Um novo método para modelar a encefalopatia traumática crônica em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para infligir lesões cerebrais traumáticas de cabeça fechada em Drosophila melanogaster . Nosso método tem a vantagem de entregar diretamente impactos repetitivos com força ajustável para a cabeça sozinho. Uma maior exploração do sistema de invertebrados ajudará a iluminar a patogênese da encefalopatia traumática crônica.

Resumo

A encefalopatia traumática crônica (CTE) é uma doença neurodegenerativa estabelecida que está intimamente associada à exposição a lesões cerebrais traumáticas leves repetitivas (mTBI). Os mecanismos responsáveis ​​por suas complexas mudanças patológicas permanecem bastante evasivos, apesar de um consenso recente para definir os critérios neuropatológicos. Aqui, descrevemos um novo método para desenvolver um modelo de CTE em Drosophila melanogaster ( Drosophila ), na tentativa de identificar os genes e caminhos chave que levam ao acúmulo de tau hiperfosforilizado característico e a morte neuronal no cérebro. Os impactos de resistência ajustável para infligir feridas fechadas leves são entregues diretamente na cabeça da mosca, submetendo a cabeça a aceleração e desaceleração rápidas. Nosso método elimina os problemas potenciais inerentes a outros modelos de mTBI de Drosophila ( por exemplo, a morte de animais pode ser induzida por danos aOutras partes do corpo ou órgãos internos). O menor cuidado de animais com uso intensivo de mão-de-obra e custo, vida curta e extensas ferramentas genéticas tornam a mosca da fruta ideal para estudar a patogênese do CTE e possibilitar a realização de telas genéticas e farmacológicas avançadas em grande escala, genômicas. Prevemos que a caracterização contínua do modelo gerará importantes insights mecanísticos sobre prevenção de doenças e abordagens terapêuticas.

Introdução

A Encefalopatia Traumática Crônica (CTE) recentemente foi reconhecida como um distúrbio neurodegenerativo distinto, separado de outras tauopatias, como a doença de Alzheimer ¹ . Ao contrário da doença de Alzheimer e outras tauopatias comuns - cujos fatores de risco mais importantes estão avançando em idade e história familiar de demência, o CTE, como indicado pelo seu nome, implica uma estreita associação com história de trauma cerebral, muito provavelmente visto em atletas de esportes de contato, Como boxers e jogadores de futebol, bem como em veteranos militares ^{2 , 3 , 4 , 5} . É pensado para ser iniciado por golpes repetidos de concussão e subconcussão na cabeça. Os pacientes podem apresentar sintomas e sinais como déficits cognitivos, mudanças de humor e comportamento e disfunção do movimento, que se sobrepõem significativamente com a doença de Alzheimer, frontotemporalDemência, demência do corpo de Lewy e doença de Parkinson ⁶ . Em contrapartida, os exames pós-mortem do tecido cerebral revelam um padrão distinto de acumulação de tau hiperfosforilada em torno de pequenos vasos sanguíneos nas profundezas dos sulcos corticais, uma característica patognomônica não observada nas outras condições degenerativas ⁷ . No entanto, até agora, muito pouco se sabe sobre a patogênese que leva à manifestação da doença. Isto é em grande parte devido à falta de um modelo animal fiel - apenas recentemente foram gerados modelos de roedores ^{5 , 8} . Esses organismos modelo apresentam as desvantagens dos cuidados intensivos em custos e uma vida útil relativamente longa, que não são adequadas para estudos de doenças neurodegenerativas.

