Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

Resumo

Apresentamos um novo método que usa copolímeros de blocos foto-responsivos para um controle spatiotemporal mais eficiente do silenciamento gênico sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Além disso, as mudanças na expressão gênica podem ser previstas usando ensaios diretos de liberação de siRNA e modelagem cinética simples.

Resumo

São necessários novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação de ácidos nucleicos para uma ampla gama de aplicações que requerem uma regulação precisa da atividade gênica. Em particular, os novos materiais responsivos aos estímulos com controle espaciotemporal melhorado sobre a expressão gênica destravam plataformas traduzíveis em tecnologias de descoberta de drogas e medicina regenerativa. Além disso, uma capacidade aprimorada para controlar a liberação de ácido nucleico a partir de materiais permitiria o desenvolvimento de métodos simplificados para prever a eficácia do nanocarrier a priori , levando a triagem acelerada dos veículos de entrega. Aqui, apresentamos um protocolo para prever a eficiência de silenciamento gênico e alcançar o controle espaciotemporal sobre a expressão gênica através de um sistema nanocarrier modificador fotossensível modular. O pequeno ARN de interferência (siRNA) é complexado com mPEG- b- poli (metacrilato de 5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobenzilo) (mPEG- b- P (APNBMA)) paraRm estabilidade nanocarriers que podem ser controlados com luz para facilitar sintonizável, on / off siRNA libertação. Descrevemos dois ensaios complementares que utilizam espectroscopia de correlação de fluorescência e eletroforese em gel para a quantificação precisa da liberação de siRNA a partir de soluções que imitam ambientes intracelulares. As informações obtidas a partir desses ensaios foram incorporadas em um modelo cinético simples de RNAi (RNAi) para prever as respostas de silenciamento dinâmico a várias condições de fotoestimulação. Por sua vez, essas condições de irradiação otimizadas permitiram o refinamento de um novo protocolo para controle espacial controlando o silenciamento gênico. Este método pode gerar padrões celulares na expressão de genes com resolução célula a célula e sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Em conjunto, nossa abordagem oferece um método fácil de usar para prever mudanças dinâmicas na expressão gênica e controlar com precisão a atividade de siRNA no espaço e no tempo. Este conjunto de ensaios pode ser facilmente adaptado para testar uma grande variedade de otSeus sistemas responsivos ao estímulo para abordar os principais desafios pertinentes a uma multiplicidade de aplicações em pesquisa biomédica e medicina.

Introdução

Os pequenos ARNs de interferência (siRNAs) medeiam o silenciamento de genes pós-transcrição através de uma via de RNAi catalítica que é altamente específica, potente e adaptada a praticamente qualquer gene alvo ¹ . Essas características promissoras permitiram que a terapia com siRNA avançasse em ensaios clínicos em humanos para o tratamento de numerosas doenças, incluindo melanoma metastático e hemofilia ^{2 , 3} . No entanto, persistem persistentes problemas de entrega que prejudicaram a tradução ⁴ . Em particular, os veículos de entrega devem permanecer estáveis ​​e proteger siRNAs de degradação extracelular, mas também liberar a carga útil no citoplasma ⁵ . Além disso, muitas aplicações de RNAi requerem métodos aprimorados para regular o silenciamento de genes no espaço e no tempo ⁶ , o que reduzirá os efeitos colaterais na terapêutica com siRNA ⁷ e possibilitará transformar aDvances em aplicações que vão desde microarrays celulares para a descoberta de drogas ⁸ até a modulação de respostas celulares em andaimes regenerativos ⁹ . Esses desafios destacam a necessidade de novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação nos nanocarriers de siRNA.

Uma das estratégias mais promissoras para controlar a liberação de siRNA e melhorar a regulação espaciotemporal é o uso de materiais sensíveis ao estímulo ¹⁰ . Por exemplo, uma grande variedade de biomateriais foram projetados com afinidade de ligação de ácido nucleico variável em resposta ao potencial redox ou pH alterado, ou campos magnéticos aplicados, ultra-som ou luz ¹¹ . Embora muitos desses sistemas demonstrem um controle melhorado sobre a atividade do ácido nucleico, o uso da luz como gatilho é particularmente vantajoso devido à sua resposta temporal instantânea, resolução espacial precisa e facilidade de afinação ^{12. Além disso, o potencial das tecnologias sensíveis à foto para a regulação da expressão gênica foi demonstrado por sistemas de regulação induzível induciável e sistemas reguladores optogênicos de última geração; No entanto, esses sistemas sofrem de inúmeros desafios, incluindo capacidades limitadas para regular genes endógenos, preocupações de segurança, como imunogenicidade e dificuldades na entrega de conjuntos de componentes múltiplos 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA nanocarriers são ideais para superar essas desvantagens e proporcionar uma abordagem mais simples e mais robusta para spatiotemporally modular a expressão de genes 16 , 17 , 18 . Infelizmente, métodos para prever com precisão a resposta resultante da redução de proteína permanecem difíceis.}

