Um instrumento ultra-sônico para condução nervosa bloquear em modelos de ratos diabéticos

Resumo

Este trabalho apresenta a metodologia de aplicação de alta intensidade com foco ultra-som para bloquear os potenciais de ação dos nervos neuropáticas diabéticos.

Resumo

Bloqueio de condução do nervo com um transdutor de ultra-som centradas em intensidade elevada (HIFU) tem sido realizado recentemente em modelos animais diabéticos e normais. HIFU reversível pode bloquear a condução dos nervos periféricos sem danificar os nervos, enquanto usando um parâmetro apropriado ultra-sônico. Bloco parcial e temporário dos potenciais de ação dos nervos mostra que HIFU tem potencial para ser um tratamento clínico útil para alívio da dor. Este trabalho demonstra os procedimentos para suprimir os potenciais de ação dos nervos neuropáticas em ratos diabéticos na vivo usando um transdutor HIFU. O primeiro passo é gerar ratos neuropáticas diabéticos macho adulto por injeção de estreptozotocina (STZ). O segundo passo é avaliar a neuropatia diabética periférica em ratos diabéticos induzido por STZ por uma sonda de von Frey eletrônico e um prato quente. A etapa final é recorde na vivo extracelular potenciais de ação do nervo exposto a sonication HIFU. O método mostrou aqui pode beneficiar o estudo das aplicações analgésicas de ultra-som.

Introdução

Medicações orais, acupuntura¹, e de estimulação elétrica nervosa² têm sido utilizados para o tratamento da polineuropatia diabética dolorosa. No entanto, os efeitos secundários dos medicamentos orais, operação invasiva de acupuntura e estimulação elétrica nervosa dificultam a eficácia terapêutica e aderência do paciente. Bloco de ultra-som de nervos periféricos em modelos animais foi investigado por décadas^3,4,5. A condução de em vitro nervos ciático do grande sapo verde foi inibida reversível após o tratamento de pulsos de 10-20 da exposição de ultra-som para 0,4 - 1,0 s⁶. Um fator de bloquear a condução nervosa é o aumento de temperatura induzido por ultrassom⁷. Para pacientes com polineuropatia, a supressão dos potenciais de ação muscular composto (CMAPs) realizou-se no nervo peroneal exposto ao ultra-som de baixa intensidade para min 2⁸. O tempo de recuperação completa foi dentro de 5 min.

Recentemente, a Food and Drug Administration dos Estados Unidos aprovaram HIFU como um tratamento não invasivo para miomas uterinos⁹, palliations dor de metástases ósseas¹⁰, e câncer de próstata¹¹. Um transdutor HIFU emite raios acústicos fora do corpo, e os feixes transmitem em várias mídias de tecido e convergem para o tumor do alvo no foco. A zona focal é imediatamente formada para gerar efeitos localizados em tumores de destino sem danificar os tecidos circundantes. HIFU também tem sido aplicada para inibir a condução nervosa ou causar denervação de nervo em experimentos na vivo de normal de ratos Sprague-Dawley (SD)¹². Além disso, os efeitos a curto e a longo prazo de HIFU neuropática nervos foram investigadas¹³. Resultados anteriores demonstraram que o bloco permanente ou reversível da condução nervosa sensorial poderia ser alcançado por HIFU com parâmetros apropriados. Além de aplicações analgésicas, HIFU pode ser usado como uma ferramenta para investigar a contribuição relativa dos componentes periféricos e centrais de bloqueio de condução do nervo para a pesquisa básica de Neurologia e desenvolvimento de medicamentos para as dores. Portanto, carece de uma plataforma de tecnologia bloqueio HIFU específica para nervos periféricos em modelos animais. O objetivo deste artigo é demonstrar os procedimentos para bloquear parcialmente ou completamente aos potenciais de ação dos nervos periféricos em ratos neuropáticas diabéticos por HIFU. Estabeleceram-se modelos do rato diabético e avaliação dos sintomas neuropáticas periféricas. Uma plataforma HIFU e processos experimentais específicos para tratamento de nervos ciático de ratos são apresentados.

