de rato PE-Cy5 (anticorpo secundário)centração sugerido pelo fabricante.
   6. Prepare a 4% de paraformaldeído em PBS (tampão de fixação).
2. vinculativo alvo
   1. Recolhe-se o Daudi e suspensões de células de Daudi GFP ⁺ a partir dos frascos de cultura de 75 cm ² e transferi-los para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
   2. Lavam-se as células por adição de 5 mL de PBS e centrifugação da suspensão de células a 400 xg durante 5 min.
   3. Ressuspender as células em PBS e realizar uma contagem de células e análise de viabilidade com tripano azul. Use culturas com níveis de viabilidade celular ≥ 95% para a análise.
   4. Dilui-se a suspensão de células de 4 x 10 ⁶ culas / ml com tampão de coloração frio.
   5. Em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 50 uL da suspensão de células a 100 ul de diferentes concentrações de ensaio de referência ou o mAb biológicos similares. Incluem repetições para cada condição experimental.
   6. Preparar tubos adicionais para oControlo de isotipo (IgG1 humana em vez de rituximab) e controlo negativo (anticorpo secund�io sem anticorpo prim�io).
   7. Incubar a 4 ° C durante 20 - 30 min.
   8. Lavar as células por adição de 1 mL de PBS e centrifugar a suspensão celular a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar o sobrenadante.
   9. Suspender as células em 100 μL do anticorpo secundário e incubar durante 20-30 min a 4 ° C, protegido da luz.
   10. Lavar as células duas vezes com PBS e suspendê-las em 200 μL de tampão de fixação.
   11. Analisar as células em um citómetro de fluxo.
       NOTA: O sinal permanece estável durante vários dias se as amostras forem armazenadas a 4 ° C e protegidas da luz.
3. Aquisição de dados
   1. Abra duas parcelas de pontos em uma planilha do software de operação do citómetro de fluxo. Defina o FSC-A versus FSC-H no primeiro eo FSC-A versus SSA-A no segundo. Abra um histograma para o canal PE-Cy5.
   2. No gráfico FSC-A versus FSC-H, faça um portão (R1) seleccionando eventos singuletos ( Figura 1A ).
   3. Defina a população R1 no gráfico de pontos FSC-A versus SSA-A e, em seguida, faça um novo gate (R2) selecionando células-alvo ( Figura 1B ). Defina a população R2 no histograma de intensidade PE-Cy5 para visualizar a distribuição de freqüência das células.
   4. Ajustar o limite inferior de intensidade de fluorescência (FI) para o canal PE-Cy5 usando o controle negativo e isotipo ( Figura 1C ).
   5. Adquirir 10.000 eventos dentro de R2 da amostra com a maior concentração do produto de referência. FI dessa amostra deve ser a mais alta esperada ( Figura 1C ).
   6. Adquirir o resto das amostras.
   7. Para cada amostra, obter a intensidade de fluorescência mediana (MFI) no canal PE-Cy5.
   8. Para amostras com o mAb de referência ou biossimilar, calcule a diferença entre a MFI da amostra e a do controlo do isotipo (ΔMFI).

