PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Resumo

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pH_eu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

Resumo

Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pH_eu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celular_eu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pK_um adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pH_i em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H⁺) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.

Introdução

O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pH_i) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H⁺ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave¹. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolicamente ativas células principais com distintas apicais (luminal) e polaridade basolateral (hemocoel), bem como células estreladas intercaladas. MTs anteriores são compostas de 3 morfologicamente, funcionalmente, e mentalmente distintos segmentos, nomeadamente a inicial dilatadas segmento, segmento de transição e secretora segmento principal, que se junta ao ureter². Na escala celular transporte trans-epitelial íons no lúmen é realizado por uma membrana plasmática apical V-ATPase³ e um cambista do alcaloide-metal/H⁺ , bem como um basolateral at⁺-⁺K-ATPase⁴, aperfeiçoamento activo-retificador K⁺ canais⁵, at⁺-conduzido Cl⁻/HCO₃⁻ cambista (NDAE1)⁶e Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, enquanto células estreladas mediam Cl^– e transporte de água^8,9. Este sistema fisiológico complexo mas acessível oferece excelentes oportunidades para a investigação de mecanismos de transporte de íon endógena quando combinado com diversos fatores genéticos e comportamentais conjuntos de ferramentas de Drosophila.

A justificativa para este protocolo foi descrever um sistema geneticamente maleável para estudar o transporte de íons epitelial com potencial para a integração do celular para o comportamento e exportação de ferramentas para outros sistemas de modelo. Expressão de pHerry¹⁰, uma GEpHI derivada de uma fusão de verdes sensíveis ao pH super eclíptica pHluorin^11,12 (SEpH) e vermelho mCherry diferenciação de pH¹³, em MTs permite a quantificação de transporte H⁺ , em células únicas MT através da alta K⁺/nigericin calibração técnica¹⁴. Como muitos transportadores de iões mover equivalentes de H⁺ , quantificação de pH intracelular serve como uma representação funcional do movimento de iões através de uma variedade de transportadores. O modelo de sistema de Drosophila MT também oferece ferramentas poderosas de genéticas em tecido-específica do transgene¹⁵ e RNA interferência (RNAi)¹⁶ expressão, que pode ser combinado com o celular imagens e ensaios todo-órgão^{17 , 18 , 19} da função do túbulo para criar um conjunto de ferramentas robusto com integração vertical das moléculas de comportamento. Isto contrasta com muitos outros protocolos para avaliação biologia epitelial, como historicamente, tais medidas têm confiado na intrincada e assustadora micro-dissecção, sofisticado eletrodos íon-seletivos^20,21, e sensíveis ao pH caro tinge²² com requisitos de carga restritiva e pobre especificidade celular em tecidos heterogêneos. GEpHIs têm sido utilizados para medir o pH_eu em uma variedade de tipos de célula²³extensivamente. Primeiros trabalhos exploraram a pH-sensibilidade inerente de proteína fluorescente verde (GFP) para monitorar o pH_eu em culturas de células epiteliais²⁴ mas nas duas últimas décadas viram GEpHIs usado em neurônios²⁵, glia²⁶, fungos²⁷ , e células de plantas²⁸. A combinação do potencial de segmentação celular de construções genéticas através da expressão de GAL4/UAS sistema¹⁵ e a acessibilidade fisiológica de MT a drosófila isto fazer uma preparação ideal para investigações de pH_eu regulamento e transporte de íon epitelial.

pH_eu regulamento tem sido estudado há décadas e é vital para a vida. A preparação de MT oferece um modelo robusto de ensinar fisiologia do Regulamento pH_eu mas também realizar sofisticadas investigações de pH_i Regulamento ex vivo e in vivo. Este protocolo descreve a quantificação do movimento H⁺ através da membrana basolateral das células epiteliais da drosófila MT usando o NH₄Cl ácido de pulso técnica²¹a carregar, mas como o indicador de pH é geneticamente codificado, esses métodos e o seu enquadramento teórico podem ser aplicados a qualquer preparação passível de transgênese e geração de imagens ao vivo.

Protocolo

Todas as etapas neste protocolo estar em conformidade com as diretrizes de uso de animais da clínica Mayo (Rochester, MN).

