RNA pequeno Transfecção em células primárias Th17 humano por Next Generation electroporação

Resumo

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Resumo

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introdução

As células T CD4 ⁺ são orquestradoras cruciais da resposta imunitária adaptativa. As células T CD4 ⁺ naive são capazes de se desenvolver em várias células T efectoras diferentes (por exemplo, Th1, Th2, Th17, etc), cada um com o seu próprio conjunto de citocinas característicos e factores de transcrição, dependendo do microambiente local ^1. As decisões da linhagem que as células T fazem são fundamentais tanto para a imunidade protetora e tolerância à auto. Culas Th17 são um subconjunto de células T conhecidos para combater bactérias extracelulares e fungos, mas as suas respostas erradas também está implicado na patogénese de várias doenças auto-imunes e inflamatórias tais como esclerose múltipla e psoríase ^{2, 3.} Culas Th17 humanos podem ser geradas a partir de células naive T CD4 ⁺ in vitro, proporcionando-lhes um ambiente de polarização apropriado ^4. Vario us combinações das citocinas IL-1β, IL-23, TGF-p e IL-6 foram utilizados para o desenvolvimento de células humanas Th17. Culas Th17 humano expressar CCR6, um receptor de quimiocina que é comumente utilizada para identificar esta população de células e são definidos pela expressão do seu principal factor de transcrição, RORγt (codificado por RORC) ^{5, 6.} culas Th17 têm a capacidade de expressar várias citocinas, mas a IL-17A é a citocina efectora definidora de linhagem produzida por estas células. Foi examinada a expressão de todos os três marcadores associados-Th17 (CCR6, RORγt, IL-17A) para avaliar a robustez do nosso ensaio de diferenciação humano Th17 in vitro. Além disso, foi realizada cultura de células CD4 ⁺ T humanas em condições não polarizadores, onde não há citoquinas ou anticorpos bloqueadores foram adicionados ao meio de cultura a utilizar como controlo negativo uma vez que a expressão destes marcadores Th17 deve ser muito baixa ou ausente.

ve_content "> Uma forma de estudar o desenvolvimento normal humana de células T e biologia é manipular a expressão de genes durante o seu desenvolvimento. Curto-ARN interferente (siRNA) são pequenas moléculas de ARN sintéticos que têm como alvo ARNm de codificação de proteínas e podem ser utilizados para reduzir a expressão do gene específico . MicroRNAs (miARNs) são endógenos não codificantes pequenos RNAs conhecidos para modular a expressão do gene de pós-transcricionalmente. miARNs foram mostrados para desempenhar um papel importante em ambos murino e biologia de célula T humana, incluindo em culas Th17 ^{7, 8, 9.} É é crucial ter métodos fiáveis ​​de manipulação de actividade de RNA pequeno em células T humanas de estudar os seus efeitos sobre a expressão do gene e, finalmente, sobre a biologia de célula T humana. Aqui, descrevemos um protocolo de fácil utilização, consistente e fiável que nós desenvolvido para introduzir pequenos RNAs sintéticos e ácidos nucleicos bloqueados (LNA, quimicamente modificado ácidos nucleicos com maior estabilidade)em células imunitárias e, especificamente, em células humanas Th17.