2. Avaliação dos CDC

1. Preparação de materiais biológicos e reagentes
   1. Preparar o meio de cultura celular e cultivar células Daudi e Daudi GFP ⁺ como descrito acima (passos 1.1.1 - 1.1.2).
      NOTA: Adicionalmente, o ensaio CDC requer RPMI sem soro.
   2. Diluir o complemento de soro humano normal (NHSC) 1: 2 com RPMI isento de soro. Preparar 2,5 mL.
   3. Preparar 1 mL de NHSC inactivado pelo calor (30 min / 56 ° C) diluído a 1: 2 com RPMI.
   4. Preparar conjuntos de soluções de testes para a referência e mAbs biossimilares em RPMI sem soro. Fazer dez diluições (200 μL cada) de 1 a 0,025 μg / mL.
2. Ensaio de CDC
   1. Recolher as células Daudi e Daudi GFP ⁺ das culturas e quantificar a viabilidade celular (ver passos 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Preparar uma suspensão celular com 4 x 10 ⁵ células / mL em RPMI sem soro.
   3. Adicionar50 μL de suspensão celular a 50 μL de cada concentração de ensaio de mAb biosimilar ou de referência em microplacas de 96 poços com fundo cónico (V). Incluir réplicas para cada condição experimental.
   4. Preparar poços adicionais para o controlo negativo ( isto é, sem mAb), controlo de morte basal ( isto é, NHSC inactivado pelo calor na presença de mAb) e controlo positivo de coloração ( ie, células expostas a 50 μL de EtOH a 70%).
   5. Incubar as células durante 20-30 min a 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2.
   6. Adicionar 50 μL de NHSC (diluído 1: 2) a cada poço e incubar as células opsonizadas durante 2,5 ha 37 ° C numa atmosfera humidificada a 5% de CO2. Use NHSC inativado pelo calor nos poços basais de controle da morte.
   7. Centrifugar a 400 xg durante 5 min a 10 ° C. Descartar o sobrenadante.
   8. Lavar as células por adição de 150 μL de PBS e centrifugar a suspensão celular durante 5 min a 400 xg e 10 ° C. DiScard o sobrenadante.
   9. Mancha as amostras com 7-aminoactinomicina (7-AAD), como descrito anteriormente ^{7 , 8} .
   10. Analisar as células em um citómetro de fluxo no mesmo dia.
3. Aquisição de dados
   1. Abra duas parcelas de pontos em uma planilha do software de operação do citómetro de fluxo. Defina essas parcelas como nas etapas 1.3.1 - 1.3.3 ( Figura 2A-B ). Criar um terceiro enredo que é um dot-plot para GFP versus 7-AAD na população R2.
   2. Definir os limites FI adequados utilizando células Daudi, células Daudi GFP ⁺ e controlo positivo de morte ( Figura 2C ).
   3. Para cada amostra, medir a percentagem de células alvo 7-AAD ⁺ . Adquirir pelo menos 5.000 eventos do R2.
   4. Calcular a citotoxicidade específica induzida por mAb subtraindo a percentagem de 7-AAD ⁺ no controlo de morte basal a partir da percentagem encontrada em amostras com diferentesent concentrações de mAb (Figura 2D).

3. Análise Biosimilarity

1. Introduzir os valores de concentração e de resposta em um programa gráfico.
2. Gerar gráficos e calcular regressões não-lineares com as seguintes considerações: i) utilizar a transformação logarítmica da concentração de mAb como "X"; ii) utilizar o modelo matemático inclinação variável (Y = resposta mínima + (resposta máxima - resposta mínimo) / 1 + 10 ^ ((LogEc ₅₀ -X) * Colina declive)); e iii) restringir os valores inferiores a zero, uma vez que a resposta basal foi subtraa.
   Nota: As curvas com uma forma sigmoidal simétrica são esperadas.
3. Comparar os dois ataques não-lineares com um ajuste global, usando um teste-F (programas de software muitos gráficos incluir esse recurso).
   NOTA: Esses testes estabelecer como a hipótese nula de que a resposta máxima, LogEc _50, eo declive de Hill são as mesmas para os dois conjuntos de dados, o que corresponde aQuestão biológica a ser abordada.

Resultados

Utilizando os protocolos descritos acima, a ligação de alvo e a indução de CDC do rituximab de referência foram comparadas em paralelo com as de um rituximab biosimilar produzido e comercialmente disponível na Ásia.

Em c�ulas de Daudi, ambos mAbs ligaram CD20 de uma forma dependente da concentra�o ( Figura 1D ). As regressões não-lineares dos dados de ligação mostraram um r ² de...

Discussão

A expiração da patente de um mAb terapêutico está a promover o desenvolvimento de biosimilares. Assim, existe a necessidade de métodos simples que possam identificar diferenças nas actividades clinicamente relevantes destes produtos. Utilizaram-se células cultivadas com CD20 ⁺ para a avaliação de duas características funcionais chave do rituximab: ligação ao alvo e indução de CDC. A actividade anterior requer o reconhecimento de CD20 pela região Fab do mAb, enquanto a última depende principalm...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.