1. criação de voar

1. Aumento voa e conjunto cruza de acordo com o padrão de criação²⁹.
   Nota: A expressão fluorescente repórter pelo sistema GAL4/UAS é proporcional à temperatura e, portanto, a criação da temperatura pode ser ajustada para alterar o nível de expressão. Enquanto os níveis de alta expressão muitas vezes levam a uma melhor relação sinal-ruído esta condição também é associada com aumento citosólico e organellar agregados quando usando as boas práticas agrícolas para fusão de proteína fluorescente vermelha (RFP) constrói como pHerry^{10, 30,31}. Se a agregação é inevitável, quantificação ainda é possível através da realização de calibrações no ponto em cada experimento e normalização de dados tais que uma proporção de fluorescência de 1.0 corresponde ao pH_eu 7.0 (ver passo 7.4 nota na calibração abaixo).
2. Conjunto de cruzes de homozigotos capaR-GAL4³² machos homozigotos UAS-pHerry¹⁰ fêmeas virgens e homozigotos c724-GAL4² machos às fêmeas virgens de homozigotos UAS-pHerry para permitir imagens de pH em células principais e células estreladas de MT, respectivamente. Lugar 6 UAS-pHerry fêmeas com 3 machos GAL4 dentro dos frascos de frescos de comida e deixar de acasalar a 28 ° C.
   Nota: As larvas devem ser evidentes dentro de 4D e adultos começará a eclose próximo dia 10.
3. Colete femininas moscas em cima de eclosão e reserve a idade para d 10 a 28 ° C.
   Nota: O tempo de experimentação pode ser ajustado para corresponder à qualquer restritivos ensaios comportamentais (como o Ramsay secreção ensaio^17,19) que vão ser correlacionados a imagem latente do pH intracelular de ao vivo. Moscas masculinas podem ser usadas mas túbulos das fêmeas são geralmente maiores e mais robusta.

2. preparação de lâminas de poli-L-lisina.

1. Desenhar uma borda de 40 x 20 mm com uma caneta PAP hidrofóbica ao redor do topo de slides padrão 75 x 25 mm e Reserve secar durante 15 min em lamelas de grande uso de RT. se as lâminas não são compatíveis com imagem latente ótica.
2. 2 ml da solução de poli-L-lisina (PLL) de 0,01% das ações para cada slide e reserve por 1h no RT
3. Remova o excesso PLL com uma pipeta. Salve a solução em um frasco de 50 mL cônica para uso futuro. Loja a 4 ° C.
4. Aspire qualquer solução restante com uma linha de vácuo. Execute a linha de vácuo sobre a superfície inteira do slide para que permaneça sem solução nos slides.
5. Defina os slides lado por 1h adicional à antes da RT para usar. Armazene os slides seca em RT até 1 mês em um livro de slide padrão.

3. preparação do prato e hastes de vidro de dissecação

1. Adicione 0,5 mL de agente de cura de elastômero de 4,5 mL de elastômero base em poliestireno um 35 x 10 mm placa de Petri em RT para produzir uma profundidade de 5 mm. misture com a ponta da pipeta descartável. Permitir que o elastômero curar O/N em RT
   Nota: Elastômero deve ser clara e livre de bolhas. Clareira de bolhas pode ser facilitada pela manter placas de elastômero em um frasco de vácuo para 10-15 min depois de derramar.
2. Segure uma vareta de vidro de diâmetro de 5 mm entre as mãos e derreta o centro da haste em um bico de Bunsen aceso enquanto puxa as extremidades separados. Como o vidro derrete puxa mais rapidamente para produzir um fino (0,1 mm) e o eixo cônico (Figura 1).
   Nota: Um ângulo de 45 ° na haste da é frequentemente útil no tratamento de túbulos. Isto pode ser conseguido através de uma redução de uma mão como a haste é puxada (ver Figura 1).
3. Quebre a haste fina no meio com o lado sem corte de uma lâmina de aço carbono com arestas único. Inspecione a extremidade fina da haste em um escopo de dissecação para garantir que o tempo está limpo.

Figura 1: Fabricação de hastes de vidro para a manipulação de túbulos de Malpighi.
A - E. Processo de aquecimento e puxando uma vareta de vidro para produzir um atarraxamento e ângulo adequado para manipulação mts. setas indicam direção e magnitude da força a ser aplicada. F. fotografia de uma ferramenta de vidro fabricada adequadamente. Barra de escala = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. preparação de soluções e sistema de perfusão

Nota: Sistemas de perfusão diferem pelo fabricante. Este protocolo é baseado em torno de um reservatório aberto 8 canais de gravidade-alimentado com um regulador de taxa de fluxo de entrada e uma saída controlado por vácuo, mas o método de montagem que MTS conforme descrito aqui podem ser adaptados para funcionar com qualquer sistema de perfusão.