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Protocolo

o cuidado Animal institucional e uso Comitê dos institutos nacionais de pesquisa de saúde em Taiwan aprovaram todos os protocolos animais.

1. indução de modelo diabético no masculino adulto Sprague - Dawley (SD) ratos

1. remover pelotas de comida de rato da gaiola para ratos de SD rápido macho (300-350 g) para 6 h antes da indução de STZ.
Buffer de
2. preparar citrato de sódio (0,1 M, pH 4.5).
   1. Dissolver 1,05 g ácido cítrico monoidratado (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O; Astyanax peso 210.14) em 50 mL de água para fazer uma solução de ácido cítrico 0,1 M destilada.
   2. Dissolver 1,47 g citrato trissódico dihidratado (C ₈ H ₅ O ₇ at ₃ · 2 H ₂ O; Astyanax peso 294.12) em 50 mL água destilada água para fazer uma solução de citrato de sódio 0,1 M.
   3. Adicionar 25 mL de solução de ácido cítrico a 25 mL de solução de citrato de sódio. Monitorar o pH do tampão de citrato de sódio (pH 4.5) usando um medidor de pH.
      Nota: A reserva é feita isotônica por adição de um volume adequado de solução de citrato de sódio 0,1 M.
3. STZ dissolver em tampão de citrato de sódio 0,1 M para produzir um 50 mg/mL solução STZ.
   Nota: A solução STZ é sensível à luz, portanto, cobrir a solução STZ com folha de alumínio e usar dentro de 15-20 min.
4. Desenhar a solução STZ 50mg/kg em uma seringa de insulina ou tuberculina 1 mL com agulha de 26 a 28-calibre. Limpe o local da injeção com um pad de etanol e injetar a solução STZ intraperitonealmente o quadrante inferior direito do abdômen para não danificar órgãos abdominais.
5. Fornecer ratos com água de 10% de sacarose como a fonte de água exclusiva para 48 h após a injeção de STZ para prevenir hipoglicemia.

2. confirmação do Diabetes em ratos induzido por STZ

1. Monitor a concentração de glicose plasmática jejum de todos os ratos injetados por STZ post 72 h com um medidor de glicose.
   1. Rápido os ratos diabéticos induzido por STZ para 15 h antes de medir o jejum nível de glicose do sangue.
   2. Conter os ratos em um saco de contenção e expor as caudas para coleta de sangue durante as medições de glicose do sangue.
   3. Usar uma lanceta de sangue para picar a ponta da cauda para obter uma pequena gota de sangue. Coloque a gota de sangue em uma tira de teste de glicose. Gravar os níveis de glicose do plasma jejum.
      Nota: O medidor de glicose detecta e exibe o nível de glicose no sangue em unidades de mg/dL. Excluir os ratos com níveis de glicose jejum abaixo de 150 mg/dL após 2 semanas da STZ-indução.

3. Avaliação da neuropatia diabética periférica em ratos diabéticos

1. avaliar a alodinia mecânica com eletrônica von Frey.
   1. Resposta de retirada de pata de ratos diabéticos habituate STZ induzida em uma gaiola em um piso de malha de metal de diâmetro 1cm por 30 min antes de avaliando o hind.
   2. Usar uma sonda de von Frey eletrônico com ponta rígida (0,8 mm de diâmetro) para aplicar manualmente a pressão à superfície plantar da pata traseira dos ratos e aumentar gradualmente a pressão até que uma resposta de retirada de pata é vista.
   3. Gravar a pressão que mostra sobre o sistema e repita a medição 5 vezes por rato, com um intervalo de 30 s entre cada medição.
2. Avaliar a hiperalgesia térmica com um prato quente.
   1. Se habituar os ratos diabéticos induzido por STZ na chapa quente (24 ± 0,5 ° C) por 10 min antes de avaliar a resposta de dor.
   2. Remover e colocar os ratos volta em suas gaiolas depois de habituação, aqueça a chapa e manter a chapa ' temperatura s 55 ± 0,5 ° C.
   3. Coloque o rato sobre a chapa aquecida ao iniciar simultaneamente o cronômetro.
   4. Quando o rato exibe comportamentos distintos, tais como lamber o hind pata ou anormalmente flicking o hind pata, parar o cronômetro e grava a latência de retirada.
      Nota: Se um rato não expressa comportamentos distintos após 20 s (tempo de corte 20 s), terminar o teste de placa quente e retire a chapa do rato.

