Um grânulo emparelhado e matriz de ímã para moldagem micropoços com geometrias côncavas variáveis

Resumo

Este manuscrito introduz um método robusto de fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Usando a força magnética, esferas de aço e uma matriz do através de-furo, várias centenas de micropoços formaram-se em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm.

Resumo

Uma cultura de esferoide é uma ferramenta útil para compreender o comportamento celular em que proporciona um na vivo-como ambiente tridimensional. Vários métodos de produção de esferoide como superfícies não adesivas, frascos de girador, gotas de suspensão e micropoços têm sido utilizados em estudos de interação célula a célula, ativação imune, drogas, triagem, haste diferenciação celular e geração de organoides. Entre esses métodos, os poços da microplaca com uma geometria tridimensional côncavo ganhou a atenção de cientistas e engenheiros, dados suas vantagens de geração de esferoide de tamanho uniforme e a facilidade com que as respostas de esferoides individuais podem ser monitorado. Apesar de cost-effective métodos tais como o uso de membranas flexíveis e litografia de gelo têm sido propostos, estas técnicas incorrer em graves inconvenientes tais como dificuldade em controlar os tamanhos padrão, realização de altas proporções e produção de áreas maiores de micropoços. Para superar estes problemas, propomos um método robusto para fabricar micropoços côncavos, sem a necessidade de instalações complexas de alto custo. Este método utiliza uma matriz de através de-furo 30x30, aço de cem micrômetro-ordem vários grânulos e a força magnética para fabricar 900 micropoços em um substrato de polidimetilsiloxano (PDMS) 3 x 3 cm. Para demonstrar a aplicabilidade do nosso método para aplicações biológicas de células, nós cultivadas as células-tronco adiposas por 3 dias e produzido com sucesso usando a nossa plataforma de microplacas de esferoides. Além disso, realizamos uma simulação magnetostatic para investigar o mecanismo, pelo qual força magnética foi usada para aprisionar os grânulos aço os através de buracos. Acreditamos que o método de fabricação de microplacas proposto poderia ser aplicado para muitos estudos baseados em esferoide celulares como triagem de drogas, regeneração de tecidos, diferenciação de células-tronco e metástases.

Introdução

As células cultivadas em forma de esferoide são mais semelhantes ao tecido real no corpo que uma cultura planar bidimensional¹. Dada esta vantagem, o uso de esferoides tem sido adotado para melhorar o estudo da interação de célula para célula^2,3, ativação imune⁴,⁵e de diferenciação⁶de despistagem de drogas. Além disso, incorporando vários tipos de células de esferoides recentemente foram aplicados ao organoids (perto de-fisiológicos tridimensional (3D) tecido), que são muito úteis para o estudo de desenvolvimento e doença humana⁷. Vários métodos têm sido utilizados para produzir esferoides. O método mais simples envolve a utilização de uma superfície não-adesivas, tais que as células agregam-se com os outros e esferoides de formulário. Um prato de Petri pode ser tratada com albumina de soro bovino, pluronic F-127 ou um polímero hidrofóbico (por exemplo, metacrilato de 2-hydroxyethl de poli) tornar-se sua superfície não adesivas,⁸⁹. O método de girador-balão é outro meio conhecido de produzir grandes quantidades de esferoides^10,11. Neste método, as células são mantidas em suspensão por mexendo para impedi-los de tornar-se ligado ao substrato. Em vez disso, o flutuante células agregado de esferoides de formulário. O método de superfície não-adesivas e o girador balão método podem produzir grandes quantidades de esferoides. No entanto, eles estão sujeitos a limitações, incluindo dificuldades em controlar o tamanho de esferoide, bem como o acompanhamento e monitoramento de cada esferoide. Como um remédio para esses problemas, um outro método de produção de esferoide, ou seja, a suspensão drop método pode ser empregado¹². Isto envolve depositando gotas de suspensão de células na parte inferior da tampa de um prato de cultura. Estas gotas são geralmente 15 a 30 µ l de tamanho e contêm cerca de 300 a 3000 células¹³. Quando a tampa é invertida, as gotas são mantidas no lugar pela tensão superficial. O ambiente de microgravidade em cada gota concentra as células, que então formam esferoides único em uma interface líquido-ar livre. Os benefícios do enforcamento método drop são que oferece uma distribuição de tamanho bem controlados, enquanto é fácil de rastrear e monitorar cada esferoide, em relação os métodos de balão de superfície e spinner não adesivas. No entanto, esse método incorre em uma desvantagem em que a produção em massa de esferoides e o próprio processo de produção é excessivamente do trabalho intensivo.