1. Prepare as seguintes soluções:
   1. Do alíquota Schneider médio (40 mL dentro dos frascos de Erlenmeyer de 50 mL) e em 4 ° C.
   2. Preparar soluções (ou seja, o inseto Phosphate-Buffered salina (iPBS) e iPBS com NH₄Cl) em RT conforme necessário de acordo com a tabela 1). Soluções warm para RT antes de usar no dia do experimento.
      Nota: iPBS e iPBS com 40mm NH₄Cl pode ser preparado em grandes volumes (1 L ou mais) e armazenadas a 4 ° C.
   3. Preparar 8 soluções de calibração em volumes de 500 mL pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 e 9.0, conforme indicado na tabela 1 e em 4 ° C. Ajuste o pH de cada solução por titulação com N-metil-D-glucamine (NMDG) e HCl.
   4. No dia de experimentos, aquecer alíquotas de 5 mL das soluções de calibração para RT e adicionar solução de nigericin de estoque (20 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)) para produzir uma concentração final de 10 µM.
      Atenção: Lidar com nigericin com luvas. Trate todos os equipamentos que entra em contato com nigericin como descartável. Nigericin permanece em vidro e plástico e comprometam preparações biológicas se o equipamento está sendo reutilizado.
2. Sistema de perfusão:
   1. Encha o sistema de perfusão através do preenchimento de todos os reservatórios com O ddH₂(Figura 2). Abra os canais, um de cada vez para permitir que todas as linhas proximal para o regulador de taxa de fluxo para preencher.
      Nota: Pode ser necessário limpar o ar nas linhas abrindo o canal paralisado e usando um êmbolo ao fluxo de movimentação do reservatório.
   2. Abra 2 canais e permitir o ddH₂O drenar. Uma vez que os reservatórios estão quase vazios, encha o reservatório de primeiro com iPBS e o segundo reservatório com NH₄Cl-pulsada iPBS. Definir a taxa de fluxo ao máximo com o regulador de taxa de fluxo e permitir que cada solução a fluir por 1 min preencher as linhas distais e, em seguida, interromper o fluxo (Figura 2).
   3. Posição 2 conjuntos de solda grampos "dando uma mãozinha" na cena de imagem do microscópio. Coloque um grampo em cada lado da plataforma de imagem.
   4. Aquecer cuidadosamente as 0,5 polegadas distais de um pedaço de vidro capilar (diâmetro interno de 1.5 mm, diâmetro externo 0,86 mm, comprimento 100mm) sobre um bico de Bunsen. Crie uma curva de 45 °, permitindo que a extremidade distal dobrar pela gravidade e remover o vidro da chama, uma vez atingido o ângulo desejado. Repita este processo com um segundo pedaço de vidro capilar.
   5. Inserir os capilares de vidro vergado no fluxo em linha e linha de saída conectado a vácuo, respectivamente e montá-los nas mãos de"ajudar" para alinhá-los com o estágio de imagem do microscópio (Figura 3).

Figura 2: Sistema de perfusão e configuração de imagem.
Componentes necessários para a avaliação fisiológica da função de transporte MT basolateral através de simultânea ao vivo troca de solução de imagem e rápida de fluorescência. Linhas de gás mostradas são opcionais e permitam a expansão de experiências para a avaliação do transporte HCO₃^– . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diagrama esquemático do fluxo de perfusão aparelhos para NH₄Cl pulso experimentos.
As setas mostram caminho de fluxo e válvula de comutação pontos. Solução se move do reservatório a amostra por fluxo de gravidade e é desenhada da câmara de amostra para o balão de resíduos por sucção à vácuo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. dissecação de túbulos de Malpighi Anterior adulto drosófila .

