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Neste Artigo

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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Aqui descrevemos um método de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco ao caseu de lesões e cavidades de tuberculose pulmonar. O protocolo também é usado com uma matriz espumosa derivada de macrófagos que é um substituto efetivo do caseu.

Resumo

A erradicação da tuberculose requer regimes medicamentosos que possam penetrar as múltiplas camadas de lesões pulmonares complexas. A distribuição de fármacos nos núcleos caseosos de cavidades e lesões é especialmente crucial porque abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a fármacos também vulgarmente referidas como persisters. Os métodos existentes para a medição da penetração de fármaco em lesões de tuberculose envolvem costosos e demorados estudos farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas ou de imagem. A medida in vitro da ligação do fármaco às macromoléculas de caseu foi proposta como uma alternativa a essas técnicas, uma vez que esta ligação dificulta a difusão passiva de moléculas de fármaco através do caseu. A diálise de equilíbrio rápido é um sistema rápido e confiável para realizar estudos de ligação a proteínas plasmáticas e tecidos. Neste protocolo, usamos um dispositivo de diálise de equilíbrio rápido (RED) para medir a ligação do fármaco a homogenatos de caseu que é excised das lesões e as cavidades de coelhos infectados com tuberculose. O protocolo também descreve como gerar uma matriz de substituição de lípido carregado THP-1 macrófagos para usar em lugar de caseum. Este ensaio de ligação caseum / substituto é uma ferramenta importante na descoberta de drogas tuberculose e pode ser adaptado para ajudar o estudo da distribuição de drogas em lesões ou abcessos causados ​​por outras doenças.

Introdução

O tratamento da doença pulmonar tuberculosa requer distribuição eficaz de fármacos em diferentes tipos de lesões. As lesões necróticas e as cavidades contêm centros caseosos que abrigam subpopulações de bactérias tolerantes a drogas ou "persistentes". 1 , 2 A doença cavitária está associada a taxas de cura inferiores e mau prognóstico. 3 , 4 Estudos anteriores mostraram, usando técnicas quantitativas e de imagem, que a capacidade de penetrar o caseu varia significativamente de uma classe de droga para outra. 5 , 6 Estes métodos, no entanto, exigem o uso de modelos de infecção animal que são lentos e tediosos. Foi concebido um ensaio in vitro que mede a ligação do fármaco ao caseu ex vivo . Verificou-se que esta ligação estava inversamente correlacionada com a penetração do fármaco em granulomas caseosos e, por conseguinte, éusado como uma ferramenta de previsão. 7

Diálise de equilíbrio é considerado como o método padrão de ouro para estudos de ligação de proteína de plasma. O dispositivo rápido equilíbrio de diálise (VERMELHO) proporciona um sistema rápido, fácil de usar e fiáveis ​​para a realização de tais ensaios. 8 O dispositivo é constituído por dois componentes: de utilização única, descartáveis que consistem inserções de 2 câmaras separadas por um cilindro vertical de membrana semi-permeável; e placas de base reutilizáveis ​​que pode armazenar até 48 inserções de cada vez. A membrana de diise tem um 8 kDa de peso molecular de corte (MWCO) que é ideal para estudos de ligação a drogas macromolécula. A razão de área para volume elevada superfície do compartimento da membrana de diálise permite uma rápida e equilibração. Ambos os insertos e a placa de base foram validados para o mínimo de ligação não específica. A combinação do dispositivo VERMELHO com técnicas bioanalíticas fornece estimativas precisas sobre as fracções não ligadas de medicamentos em pLasma 8 , 9

Embora originalmente concebido para medir a ligação às proteínas plasmáticas, o dispositivo RED foi utilizado em vários estudos de ligação de tecidos utilizando homogeneizados. 10 , 11 Neste protocolo, medimos a ligação do fármaco ao caseu, os detritos necróticos excisados ​​das lesões necróticas e cavidades de coelhos infectados com tuberculose. A natureza acelular e não vascular do material caseoso facilita a homogeneização numa suspensão homogénea que é compatível com o ensaio.