Uma matriz de microplacas é um flat placa com muitos poços de tamanho micro, cada um com um diâmetro que varia de 100 a 1000 µm. O princípio de produção de esferoide quando usando micropoços é semelhante do método de superfície não-adesivas. Os benefícios incluem o fato de que os poços da microplaca fornecem espaços entre os poços da microplaca para separar as células ou esferoides, tal que é fácil de controlar o tamanho de esferoide, enquanto também facilitando a monitorar cada único esferoide. Com um grande número de poços da microplaca, produção de alto rendimento esferoide também é possível. Outra vantagem do micropoços é a opção para poços de formulário de diferentes formas (hexahedral, cilíndrico, trigonal prismáticos) dependendo fins experimentais originais dos usuários. Geralmente, no entanto, uma forma tridimensional (3D) côncava (ou hemisférica) é considerada como sendo o mais adequado para a produção de esferoides único tamanho uniforme. Portanto, a utilidade de micropoços côncavos tem sido relatada para muitos estudos de biologia celular tais como aqueles examinando a casos de diferenciação de células-tronco embrionárias¹⁴, a secreção de insulina das células da ilhota clusters de¹⁵, o atividade enzimática de hepatócitos¹⁶e a resistência de droga de tumor esferoides¹⁷.

Infelizmente, a fabricação de micropoços frequentemente requer instalações especializadas micropatterning; métodos baseados em fotolitos convencionais requerem exposição e instalações em desenvolvimento enquanto métodos reativos baseados em íon-gravura precisam de equipamento de plasma e de feixes de iões. Esse equipamento é caro, que, juntamente com o processo de fabricação complicada, apresenta uma alta barreira à entrada para os biólogos que não têm acesso a microtecnologia. Para superar estes problemas, outros métodos de baixo custo tais como gelo litografia¹⁸ (usando as gotas de água congelada) e o método de membrana flexível¹⁴ (usando uma membrana, substrato do através de-furo e vácuo) têm sido sugeridos. No entanto, esses métodos também incorrer em graves inconvenientes tais como sendo difícil controlar os tamanhos padrão, a obtenção de elevadas proporções e a produção dos poços da microplaca área maior.

Para superar as questões acima, propomos um método de fabricação do romance de microplacas côncavo utilizando um substrato do através de-furo, esferas de aço e uma matriz de ímã. Usando esse método, centenas de micropoços esféricos côncavos podem ser fabricadas, aproveitando o mecanismo de força magnética-assistida de travamento automático grânulos metálicos (Figura 1). O processo de fabricação envolve o uso de muito poucas facilidades caros e complicados e não exige muitas habilidades avançadas. Como tal, pessoas mesmo não qualificadas podem facilmente realizar este método de fabricação. Para demonstrar o método proposto, humanos adiposo-derivado de células-tronco foram cultivadas aos micropoços côncavos para produzir esferoides.

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Protocolo

1. preparação do através de-furo alumínio placa e ímã matriz

1. Preparar duas 50 mm x 50 mm (ou mais) placas de alumínio. A espessura de cada placa foi 300 µm que é metade do diâmetro do grânulo.
2. Forma uma matriz do através de-furo de 30 x 30 em uma das placas de alumínio usando um gravador giratório do CNC com uma Φ550-µm micro broca com 30 mm/s de taxa de mergulho e 8000 RPM de velocidade do eixo. A distância entre cada buraco (centro) foi de 1 mm (Figura 1a e Figura 2a, eu).
3. Forma uma matriz de 30 x 30 de Φ750-µm através de buracos na outra chapa de alumínio, usando o mesmo procedimento como descrito em 1.2 (Figura 1a e Figura 2a, ii).
4. Anexar as duas placas uns aos outros, usando uma fita adesiva e formar Φ3 furos de alinhamento mm em cada um dos quatro cantos de ambas as placas de alumínio.
5. Mergulhe as placas de alumínio em 15% ácido sulfúrico para 12h limpar suas superfícies. Desde que a fina camada de óxido de alumínio sobre a superfície do alumínio torná-lo resistente à corrosão, o diâmetro do furo e da espessura da placa não são alterados por este tratamento com ácido.
6. Forma uma matriz de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 ímãs de neodímio mm (com uma força magnética de 0.363 N). Certifique-se de que cada ímã é a polaridade oposta a seu vizinho. Para evitar a quebra ou a dispersão da matriz de ímã, anexe uma placa de alumínio de 30 x 30 mm para o fundo da matriz ímã usando fita dupla-face (Figura 2a, iii e baixo-relevo na Figura 2).