4. Na Vivo Bloqueio de condução com o transdutor de HIFU do nervo

Nota: O experimento na vivo começa na semana 5 após injeção de STZ 50mg/kg.

1. Executar procedimentos animais antes de bloquear dos CMAPs com sonication HIFU.
   1. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos (bisturi, tesouras, pinças e gancho de vidro) em um autoclave antes da cirurgia.
   2. Anestesiar os ratos com injeção intraperitoneal de tiletamina/eficiente mistura (40 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) ou através da inalação de 1,75% de isoflurano através de vaporizador de isoflurano. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo.
   3. Posicionar os ratos para cirurgia em prostração ventral. Aplica a pomada. Estique a perna do rato e beliscar a superfície plantar do pé com unhas para determinar a profundidade da anestesia. Se os ratos mostram respostas de retirada, aplicar anestesia adicional.
   4. Remover os pelos da coxa e abaixe para trás os ratos com uma tosquiadeira elétrica. Aplique iodo líquido com gaze limpa no local cirúrgico e circularmente, mover a gaze para o exterior do local cirúrgico. Use uma compressa embebida em álcool para limpar o iodo líquido com o mesmo movimento circular. Esta experiência é realizada no site da esquerda e direita cirúrgica. Repita o procedimento em outro local cirúrgico quando executar o próximo passo do processo.
   5. Use uma tesoura cirúrgica estéril ou bisturi para fazer uma incisão da pele na coxa dorsal. Use uma tesoura cirúrgica romba cuidadosamente separe o tecido debaixo da pele e proteger a pele com pele ganchos. O fêmur pode ser visto dentro dos músculos.
   6. Usar a tesoura para separar cuidadosamente os músculos paralelos ao fêmur até as fibras do nervo ciático de meio da coxa que são incorporadas nos músculos são visíveis. Com cuidado, usar um gancho de vidro para separar o nervo ciático do meio da coxa dos músculos e tecidos conectivos circundantes.
2. Posicionar o nervo ciático na zona focal HIFU usando um fixador de nervo sob medida ( Figura 1 e Figura 3).
   Nota: O fixador de nervo sob medida consiste de 3 componentes ( Figura 3). Todos os componentes são feitos de polimetilmetacrilato (PMMA), transparente. A rosca externa da estrutura superior do componente é 2,5 milímetros de altura e M10XP0.7 ( Figura 4A). O poço central é um 4.0 mm de diâmetro do furo através da componente eu. A abertura do fundo do poço é selada por uma folha de fita. O diâmetro do slot é 1,2 mm e a distância entre o plano central do slot e a superfície superior do componente I é 3,1 mm. II componente consiste em um corpo principal, quatro patas e a estrutura de fundo ( Figura 4B). A rosca interna da estrutura inferior é de 2,5 milímetros de altura e M10XP0.7 para caber o segmento externo do componente eu. O diâmetro do furo central é o mesmo que o poço central de componente eu. As dimensões do corpo principal são 32 mm de diâmetro e 5,4 mm de espessura. Quatro pernas simetricamente são implantadas. Duas pernas curtas idênticas são projetadas para alinhamento e duas pernas longas idênticas trabalham para prender na componente III. O diâmetro externo e a altura do componente III são 41 mm e 9,2 mm. A rosca interna é M36XP1.0 e o furo é 27,5 mm de diâmetro (< forte classe = "xfig"> Figura 4). O cone é um cone oco com a abertura superior de 84 mm de diâmetro e a abertura inferior de 27,5 mm de diâmetro. A altura é de 57,5 mm ( Figura 5A).