1. Recolher o prato de dissecação e puxei a vareta de vidro da seção 3, um slide PLL-revestido da secção 2, um adesivo divisor de perfusão-bem, vácuo graxa, uma 4 x 2" tira de filme de selagem, 2 pares de #5 finas fórceps e alíquotas de 40 mL do gelado Schneider médio e RT iPBS.
2. Espalhe a graxa vácuo na fita da selagem e pressione o adesivo divisor de perfusão-bem para a fita para revestir o fundo com graxa. Descole o adesivo divisor de perfusão-bem e coloque graxa-lado-para baixo em cima de um slide revestido de PLL. Retire o divisor de perfusão-bem para deixar cada amostra poços traçados a graxa hidrofóbica.
3. Lugar 200 µ l de iPBS de RT na graxa-cercado bem no slide revestido PLL e deslocar o carro sob o estereoscópio.
4. Moscas UAS-pHerry/capaR-GAL4 lugar em um vazio voar frasco e anestesia no gelo por 10 min.
   Nota: Este método de anestesia, ao contrário de CO₂, assegura que as moscas não desidratar.
5. Despeje o prato de dissecação médio do Schneider gelada e use pinça fina para transferir uma única mosca feminina anestesiada para a placa sob um estereoscópio dissecação.
6. Segure a mosca pelo tórax com um conjunto de pinças e usar o outro para segurar suavemente a parte posterior do abdômen. Abra a parte posterior da mosca usando a pinça, em suma, moções deliberadas. Uma vez que o intestino grosso é visível, segure a extremidade distal e libertar o intestino e MTs os subjacentes tracheoles puxando o intestino posterior, longe do corpo através de rebocadores repetitivos, breves.
   Nota: Os anteriores e posteriores MTs será visível onde se encontram com a junção do intestino grosso através do ureter e intestino. O primeiro par de MTs para ser livre arbítrio provável ser túbulos posteriores como eles cercam o intestino grosso. Estes podem ser ignorados (Figura 4A).
7. Beliscar fora os anteriores MTs no ureter com pinça fina uma vez que o segundo conjunto de MTs é livre do abdômen. Isto irá separar os MTs anteriores do intestino e fechar o ureter.
8. Pega os MTs livre anteriores com a vareta de vidro puxado deslizando a haste sob o ureter, tal que os túbulos cair para o outro lado. Levante os MTs em linha reta fora da solução.
9. Transformar a vareta de vidro, tal que o MTs e ureter são respeitados na parte inferior da haste e descer o ureter diretamente para o slide. Apor o ureter e selar as extremidades distais dos MTs pressionando o ureter baixo a lâmina de vidro (Figura 4B). Não manipule os MTs mais que o necessário. As MTs devem ser flutuar na solução com o ureter ancorado no slide.
10. Use bem final da haste de vidro para varrer suavemente cada túbulo através da superfície do slide. Segure a vara contra o slide para evitar o esmagamento do túbulo e deslize a haste no topo do túbulo, movendo-se distal para proximal, para anexar o comprimento total de cada túbulo à superfície do slide PLL-revestido (Figura 4).
11. Coloque o adesivo divisor de perfusão-bem novamente no slide para formar um pequeno cheio de líquido ao longo do túbulo montado.
12. Coloque a amostra no palco microscópio. Posicione o influxo e capilares de saída sobre a entrada e a abertura de saída da perfusão bem, respectivamente.
    Nota: O divisor bem pode ser deixado se uma câmara aberta perfusão é desejada. Neste caso, os capilares de entrada e saída podem ser alinhados para lados opostos de uma imagem bem.

6. validação de imagem protocolo e túbulo saúde

Nota: Este protocolo é realizado em um microscópio de epifluorescente invertido de campo amplo com GFP (SEpH) e conjuntos de filtros RFP (mCherry) (excitação de 470/40 nm (ex), emissão de longpass 515 nm (em), 500 nm nm dicroicas e 546/10 ex em de longpass 590 nm, 565 nm dicroicas), um 10 X / 0.45 ar objetivo, uma câmera monocromática para captura de imagem ao vivo e software de imagem. O protocolo pode ser adaptado para qualquer posição vertical ou microscópio invertido com filtro automático comutação entre as boas práticas agrícolas e RFP óptica e imagem software de aquisição, embora as parâmetros, intensidade de luz e tempos de exposição ideal variará. Em todas as análises, a intensidade de fluorescência deve ser analisada como a intensidade do pixel média na região de interesse (ROI), após subtração do fundo em cada canal usando um ROI com não contém nenhuma fluorescência adjacente ao sinal ROI.