2. processo de captura do grânulo

1. Alinhar e empilhar as duas chapas de alumínio (top placa: 750-µm-buraco placa, placa inferior: 550-µm-buraco placa) usando os furos de alinhamento preparado nos quatro cantos de cada placa (Figura 1b).
2. Bloquear as duas placas juntas inserindo parafusos M3 os furos de alinhamento e fixe os parafusos com porcas (Figura 1b).
3. Empilhe o conjunto de placa de alumínio na matriz de ímã preparado (Figura 1b, 2be 2C). Alinhe a matriz de ímãs e a matriz de através de orifícios na placa de alumínio durante o processo de integracao. Em seguida, use uma fita adesiva para fixar a posição da matriz de ímã.
4. Lugar, um número suficiente de Φ600 mm SUJ2 aço de pérolas sobre o conjunto de placa e manipular as contas usando um acryl (metálicos ou não) da placa tal que um grânulo se torna prendido em cada furo (Figura 1C, 1De 1e), enquanto simultaneamente removendo os excesso grânulos que não tenham apresentado nos buracos.
5. Remova cuidadosamente a placa superior para evitar dispersão indesejado e luxação dos grânulos presos (Figura 1f).

3. côncavo de microplacas fabricação

1. Mova o molde côncavo de microplacas, produzido em passos 2.1 a 2.5, acima, para uma placa de Petri.
2. Misture o monômero polydimethylsiloxane (PDMS) e agente de cura, de acordo com instruções^{19 as indicações do fabricante} com um monômero PDMS: relação de 10:1 do agente de cura.
3. De gás da mistura PDMS usando um dessecador e bomba de vácuo para remover quaisquer bolhas presas na mistura de PDMS.
4. Despeje a mistura PDMS no molde côncavo de microplacas e de gás novamente usando o mesmo procedimento como descrito no ponto 3.3 (Figura 1f).
5. Asse a mistura PDMS em uma chapa de fogão a 80 ° C por 2 h formar um substrato PDMS grânulo-incorporado (Figura 1G).
6. Remova o substrato PDMS curado do molde (Figura 1G). No processo de remoção, pulverize metanol usando garrafa de lavagem para retirar o substrato PDMS do molde.
7. Usando um Φ15 x ímã de 2 mm, remova as esferas de aço presas ao substrato PDMS (Figura 1-h). Para este processo, pode ser usado qualquer ímã suficientemente forte para extrair os grânulos de substrato PDMS.

4. cultura de esferoide

1. Corte o substrato PDMS côncavo de microplacas-modelados usando um soco de biópsia Φ14 mm deve ser montado em placa de 24 neste estudo.
2. Esterilize o substrato PDMS de mm Φ14 resultante em um esterilizador autoclave a 121 ° C e 15 libras por polegada quadrada.
3. Coloque o substrato esterilizado de PDMS em um prato bem 24.
4. Revesti o substrato PDMS inteiro com 4% (p/v) pluronic F-127 solução durante a noite para evitar o acessório de celular para a superfície de microplacas. Durante o processo de revestimento, remova quaisquer bolhas de ar aprisionadas no côncavos micropoços pipetando ou usando um líquido de limpeza ultra-sônico.
5. Liberar a solução de F-127 três vezes usando tampão fosfato salino (PBS).
6. Sementes de 1 mL de solução de meio-celular (de Dulbecco meio Eagle modificado) (que contém 2 x 10⁶ células) sobre o substrato PDMS. Observe que a densidade de semeadura pode ser alterada de acordo com o tamanho do esferoide de destino e/ou tipo de célula de destino. Aqui, células-tronco adiposo-derivado (ASC) foram utilizadas.
7. Aspire a 1 mL de meio usando uma 1000 µ l pipetas para remover qualquer excesso células que não foram presos aos micropoços (Figura 3).
8. Incube as celulas a 36,5 ° C, umidade de > 95% e 5% CO₂ condição. No caso dos ASCs usados em nosso estudo, as células agregam-se um spheroid em 48 h.

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Resultados

Um molde convexo e padrão de microplacas com êxito foram fabricadas seguindo as etapas 2.1 a 3.7. (Figura 4). As esferas de aço comerciais ficaram presos na matriz do através de-furo de 30 x 30. Os grânulos realizaram-se, firmemente, sem quaisquer lacunas entre os grânulos e os correspondentes através de furos (figura 4a). A forma de fabricados de microplacas côncava é côncavo hemisférica, com um diâmetro de 600 µm, ...

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Discussão

O grande desafio deste método de fabricação foi a fixação segura dos grânulos da matriz do através de-furo na placa de alumínio. Para resolver este desafio, força magnética sob a forma de uma matriz de 30 x 30 imã foi usada para corrigir os grânulos firmemente, como mostrado nas figuras 6 e 7. A densidade do fluxo magnético da matriz de ímã, que tem a polaridade oposta, é mais forte no centro de cada superfície do ímã. Porque a força da força magnética depende da de...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011