Em comparação com homólogos de mamíferos, animais invertebrados, como Drosophila, são uma excelente alternativa, com sua manutenção econômica,Ferramentas extensivas para dissecar determinantes genéticos e vida útil relativamente curta ⁹ . Notavelmente, a mosca e os cérebros humanos compartilham caminhos molecular e celular evolutivamente conservados, bem como semelhanças anatômicas ^{10 , 11 , 12} . Dois modelos engenhosos de Drosophila para estudar lesão cerebral traumática foram relatados anteriormente ^{13 , 14} . O primeiro dispositivo "High Impact Trauma" (HIT) projetado por Katzenberger e colegas continha moscas de movimento livre em um frasco de plástico que estava ligado à extremidade livre de uma mola metálica ^{13 , 15} . Quando o frasco de plástico foi inclinado verticalmente e liberado, ele atingiu uma almofada de poliuretano e transmitiu trauma para as moscas enquanto eles saltavam para a parede do frasco e se recuperaram. Em contraste, Barekat e colegas desenharam um método de entrega diferente, nósNa plataforma de homogeneizador Omni Bead Ruptor-24 ¹⁴ . As moscas foram incapacitadas com CO ₂ e colocadas em um tubo de rosca de rosca de 2 mL que foi fixado ao homogeneizador e submetido a condições de agitação pré-programadas. Um dos benefícios do uso do sistema de homogeneizador de tecido é que o experimentador poderia modular a intensidade do ferimento, a duração da lesão e o número de episódios de lesões. No entanto, ambos os regimes sofrem a mesma desvantagem: lesões primárias na cabeça são inflacionadas aleatoriamente em termos de localização e força de impacto. Além disso, ambos os métodos resultaram em mortalidade considerável, causada por danos colaterais inevitáveis ​​a outras partes do corpo e órgãos internos. Aqui, descrevemos um novo método para induzir o mTBI nas moscas da fruta. Nosso aparelho consiste em um pêndulo balístico a gás. Comparado com os modelos Drosophila existentes ^{14 , 15} , nosso método tem a vantagem única de fornecer medidasImpacto de urable, dirigido apenas para a cabeça de mosca de movimento livre, permitindo o controle preciso de vários fatores, como a gravidade do impacto, o intervalo de tempo entre os impactos e o número total de impactos sofridos.

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Protocolo

1. Montagem do Dispositivo de Strike ( Figura 1 )

1. Remova o êmbolo de uma seringa de tuberculina de 1 ml. Corte o barril na marca de 1 mL.
2. Remova uma barreira de aerossol (3 mm de altura x 4 mm de diâmetro) de uma ponta de pipeta de 200 μL e use-a como pêndulo. Coloque o pêndulo dentro do tambor da seringa. Toque suavemente o cano para mover o pêndulo para a extremidade da ponta, com o lado plano cobrindo a abertura do bico.
3. Conecte a extremidade da ponta do barril a uma tubulação de plástico que esteja conectada ao regulador de fluxo de dióxido de carbono (CO ₂ ) de uma estação de anestesia de Drosophila .
4. Segure o tambor verticalmente e aperte-o em um suporte de suporte de braçadeira padrão para que o pêndulo permaneça na parte inferior do barril.
5. Modifique uma ponta de pipeta de 200 μL para fazer o suporte da mosca.
   1. Corte 4 mm da ponta para fazer uma abertura de 0,8 mm de diâmetro, permitindo que apenas a cabeça da mosca seja exposta.
      NOTA: o thoRax e todas as outras partes do corpo da mosca permanecerão dentro da ponta da pipeta.
6. Modifique uma ponta de pipeta de 1000 μL e uma tampa de agulha de seringa de 1 mL para fazer o conector.
   1. Cortar 44 mm da abertura da ponta. Pegue um comprimento de 6 mm de uma tampa da agulha de seringa de 1 mL e empurre-o firmemente no segmento restante da ponta da pipeta de 1.000 μL.