Existem vários métodos alternativos de introdução de pequenos RNAs em células de mamíferos, os quais geralmente caem em categorias químicas, biológicas, físicas ou ^10. métodos químicos normalmente utilizados, incluindo transfecções à base de lípidos e transfecções de fosfato de cálcio, confiaram na criação de complexos de ADN-químicas que são mais eficientemente absorvidos pelas células. Em geral, os métodos químicos não são tão eficazes para a transfecção de células T primárias. O método biológico mais comum é a utilização de um vector virai (por exemplo, retrovus ou lentivus), que insere directamente ARN estranho num hospedeiro como uma parte do seu ciclo de replicação natural. transdução virai tipicamente leva mais tempo para completar, especialmente quando um factores em tempo para a clonagem molecular de plasmeos provirais. Além disso, os vectores de transdução viral pode ser potencialmente prejudicial para os pesquisadores humanos. A electroporação é um m físicaétodo de induzir a permeabilização da membrana, sujeitando as células de impulsos de alta tensão, permitindo que os ácidos nucleicos de introduzir transitoriamente para dentro da célula, onde podem actuar sobre o alvo. instrumentos eletroporação tradicionais não foram eficazes para a transfecção de linfócitos primários. No entanto, a electroporação optimizado próxima geração tem provado ser capaz de transfectar células T na eficiência muito elevada, especialmente quando o material a ser transfectada é ARN pequeno. O termo próxima geração é livremente utilizado para diferenciar as duas plataformas mais recentes (por exemplo, néon, Amaxa) a partir de máquinas de electroporação tradicionais. Além disso, este método é facilmente escalável para telas rendimento moderado com um máximo de cerca de 120 pequenos RNAs de uma única experiência, muitas vezes utilizando reagentes sintéticos validados. Importante, as transfeces de sucesso pode ser conseguida em menos de 16 horas após a activação de células T. A desvantagem deste método, no entanto, é que não resulta em incorpor genómico estável, e é, portanto, transitórios. Por isso, é importante o esforço extra para criar uma construção de expressão estável, que pode ser embalado num vector virai e expresso com sucesso em células T em casos em que é necessária a expressão de longo prazo de um ARN pequeno.

Usámos uma próxima geração de transfecção (por exemplo, de néon) para proporcionar diversas ferramentas sintéticos simples ou de cadeia dupla de RNA ou de oligonucleidos de LNA para diferentes fins de ^{11, 12, 13.} interferência de ARN eficiente pode ser induzida no primário do rato e células T humanas utilizando ARN curta interferente de cadeia dupla (ARNip). Este protocolo descreve condições optimizadas para a utilização desta técnica em culas Th17 humanos. Além de siRNAs, disponíveis comercialmente imita miARN sintéticos e inibidores podem ser usados ​​para estudar o ganho de miARN e perda de função. imita miARN são moléculas de cadeia dupla de RNA muito semelhantes para os siRNAs, mas designed, com a sequência de miARNs maduros endógenos. inibidores de miARN são quimicamente modificados individuais oligonucleótidos de cadeia de ARN e / ou de LNA base que se ligam a miARNs nativas e antagonizam a sua função. Descobrimos que todas estas ferramentas podem ser usadas de forma eficaz em linfócitos T primárias cultivadas, incluindo mas não limitado a células Th17 humanos.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes da UCSF de Ética em Pesquisa humanos.