Dado que o caseu é tedioso para produzir e difícil de encontrar, o protocolo também foi validado para uso com uma matriz substituta que é preparada a partir de macrófagos espumosos. Os macrófagos derivados de monócitos THP-1 são induzidos com ácido oleico para acumular múltiplos corpos lipídicos que lhes conferem a sua aparência "espumosa". Estas células carregadas de lípidos são colhidas eProcessado para produzir uma matriz que usamos como um substituto de caseu. Este estudo mostrou que a ligação do fármaco a esta matriz substituta se correlaciona bem com a ligação ao caseu, imitando eficazmente o processo in vivo que impede a penetração do fármaco no núcleo caseoso de granulomas e cavidades.

Protocolo

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde com a aprovação do Comitê Institucional animal Cuidado e Uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD. Todos os estudos envolvendo o M. tuberculosis foram realizados num laboratório com nível de segurança biológica de contenção 3 (BSL-3).

Modelo Infecção 1. Coelho e Coleção caseum

  1. Infect de coelhos Nova Zelândia brancos com M. tuberculosis usando um sistema de exposição de aerossóis só de nariz, como descrito anteriormente. 12, 13 permitir que a infecção progride para 12-16 semanas. Sedar os coelhos com 35 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina por via intramuscular, sacrificar os coelhos, com 0,22 ml / kg de pentobarbital de sódio por via intravenosa e a fenitoína de sódio e prosseguir com as necropsias.
  2. Usando pinças e um bisturi, remove pulmões do ca peitoVidade. A partir de cada lobo pulmonar, dissecar cavidades individuais e grandes granulomas necróticos usando um bisturi. Cuidadosamente raspar fora caseu da cavidade e granuloma paredes. Pesar, gravar e armazenar amostras em tubos de 2 mL com tampa roscada a -20 ° C até que esteja pronto para uso.
  3. Irradia-se as amostras de caseu infecciosas a 3 MegaRad em gelo seco para torná-las não infecciosas e seguras para utilização num laboratório BSL-2.

2. Geração In Vitro de Substituto Caseum de células THP-1

  1. Crescer monócitos THP-1 em meio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino a 10%) em frascos de cultura de células T175 (80 mL / balão). Incubar os frascos numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 ° C durante 3-4 dias.
  2. Centrifugar a cultura de um balão T175 em dois tubos cônicos de 50 mL a 150 xg por 5 min. Descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 10 mL de meio RPMI 1640.
  3. Pipetar 5 μL desta cultura em um tubo de 1,5 mL contendo 45 μL de tazul rypan. Mistura-se cuidadosamente por pipetagem. Transferir 10 uL para um hemocitómetro e contar o número de monócitos THP-1 viáveis ​​(sem corante), utilizando um microscópio óptico (ampliação de 10X). Calcular o número de células viáveis ​​por ml de cultura. Diluir com meio RPMI para a densidade final de 1,25 x 10 6 culas / mL.
  4. Carregar 40 ml da cultura em uma placa de cultura de células grandes (50 x 10 6 culas / placa). Adicionar 40 uL de 100 uM de PMA (forbol 12-myristate13-etilo preparado em etanol) e permitir que as células a aderir durante a noite na incubadora.
    NOTA: A concentração final de PMA é de 100 nm.
  5. Dilui-se o ácido puro oleico (OA) (0,89 g / mL) em etanol para a concentração de 0,1 M (ou seja 31,7 mL de OA em 968,3 mL de etanol). Dilui-se esta solução em meio fresco RPMI pré-aquecido a uma concentração de 10 mM. Dilui-se esta suspensão de OA a 0,4 mM (concentração final de trabalho), em meio RPMI pré-aquecido a 37 ° C.
  6. Remova a mídia e não existentesDas células de cultura de células e adicionar suavemente 40 mL de OA 0,4 mM aos macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C na incubadora durante a noite.
  7. Use um microscópio de luz com uma ampliação de 40x para confirmar visualmente a presença de numerosas inclusões de corpo lipídico em cada THP-M. Remover todo o meio RPMI das placas de cultura de células e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) utilizando uma pipeta serológica de 50 mL.
    NOTA: Os corpos lipídicos aparecem como estruturas esféricas pequenas e claras no citoplasma do THP-M.
  8. Adicionar 40 mL de ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA) em PBS a cada placa. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
  9. Desmonte os macrófagos espumosos (FM) pipetando repetidamente para cima e para baixo sobre a superfície da placa inteira usando uma pipeta serológica de 10 mL. Transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mL e girar para baixo a 150 xg por 5 min.
  10. Ressuspender o sedimento celular em 10 mL de PBS (terceira lavagem com PBS) aNd de transferência para um pré-pesados ​​15 mL mL tubos cônicos. Girar novamente para 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta serológica e descartar.
  11. Submeter as pastilhas de FM a 3 ciclos de congelamento-descongelamento para lisar as células e incubá-las a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturar as proteínas na matriz. Armazenar os grânulos a -20 ° C até estar pronto para uso.