2. Operação do Dispositivo de Strike

1. Anestesiar uma única mosca feminina adulta de 2 dias usando CO ₂ em uma almofada de mosca.
2. Mude-o com cuidado para o suporte da mosca usando uma escova fina. Toque o suporte suavemente para que a cabeça da mosca seja vista fora do extremo da ponta. Se a probabilidade de mosca estiver exposta fora da ponta, remova-a suavemente dentro da ponta com uma agulha de seringa de 1 mL embotada.
   NOTA: Certifique-se de manter a probabilidade de mosca dentro do suporte. Caso contrário, a mosca pode morrer por uma lesão de proboscis de sucção.
3. Aperte a mosca hoPara o tambor da seringa com o conector para que a cabeça da mosca esteja voltada para baixo.
4. Ajuste a pressão do gás a 100 kPa. Ajuste o caudal de acordo com o desenho da experiência.
5. Ligue e desligue rapidamente o interruptor alternativo do regulador de fluxo para que o pêndulo acerque a cabeça da mosca uma vez.
6. Levante o suporte da mosca e mova-o sobre uma almofada de mosca. Inverta o suporte da mosca e toque suavemente o lado para deixar a mosca sair. Deixe a mosca em um frasco vazio para se recuperar.

3. Rastreamento de movimento assistido por vídeo

1. Encha uma placa de Petri de 6 cm de diâmetro com elastômero de silício transparente para fazer a arena de rastreamento. Deixe um espaço de 3 mm entre o silício e a tampa do prato para permitir que as moscas caminhem livremente, mas não voam.
2. Anestesiar quatro moscas do grupo sham ou tratado cada vez e colocá-las na arena. Deixe as moscas a 22 ° C durante 1 h.
3. Posicione uma câmera de dispositivo acoplado por carga (CCD) acima das arenas e grave durante 5 min.
4. Analise as trajetórias de movimento gravadas usando o software Ctrax (disponível gratuitamente na Caltech) ¹⁶ . Exporte os dados rastreados em um formato compatível com a linguagem de programação (por exemplo, Matlab) e analise os dados com base na distância percorrida por quadro ¹⁷ . Calcule a distância média a pé para cada mosca e combine-a com todas as outras moscas / grupos gravados para obter uma distância cumulativa média percorrida pela população de arquivos no mesmo grupo.

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Resultados

Para estabelecer um modelo CTE usando Drosophila adulta, determinamos a eficácia do nosso dispositivo ao infligir um único ferimento na cabeça fechada. Para eliminar as variações relativas ao genótipo, ao sexo ou à idade, utilizamos moscas fêmeas Canton-S WT de 2 dias na experiência. Poderíamos facilmente controlar a força do pêndulo, regulando a taxa de fluxo de CO ₂ a uma pressão de gás constante de 100 kPa. As moscas expostas a uma única greve com a ...

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Discussão

Modelos de animais que modelam fielmente as características de CTE, incluindo alterações neurofisiológicas, características neuropatológicas e déficits neurocomportamentais, são essenciais para descobrir mecanismos de doenças e para desenvolver alvos diagnósticos e terapêuticos. É compreensível que nenhum modelo animal de uma doença humana seja perfeito na imitação de todos os pontos finais clinicamente relevantes. No entanto, acreditamos que um modelo CTE robusto deve satisfazer os seguintes três requi...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aerosol Barrier	USA Scientific	1120-8810	Used as an impactor
200 μL Pipette Tip	USA Scientific	1111-0706	Used as a fly head holder
1000 μL Pipette Tip	USA Scientific	1122-1830	Used as a connector
1 mL Tuberculin Syringe	Becton Dickinson	309625
60 mm Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713A	Used as a tracking arenas
Flow Regulator	Genesee Scientific	59-122WC
Standard Clamp Holder/stand	EISCO Scientific	CH0688
Fine Brush	Genesee Scientific	59-204
Flypad	Genesee Scientific	59-114
Sylgard Silicone Elastomer	Dow Corning	4019862
CCD Camera	Microsoft	HD-5000
Ctrax Walking Fly Tracker	Caltech	Ctrax 0.2.11
MATLAB Image Processing Toolbox	MATLAB	R2015b