1. Preparação de Culturas de Células T, Isolamento de células T CD4 ^+, e Th17 Polarização

1. No Dia 0, revestimento 6-se placas de cultura de tecido com 1,5 mL por po de anticorpo anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme.
2. Preparar as células mononucleares do sangue do cordão umbilical (CBMCs) por centrifugação em gradiente de densidade de acordo com as instruções do fabricante.
   CUIDADO: Trabalhar com cuidado e garantir equipamentos de proteção individual (EPI) é usado quando manusear sangue humano para evitar qualquer risco de exposição a patógenos sanguíneos.
3. Uma vez que as células mononucleares foram isoladas e lavadas, efectuar o isolamento de células CD4 ⁺ T humanas por sele negativocção, utilizando um kit comercial de células CD4 ⁺ T humana.
   NOTA: Se há contaminação de glóbulos vermelhos após o isolamento de células mononucleares, uma lise de células de sangue vermelho opcional pode ser realizado antes das etapas de isolamento de células T CD4 ^+. Ressuspender as células mononucleares em 1 ml de tampão de isolamento (2% de FBS em PBS). Adicionar 5 ml de solução de lise 1x. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicionam-se 5 mL de tampão de isolamento e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células.
   1. Ressuspender as células mononucleares a uma densidade de 50 x 10 ⁶ por 500 uL no tampão de isolamento em um novo tubo de 5 ml.
   2. Adicionar 100 uL de SBF e 100 mL da mistura do Anticorpo por tubo, em seguida, incuba cada tubo a 4 ° C durante 20 min num agitador orbital, para misturar bem.
   3. Após a incubação, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento para lavar as células. Centrifugar as células a 300 xg durante 8 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente a supernatant.
   4. Durante esta rotação, pré-lavar as esferas magnéticas. Transferir a quantidade desejada de esferas magnéticas para um novo tubo (utilizada a 1: 1 com as células) e adicionar um volume igual de tampão de isolamento para lavar as contas. Misturar bem utilizando uma micropipeta 1 ml e, em seguida, colocar o tubo no íman durante pelo menos 1 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender as esferas magnéticas no mesmo volume inicialmente transferida antes da lavagem.
   5. Ressuspender as células em cada tubo com 500 ul de tampão de isolamento e adicionar 500 uL de pérolas magnéticas pré-lavadas.
   6. Incubar as células com as pérolas magnéticas durante 15 min num agitador orbital à temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para misturar bem.
   7. Após a incubação, as células completamente pipeta usando uma micropipeta 1 ml, pelo menos, 10 vezes. Em seguida, adicionar 3-4 mL de tampão de isolamento e colocar cada tubo no íman durante 2 min.
   8. Transferir cuidadosamente as células T CD4 ⁺ negativamente seleccionadas que estão emo sobrenadante para um novo tubo.
4. Uma vez que o isolamento de células T CD4 ⁺ está concluída, a contagem das células com um hemocitómetro e manter as células em gelo.
5. Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 1,5 mL de 2x mistura de meios Th17-polarização a cada poço: IFNy anti-humano (20 ug / ml), anti-IL-4 humana (20 ug / mL), TGF-p humano (10 ng / mL), humano IL-1β (40 ng / mL), IL-23 (40 ng / mL), IL-6 humana (50 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol).
   NOTA: Transfecção e interferência de ARN funciona em meios contendo soro. A finalidade da utilização de meios isentos de soro com este protocolo é conseguir uma melhor produção de IL-17A.
6. Centrifugar as células T CD4 ⁺ humanas a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar as células. Aspirar cuidadosamente o Supernatformiga. Em seguida, voltar a suspender as células em meios de base livre de soro e placa as células a uma densidade de 3 x 10 ⁶ em 1,5 mL por poço, de modo que o volume final é de 3 mL por cavidade e citocinas polarizadoras estão agora a uma concentração final de 1x.
   1. Colocar as placas em 5% de _CO2, 37 ° C incubador durante dois dias.