3. Ensaio de Diálise de Equilíbrio Rápido (RED)

  1. Preparar soluções-mãe 10 mM de todos os compostos de teste em dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a soluções de trabalho de 500 μM em DMSO antes de cada ensaio.
  2. Pesar o tubo contendo a pastilha substituta de caseu. Subtrair o peso do tubo vazio para derivar o peso do grânulo sozinho. Adicionar 2-3 esferas metálicas por tubo e, utilizando um homogeneizador de tecidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, interromper o caseu ou a matriz substituta em PBS (1: 9 p / v) para se obter a suspensão diluída 10x de cada matriz.
  3. Spike 6,5 μL dos 500ΜM do composto de teste em 643,5 μL de homogeneizado para se obter a concentração final de 5 μM (≤ 1% de DMSO) e vórtex.
  4. Coloque as inserções VERMELHAS na placa de base. Adicionar 200 μL da matriz droga-cravada na câmara doadora (anel vermelho) de cada inserto VERMELHO e 350 μL de PBS em cada câmara receptora. Preparar 3 insertos para cada composto de teste (amostras em triplicado). Selar a placa com um vedante de placa adesiva e incubar a 37 ° C no termomixador a 200 rpm (1 xg) durante 4 h.
  5. Após a incubação, misturar suavemente o conteúdo das câmaras doador e receptor por pipetagem para cima e para baixo 2-3 vezes. Pipetar para fora alíquotas de 20 μL de homogeneizado das câmaras de dador e adicionar 20 μL de PBS limpo num tubo de 1,5 mL (1: 1). Do mesmo modo, pipetar para fora alíquotas de 20 μL de amostras de PBS das câmaras receptoras e adicionar 20 μL de homogeneizado limpo (correspondência de matriz). 8
    NOTA: A correspondência de matriz elimina aEd para 2 curvas de calibração separadas (em homogeneizado e PBS) a serem feitas para análise quantitativa. O conteúdo da câmara doadora pode sedimentar ao longo do tempo. Misture suavemente o conteúdo por pipetagem antes de remover as alíquotas.

4. Quantificação de LC-MS e Análise de Dados

  1. Adicionar 160 μL de metanol: acetonitrilo 1: 1 contendo diclofenac 500 ng / mL ou verapamil 10 ng / mL (padrão interno) a cada tubo e vortex para precipitar as proteínas. Centrifugar a 10 000 xg durante 5 min para sedimentar o precipitado e transferir os sobrenadantes para placas de poço profundo de 96 poços para análise de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LCMS). 7
  2. Construir curvas de calibração de 1-1000 nM para cada composto de teste, mantendo a mesma composição de matriz que as amostras acima. Quantificar a concentração do composto de teste em amostras das câmaras doadora e receptora utilizando um método LC-MS.
  3. Calcular a fracção não ligada ( f u ) oF o fármaco em matriz diluída usando a equação 1. Calcule o f u em matriz não diluída usando a equação 2 ( D = fator de diluição de 10). 14
    figure-protocol-7649
    figure-protocol-7721
  4. Verificar a recuperação (balanço de massa) de cada composto utilizando a equação 3 para identificar compostos com estabilidade / metabolismo / questões de ligação não específicas.
    NOTA: Recuperação normalmente cai entre 70% e 130%. 15
    figure-protocol-8069