   1. Antes do experimento, mergulhe o fixador de nervo sob medida de acrílico em solução de água sanitária para 30-60 min, seguido por imersão em água estéril.
   2. Usando um gancho de vidro, levante o nervo cuidadosamente e colocá-lo na ranhura do componente I.
   3. Componente de parafuso II a componente I. preenchimento central bem do componente com Ringer ' s solução para preservação de propagação e nervo ultra-sônica.
   4. Parafuso componente III para o cone de habitação HIFU. Componente de doca III com componente II por entre as quatro pernas do componente II.
      Nota: O centro geométrico de três componentes e o transdutor estão alinhados. A distância entre o nervo e o transdutor é igual ao comprimento focal, que garante que o nervo está dentro da zona focal HIFU.
3. Inserir um par de agulhas de acupuntura na origem do nervo ciático e o outro par no músculo gastrocnêmio. Conecte cada par de agulhas para o sistema de aquisição de eletrofisiologia através de um cabo coaxial elétrico ( Figura 1).
   Nota: Em uma extremidade do cabo são dois clipes jacaré para juntar duas agulhas separadamente e na outra extremidade do cabo é um conector BNC para ligar o sistema. Os pares de agulhas de acupuntura funcionam como estimulantes eletrodos no nervo ciático e os eletrodos de gravação no músculo gastrocnêmio.
   1. Definir a taxa de amostragem e largura de banda do sistema de aquisição de eletrofisiologia para 50 kHz e 70 Hz - 3 kHz, respectivamente. Aplicar um estímulo máximo supra com uma largura de pulso de 0,1 ms para os eletrodos de estimulação na origem do nervo ciático.
   2. Gravar os CMAPs de eletrodos a gravação e amplificar os CMAPs com o amplificador incorporado no sistema de aquisição de eletrofisiologia.
      Nota: Utilize o amplificador incorporado no sistema de aquisição de eletrofisiologia para amplificar os sinais nervosos e gravar os CMAPs dos eléctrodos de gravação com o sistema de aquisição de eletrofisiologia.
4. Usar um transdutor HIFU comercial 2,68 MHz para suprimir os CMAPs em ratos neuropáticas diabéticos.
   Nota: As especificações do transdutor são descritas da seguinte forma: uma tigela de elemento único esférica com diâmetro de abertura de 6 cm e distância focal de 5 cm e uma zona de elipsoide focal de 4 mm de profundidade e 0,8 mm de largura em espaço livre.
   1. Mergulhar o cone esférico, o transdutor HIFU e o cone de cobrem no tanque cheio de água desgaseificada. Coloque o transdutor HIFU no cone da esférico e fixar a tampa do cone para a abertura superior do cone esférico de 6 parafusos ( Figura 5B). Depois que as bolhas no cone esférico são expelidas naturalmente devido à baixa densidade de bolhas em comparação com água, sele a abertura front-end do cone por uma fita grossa transparente 0,03 mm. Componente de parafuso III sobre o espremedor esférico.
   2. Tirar o transdutor HIFU com o cone esférico e o componente III do tanque de água desgaseificado.
      Nota: A água de osmose reversa utilizada no estudo é a água purificada pelo processo de osmose reversa. A água de osmose reversa é fervida para expelir o gás. Após arrefecimento, a água desgaseificada é obtida em um tanque selado individual.
5. Colocar o componente eu para o espaço entre o nervo e o músculo cuidadosamente e posicione o nervo a lacuna do componente I. executar as etapas 4.2.3 e 4.2.4 para garantir que o nervo está dentro da zona focal do HIFU ( Figura 3A < / forte >).