1. Ligue o microscópio, fonte de luz e sistema de imagem.
2. Software aberto de imagem associado.
3. Olhe através da ocular e ajustar o foco manualmente até o lúmen do MT é claramente visível sob luz transmitida.
4. Clique na opção "Aquisição" no software de análise de imagem e selecione "2 x 2" no menu suspenso "Binning" na seção "Modo de aquisição".
5. Inserir um filtro de densidade neutra de 5% para o caminho de luz para reduzir a luz de iluminação e minimizar fotobranqueamento.
6. Clique no canal GFP (SEpH) no menu "Canais" e, em seguida, clique em "Live" para observar o sinal fluorescente através da câmera.
7. Ajuste o controle deslizante "Tempo" para definir o tempo de exposição, tais que os valores de pixel mais brilhantes no histograma intensidade são cerca de 40% do valor máximo e, em seguida, clique em "Stop" para parar a iluminação.
8. Repita etapas 6.6-6,7 no RFP (mCherry) canal e confirmam a presença do segmento inicial dilatada de MT a anterior e a ausência de mCherry citosólica agrega (indicativa de dano tecidual ou superexpressão) (Figura 4).
   Nota: O segmento dilatado deve ser evidente, como é o segmento mais proximal do túbulo e o diâmetro do lúmen interno deste segmento é maior do que a do segmento adjacente transitório de ~ 20 µm. 2 x 2 pixel binning, muitas vezes é suficiente, mas pode ser aumentado para reduzir a intensidade de iluminação exigida. Tempos de exposição típicas são entre 150 e 800 ms/canal. Use como pouca luz possível para minimizar o fotobranqueamento. Minimizar o fotobranqueamento é vital para a utilização de indicadores de dual-fluoróforo como pHerry como os dois fluorophores pode descorar independentemente, invalidando assim qualquer calibração de relação.
9. Habilite um lapso de tempo protocolo de imagem clicando na caixa de seleção "Séries temporais".
10. Ajuste a "duração" no menu suspenso na seção "Séries temporais" para 10 min e o slider de "Intervalo" de 0 para definir o tempo de captura total com uma taxa de aquisição de imagem máxima. Uma taxa de aquisição total de 0,2 Hz é muitas vezes suficiente.
11. Verifique a GFP (SEpH) e caixas RFP (mCherry) na seção de "Canais".
12. Abra a linha de iPBS do sistema de perfusão ativando o controlador de válvula apropriada e iniciar o protocolo de imagem clicando em "Iniciar experiência." Depois de 1 min, alterne para NH₄Cl solução de pulso por 20 s abrindo a válvula apropriada e fechando a linha iPBS, em seguida, retornar para iPBS fechando o NH₄Cl linha e reabrindo a válvula iPBS. Permitir que o protocolo de imagem completo completar antes de interromper o sistema de perfusão.
    Nota: Análise de lapso de tempo deve revelar um sinal mCherry estável e um sinal de SEpH que aumenta na presença de NH₄Cl, sacia com esmaecimento e recupera gradualmente.
13. Realize uma calibração de 2 pontos.
    1. Retire o divisor bem descascando-lo longe do slide subjacente e retire a imagem bem os grampos e capilares de perfusão.
    2. Aplica a imagem bem com uma pipeta de 200 µ l 200 µ l calibração iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin). Remover a solução da imagem bem com a pipeta e, em seguida, substitua por outro 200 µ l de solução de calibração. Repita este processo 4 vezes para garantir a troca da solução completa.
    3. Incube a preparação em solução de calibração para 30 min antes de imagem. Repito o protocolo de imagem usando os mesmos parâmetros determinados nas etapas 6.6-6.11, com a modificação de apenas 1 min da imagem de captura.
       Nota: O sistema de perfusão e capilares não são necessários nesta etapa e não deve ser ligados à imagem bem para evitar expor os capilares para nigericin.
    4. Adicione 200 µ l calibração iPBS (pH 9.0, 10 nigericin µM) para a imagem bem com uma pipeta de 200 µ l. Remover a solução da imagem bem com a pipeta e, em seguida, substitua por outro 200 µ l de solução de calibração. Repita este processo 4 vezes para garantir a troca da solução completa.
    5. Incube a preparação da solução de calibração segundo por 10 min antes de imagem. Repeti o protocolo de imagem como na etapa 6.13.3.
    6. Examine a pilha de imagem capturada em software de análise de imagem para confirmar que nenhum pixel em qualquer canal é saturada clicando em "Significa ROI" e rolagem embora a pilha de imagem com o controle deslizante "Frame", observando que não há valores relatados no histograma intensidade atingir o valor máximo detectável. Se quaisquer quadros contêm pixels que atingem a intensidade máxima detectável, reduza a intensidade de tempo ou iluminação de exposição e repetição seção 6.
       Nota: Uma vez estabelecida não altere parâmetros de imagem entre experiências ou calibração a menos ponto calibrações devem ser usados em cada preparação (ver passo 8.3).
14. Analise a pilha de imagem para plotar a intensidade fluorescente e relação de fluorescência (SEpH/mCherry) em função do tempo.
    1. Clique em "Quer dizer ROI" e selecione a ferramenta de forma livre. Segure o botão esquerdo do mouse para rastrear um ~ 50 µm Comprimento do Mt. Clique com o botão direito para terminar o ROI de desenho e, em seguida, repita em uma área adjacente a MT para definir um fundo ROI (Figura 5A).
    2. Clique em "Intensidade significa" sob "Medições". Criar uma tabela de valores de intensidade, clicando em "Exportar > tabela de dados > criar."
    3. Clique no ícone de roda dentada de configuração e desmarcar todos os parâmetros, exceto o "Tempo" e "Significa intensidade." Guia para a tabela de dados recém-criado com o botão direito, selecione "Salvar como" e exportar os dados como um arquivo. csv.
       Nota: As medições semelhantes também podem ser feitas usando o software livre como o ImageJ.
    4. Abrir uma tabela de planilha e importar a tabela de dados selecionando a aba "Dados" seguida por "De texto".
    5. Use funções na planilha para subtrair a intensidade de fundo SEpH de intensidade de sinal o SEpH em cada ponto de tempo. Repita este processo para o sinal de mCherry.
    6. Plotar cada intensidade do canal em função do tempo, selecionando as colunas contendo o tempo e dados de intensidade de correção de fundo e em seguida, clicando em "Inserir > Scatter (gráficos) > dispersão com linhas retas" (Figura 5B).
    7. Use funções de planilha para calcular a proporção de fluorescência SEpH/mCherry em cada ponto de tempo.
    8. Relação de fluorescência trama em função do tempo, selecionando as colunas que contêm os dados de tempo e proporção e em seguida, clicando em "Inserir > Scatter (gráficos) > dispersão com linhas retas" (Figura 5).