Resultados

Usando este protocolo, testámos centenas de compostos de desenvolvimento de tuberculose para a sua eficiência previsto no penetrante caseum. A Figura 1 visualiza os conceitos básicos do ensaio VERMELHO. A membrana de diálise das inserções VERMELHOS permite para pequenas moléculas não ligadas a difundir a partir do dador bem ao receptor bem como, finalmente, atingir um equilíbrio entre os dois compartimentos. As pequenas moléculas que são ligadas a macromolécu...

Discussão

Lesões necróticas pulmonares e cavidades em pacientes infectados com tuberculose contêm subpopulações de bactérias que são recalcitrantes ao tratamento medicamentoso. Os núcleos caseosos destas estruturas são particularmente responsáveis ​​por abrigar estes persisters em um ambiente extracelular. Acredita-se que uma distribuição favorável de agentes anti-bacterianos nestes locais remotos seja um determinante importante da eficácia do fármaco contra a tuberculose. Antes da validação deste protocolo, ...

Divulgações

Não existem interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Desejamos agradecer à Johnson & Johnson, à TB Alliance, à Astra Zeneca, à Rib-X e à Trius Therapeutics pela prestação de bedaquilina, PA-824 (pré-tonsanida), AZD5847, radezolid e tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner forneceram suporte com análise MALDI, métodos bioanalíticos, preparação do substituto caseu, síntese química e isolamento de caseum de coelho. Este trabalho foi realizado com financiamento da Fundação Bill e Melinda Gates, o prêmio # OPP1044966 e OPP1024050 para V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, bem como o financiamento conjunto da Fundação Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust para um Centro de Excelência Para Lead Optimization para Doenças do Mundo em Desenvolvimento a P. Wyatt.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
New Zealand White RabbitsCovance-
HN878 Mycobacterium tuberculosisBEI ResourcesNR-13647 
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3NHenry Schein Animal Health56344
Anased (Xylazine) 100 mg/mLHenry Schein Animal Health33198
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution Virbac710101
THP-1 monocytic cell lineATCCATCC TIB-202
175 cm² TC-Treated Flask (T175)Fisher ScientificT-3400-175
RPMI 1640 media w/o glutamineFisher ScientificMT-15-040-CV
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated Fisher ScientificSH3091003IR
Hyclone L-glutamine, 200 mMFisher ScientificSH3003401
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, ventedFisher ScientificT-2881-1
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Fisher ScientificBP685-1
Ethylenediaminetetraacetic acidSigmaE6758
Oleic acid Fisher ScientificICN15178101
Pierce RED Device Reusable Base PlateFisher ScientificPI-89811
Pierce RED Device Inserts, 50/box Fisher ScientificPI-89809
Pierce RED insert removal tool Fisher Scientific89812
Adhesive plate sealFisher Scientific08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) Life Technologies 10010-049
DMSOSigma472301
AcetonitrileSigma34998
MethanolSigma34860
Verapamil hydrochlorideSigmaV4629
Diclofenac sodium saltSigma93484
Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15-250-061
Ethanol, 200 proofFisher Scientific04-355-451
2010 Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk BeadsFisher Scientific15-340-158
484R Cobalt 60 IrradiatorJL Shepard7810-484-1
INCYTO C-Chip Disposable HemacytometersFisher Scientific22-600-100
Upright Light MicroscopeLeicaDM1000
Binary Liquid Chromatography systemAgilent1260Multi-compenent
Mass spectrometerAB Sciex4000

Referências

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  2. Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
  3. Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
  4. Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
  5. Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
  6. Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
  7. Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
  8. Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
  9. Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
  10. Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
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  12. Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
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  16. Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
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