6. Link um gerador de função e um amplificador de potência de radiofrequência. Ligue o amplificador de potência para o transdutor HIFU para geração do feixe de HIFU. Defina manualmente a saída de tensão do gerador de função para o HIFU transdutor através do amplificador de potência. Manualmente desliga o gerador de função, quando terminar o tempo de exposição de HIFU. Observar o tempo usando um timer.
   Nota: A intensidade e a energia do feixe HIFU utilizado neste estudo são 2.810 W/cm ² e 84 J/mm ², respectivamente.
7. Simultaneamente, fornecer o estímulo através do sistema de aquisição de eletrofisiologia (passo 4.3) e feixe HIFU através do sistema de HIFU (etapa 4.6) ao nervo ciático enquanto gravava os CMAPs. Gradualmente aumentar a exposição HIFU no nervo ciático de 3 s, 5 s, 8 s até observa-se diminuição ou inibição da amplitude do CMAPs.
   1. Registro os CMAPs uma vez por segundo durante a entrega de HIFU o feixe. Depois de observar a mudança na amplitude de CMAPs, desligue o sistema HIFU e manualmente, clique no ícone do registro do software de aquisição de eletrofisiologia para registro CMAPs cada 2 min nos primeiros 10 min, cada 5 min em consecutivo 30 min e a cada 10 minutos na última fase até o tempo de gravação atinge 2 h.
8. Componente separado II e III do fixador nervo ( Figura 3) para remover o transdutor HIFU do local da incisão. Componente separado II e para liberar o nervo ciático protegido. Sutura do local cirúrgico do rato diabético por suturas de catgut crómico 4-0 depois de gravar os CMAPs. Aplica iodo líquido para o sítio cirúrgico para prevenir a infecção.
   1. Coloque as gaiolas na rampa de aquecimento e deixe que os ratos recuperar em suas gaiolas antes de retorná-los para as instalações de animais. Fornecer os ratos com ibuprofeno em água potável para 3 dias ou injeção intraperitoneal de buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg).
9. Inserir eletrodos estimulantes e gravação na origem do nervo ciático e os músculos gastrocnêmio de ratos anestesiados de neuropáticas diabéticos, conforme descrito nas etapas 4.1.2 e 4.3 nos dias 7, 14 e 28 após o inicial sonication HIFU. Repita as etapas para 4.3.1 4.3.2.
   1. Coloque as gaiolas na rampa de aquecimento e deixe que os ratos recuperar em suas gaiolas antes de mover as gaiolas para as instalações de animais.
10. Eutanásia em ratos após o experimento. Coloque o rato em uma câmara de dióxido de carbono. Espere cerca de 5 min para os ratos parar de respirar. Certifique-se de que o coração parou de bater.

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Resultados

O estudo na vivo demonstrou que, com uma dose HIFU de 3 sonication s em uma intensidade de 2.810 W/cm², os CMAPs foram suprimidos por 20% da linha de base, mas eles foram completamente recuperados após 30 min (Figura 2A, diamantes) e foram quase constante no período de 28 dias (Figura 2B, diamantes). Para a exposição HIFU de s 5 na mesma intensidade, os CMAPs diminuíram para 65,4% (9,5%) da linha de base ...

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Discussão

Supressão parcial e temporária de action potentials dos nervos neuropáticas de ratos diabéticos na vivo e ocorrência instantânea do efeito de bloqueio após o tratamento de HIFU, que ambos foram observados. O estudo de acompanhamento de 28 dias na CMAPs demonstrou que um bloqueio seguro de condução do nervo pode efectuar-se em uma exposição adequada de HIFU. Como resultado, o protocolo acima do tratamento HIFU pode fornecer uma solução alternativa para o bloqueio reversível da condução dos nervos ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200