7. completa calibração de pHerry em túbulos de Malpighi Ex Vivo.

1. Dissecar e montar um novo conjunto de MTs anteriores, conforme descrito na seção 5.
2. Trocar iPBS para calibração iPBS (pH 7,4, nigericin de 10 µM), conforme descrito na etapa 6.13.2. Incube durante 30 min.
3. Localize os MTs e coletar os pares de imagens SEpH/mCherry conforme descrito nas etapas 6.1-6.11. Substitua a solução com outro estoque de calibração iPBS conforme descrito na etapa 6.13.4, esperar 10 min e a imagem novamente. Repita este processo até que a proporção de SEpH/mCherry tem sido fotografada em todas as soluções. Obter pH 9,0 imagens última como o espécime raramente se recupera de pH elevado.
4. Plotar rácio de fluorescência de SEpH para mCherry de calibrações em oito amostras em função do pH imposta_eu conforme descrito na etapa 6.14.9. Ajuste os dados de calibração com uma curva de Boltzmann para obter a função de calibração completa de acordo com a equação 1 (Figura 5). Se dados são inconsistentes, plotar conjuntos de calibração de cada amostra normalizada de tal forma que uma relação de fluorescência de 1.0 corresponde ao pH_i 7.0 e re-analisar (Figura 5E).
   Nota: Se o último processo é necessário experiências individuais terá seu próprio ponto interno calibrações³³ (ver procedimento de quantificação abaixo (etapa 8.3)).
5. Equação 1
   
   Onde R = relação SEpH/mCherry e um₁,₂, x_óe dx é curva encaixe parâmetros que representam a proporção mínima de fluorescência, fluorescência máxima relação, pK_ume largura da função respectivamente. x_o = aparente pK_um de pHerry, que pode variar entre 7.1 e 7.4 dependendo do tipo de célula e as condições de calibração exata.

8. quantificação de ácido Basolateral extrusão do epitélio do túbulo de Malpighi Ex Vivo .