2. Células de electroporação in vitro polarizada Th17 Humana

1. No Dia 2, revestimento de 48 placas de cultura de tecidos com 250 por po de anti-CD3 humano (2 ug / mL) e anti-CD28 humano (4 ug / mL) em PBS com cálcio e magnésio, durante pelo menos 2 h a 37 ° C.
   1. Alternativamente, revestir as placas durante a noite a 4 ° C. Enrole placas em parafilme.
2. Preparar pequenos RNAs para transfecção. Para cada transfecção, alíquota de 1 mL de uma solução stock de 5? M de siARN para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incluir apropriado pequena contr RNA-correspondida químicaol. Mantenha todos os tubos no gelo.
3. Lavam-se as placas revestidas com anticorpo duas vezes com PBS. Em seguida, adicionar 500 mL de 1X Th17-polarizando meios de comunicação a cada poço: IFNy anti-humano (10 ug / ml), anti-IL-4 humana (10 ug / mL), TGF-p humano (5 ng / mL), IL-humano 1β (20 ng / mL), IL-23 (20 ng / mL), IL-6 humana (25 ng / mL) diluídos em um meio de base livre de soro (suplementado com 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM e 100? M de 2-mercaptoetanol).
4. Depois das placas de cultura e reagentes de transfecção são preparados, ressuspender as células com uma micropipeta 1 ml, pipetando suavemente, mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Reunir as células num tubo cónico e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
   NOTA: Para os períodos de cultura mais longos do que o protocolo de quatro dias aqui apresentado, as culas devem ser transfectadas aproximadamente a cada 3 dias usando o mesmo protocolo. Passo 20,4 deve ser modificado no entanto uma vez que as células tratadas com diferentes pequenos RNAs não devem ser recolhidas. Todas as condições a ser testada deve ser recolhidas, contadas, e transfectados separadamente.
5. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, e, em seguida, voltar a suspender as células em pelo menos 1 ml de PBS para lavagem. Contar as células Th17 vivo (por exemplo, com um hemocitetro utilizando a exclusão de azul de tripano para avaliar a viabilidade) e, em seguida, transferir as culas para um tubo de microcentrífuga.
6. Centrifugar a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente para sedimentar as células.
7. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender as células utilizando o tampão de ressuspensão fornecida a partir do kit de sistema de transfecção de 10 mL a uma densidade de 2,5-4 x 10 ⁷ culas por ml. Manter as células à temperatura ambiente.
   NOTA: Como linha de orientação, tentar preparar apenas como muitas células como pode ser transfectado em 30 min. Vários lotes podem ser comparados.
8. Adicionar 9 uL de células para 1 L de ARN pequeno em cada MicroCentrifuge tubo. Pipetar uma vez para misturar as células e pequenos RNAs para transfecção, em seguida, carregar para a ponta do eléctrodo da pipeta fornecida.
   NOTA: Tipicamente, adicionar 9,5 mL de suspensão de células para garantir que há suficiente da mistura para impedir a criação de bolhas na ponta do eléctrodo da pipeta antes da transfecção.
9. Encher a tina fornecida com 3 mL de temperatura ambiente electrolico de Tampão E. Coloque a cuvete dentro da estação de pipeta e, em seguida, colocar a pipeta em posição no interior da cuvete.
10. electroporate imediatamente cada 10 uL de mistura de células e pequenos RNA usando os seguintes parâmetros: tensão de impulso 1,500-1,550 V, largura de impulso de 10 ms, e 3 impulsos total do dispositivo de transfecção.
11. Após a electroporação é completa, adicionar directamente a mistura de células a 500 mL de 1X Th17-polarizando meios em recipientes preparados de uma placa de cultura. Placas lugar em um 5% _{de CO2,} 37 ° C incubadora durante mais dois dias.
    NOTA: Lava-se a ponta do eléctrodo da pipeta por pipetagemcima e para baixo em PBS entre cada transfecção.

3. Células de colheita Th17 Humana

1. Ressuspender as células em meio de cultura com uma micropipeta, pipetando suavemente mas garantindo que todas as células são destacadas do fundo dos poços. Preparar as células para ensaios de expressão funcionais e / ou de genes.
   NOTA: Rotineiramente, células suficientes são produzidos a partir de um único poço de células Th17 transfectadas para ser utilizado para análise de citometria de fluxo de marcadores de superfície e de citocina e factor de transcrição ou de coloração intracelular para a preparação de ARN para a análise da expressão do gene.

Resultados

O primeiro passo para o desenvolvimento de um sistema fiável de electroporating com sucesso células Th17 humanos era robusta para gerar in vitro diferenciadas culturas de culas Th17 humanos. As células T cultivadas sob condições polarizantes Th17-expressa o receptor de quimiocina CCR6 e o factor de transcrição RORγt (figura 1A, esquerda). Estes marcadores não foram expressas quando as células T foram cultivadas sob condições não polarizadores (THN) ...

Discussão

Este protocolo fornece um método melhorado para a entrega de pequenos RNAs em células Th17 humanos. Embora as células Th17 humanos foram usadas aqui, este método de electroporação com pequenos RNAs pode ser utilizado com outros subconjuntos auxiliar humano primário de T, tais como Th1, Th2, e Tregs. Não tem funcionado bem para as células T CD4 ⁺ naive então as células devem ser activadas em cultura antes da transfecção. Para este protocolo, que primeiro optimizado o sistema in vitro de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use