1. Células estreladas pHerry-expressando de imagem e diretor pHerry-expressando células simultaneamente.
   1. Dissecar MTs anteriores de uma mosca UAS-pHerry/capaR-GAL4 , conforme descrito na seção 5, mas não a transferência MTs de meio a dissecação Schneider para a geração de imagens bem.
   2. Disse MTs anteriores de uma mosca UAS-pHerry/c724-GAL4 no mesmo prato dissecação usando o procedimento descrito na seção 5.
   3. Transferi os 2 conjuntos de MTs para a mesma imagem bem como descrito nos passos 5.8-5.11.
      Nota: Quando varrendo os braços das MTs até o slide, coloque os MTs da UAS-pHerry/c724-GAL4 e túbulos UAS-pHerry/capaR-GAL4 perto uns dos outros por células estreladas e principais pHerry-expressando podem ser visualizadas no mesmo campo ( Figura 6A).
2. Aplica o NH₄Cl prepulse conforme descrito na etapa 6.12.
   Nota: Se não será possível calibração consistente (Figura 4B), realizar uma calibração de ponto definindo pH_i para 7,0 ao final de cada experimento com calibração iPBS (pH 7.0, 10 µM nigericin, incubação de 30 min) após o adesivo divisor de perfusão-bem e o equipamento de perfusão foram removidos.
3. Calibrar os traços de células estreladas e principais dos diferentes segmentos de MT (usando a proporção absoluta ou normalizada conforme apropriado) com a equação 2 e analisar a fase de recuperação depois de NH₄Cl retirada aplicando as funções de decaimento exponencial usando software de análise estatística e salientando a constante de decaimento (τ) (Figura 6B).
   Equação 2
   
   Onde R = relação SEpH/mCherry e um₁,₂, x_óe dx é curva encaixe parâmetros determinados pela calibração na etapa 7.4 (equação 1).
   1. Calcule a taxa de ácido extrusão (J_{H +}, ver equação 3) em função do pH_eu para dar conta das variações de pH_eu e ácido carregando entre preparações³⁴a descansar. Use as funções exponenciais derivadas na etapa 8.3 para calcular a derivada de pH_eu em relação ao tempo em cada intervalo de tempo.
      Equação 3
      
   2. Calcular a capacidade intrínseca de buffer (β_i; Equação 4) do citosol para o pH, desde o início de cada intervalo na etapa 8.3.1 baseada na literatura anterior (ver equação 4).
      Nota: Em Drosophila, a mais completa caracterização de β, vem do nervo motor larval terminais³⁵ e estes dados podem-se supor para segurar por células de MT na ausência de outros dados disponíveis.
      Equação 4
      
   3. Calcule o produto de β_T (da etapa 8.3.2)_e dpH_eu/DT. (da etapa 8.3.1) para determinar J_{H +} (equação 3).
      Nota: Em soluções de bicarbonato nominalmente livre como os descritos no presente protocolo, capacidade tampão bicarbonato-derivado (β_b) presume-se ser ~ 0 mM. Capacidade (β_T) tampão de total é a soma de β_eu e_βbe, portanto, β_{eu =} β_T na ausência de HCO₃^–/CO₂³⁶.
   4. Plot J_{H +} em função do pH no início de cada intervalo de tempo, conforme descrito na etapa 6.14.9.
   5. Aplica funções de decaimento exponencial para a parte de todos os conjuntos de dados que se sobrepõem no pH_eu usando software de análise estatística. Compare taxas de alteração das funções resultantes para comparar taxas de extrusão ácido entre células e segmentos MT (Figura 6).
      Nota: A função mais adequada utilizada para o encaixe de curva não pode sempre ser um único exponencial. Outras funções podem ser substituídas se elas melhoram a bondade de ajuste.
   6. Calcular o ácido flux (ver equação 5), em função do pH_eu para dar conta das variações de forma e tamanho da célula.
      Equação 5
      
      Nota: Dimensões da célula podem ser medidos diretamente em imagens ou aproximados. Células principais podem ser representadas como as metades de um tubo oco, com as seguintes dimensões: diâmetro interno 24 µm; diâmetro exterior 48 µm; altura 50 µm. transitório células estreladas são variáveis, mas podem ser representadas aproximadamente como cilindros com diâmetros de 10 µm e alturas de 50 µm. Ver o parágrafo final do Representante resultados abaixo.
   7. Aplica funções de decaimento exponencial para a parte de todos os conjuntos de dados que se sobrepõem no pH_eu usando software de análise estatística. Compare taxas de alteração das funções resultantes para comparar ácidos fluxos entre células e segmentos MT (Figura 6).

Resultados

Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A– B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como...

Discussão

O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A – C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.