Um desafio fundamental é que as avaliações quantitativas da liberação de siRNA sãoRaro ^{19 , 20} , e mesmo quando essas avaliações são realizadas, elas não foram acopladas a análises da dinâmica de rotação de siRNA / proteína. Tanto a quantidade de siRNA liberada quanto a persistência / vida são determinantes importantes da dinâmica de silenciamento de genes resultante; Daí, a falta de tal informação é uma grande desconexão que impede uma previsão precisa de dose-resposta no RNAi ²¹ . Dirigir-se a este desafio agilizaria a formulação das relações estrutura-função apropriadas em nanocarriers e melhor informará os projetos de biomateriais ²² . Além disso, tais abordagens permitiriam o desenvolvimento de protocolos de dosagem de siARN mais eficazes. Na tentativa de entender a resposta dinamizante ao silenciamento, vários grupos investigaram modelos matemáticos de RNAi ^{23 , 24 , 25} . Esses quadros foramBem sucedido em fornecer informações sobre as mudanças mediadas pelo siRNA na expressão gênica e na identificação das etapas de limitação de taxa ²⁶ . No entanto, esses modelos foram aplicados apenas aos sistemas comerciais de administração de genes ( por exemplo , Lipofectamina e polietilenimina (PEI)) que não são capazes de liberação de siRNA controlada e a complexidade dos modelos limitou severamente sua utilidade ²⁷ . Essas deficiências destacam uma necessidade insatisfeita de novos materiais capazes de obter uma versão de siRNA sintonizável, combinada com modelos cinéticos preditivos simplificados e fáceis de usar.

Nosso método aborda todos esses desafios através da integração de uma plataforma de nanocarrier sensível à luz com métodos acoplados para quantificar siRNA e dinâmica de RNAi de modelo. Em particular, o lançamento de siRNA precisamente controlado da nossa plataforma ²⁸ é monitorado por dois métodos complementares para quantificar com precisão encapsulado vs.SiRNA ligado. Os dados experimentais desses ensaios são inseridos em um modelo cinético simples para prever as eficiências de silenciamento de genes a priori ²⁹ . Finalmente, a natureza on / off dos nanocarriers é facilmente explorada para gerar padrões de células na expressão gênica com controle espacial na escala de comprimento celular. Assim, este método fornece um método facilmente adaptável para controlar e prever o silenciamento de genes em uma variedade de aplicações que se beneficiarão da regulação espaciotemporal do comportamento celular.

Protocolo

1. Formulação de siRNA Nanocarriers

1. Prepare soluções separadas de siRNA e mPEG- b- P (APNBMA) com volumes iguais diluídos em tampão 20 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) a pH 6,0.
   1. Adicionar siRNA a uma concentração de 32 μg / mL a 20 mM de solução de HEPES.
      NOTA: O siRNA foi uma sequência de controle negativa universal não-direcionada; No entanto, o siRNA pode ser projetado para direcionar qualquer gene de interesse.
   2. Dissolver os polímeros mPEG- b- P (APNBMA) em uma solução de 20 mM de HEPES. Adicione uma quantidade apropriada de mPEG- b- P (APNBMA) para fazer uma solução de 220 μg / mL de modo que a relação N / P (N, grupos de amina em mPEG- b- P (APNBMA); P, grupos de fosfato em siRNA) É 4.
      NOTA: O protocolo sintético para os polímeros mPEG- b- P (APNBMA) é relatado em outro lugar ³⁰ .
2. Adicione a solução mPEG- b- P (APNBMA), gota a gota, a um volume igualE da solução de siRNA enquanto mistura suavemente em uma máquina vortex. Continue a vórtice durante 30 s após a adição de polímero. Incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente durante 30 min.

2. Medindo a liberação de siRNA usando eletroforese em gel

1. Formule os nanocarriers de acordo com as etapas 1.1-1.2 e dimensione os volumes para acomodar o número de amostras desejadas.
2. Misture o nanocarrier com dodecilsulfato de sódio (SDS).
   1. Prepare uma solução de SDS de 1 mg / ml em água. Alíquota a quantidade de solução SDS necessária para produzir soluções com uma relação S / P (S, grupos sulfato em SDS, P, grupos fosfato em siRNA) de 15.
      NOTA: Se a solução de polyplex contiver 1 μg de siRNA, devem ser adicionados 13 μg de SDS para atingir uma relação S / P de 15.
   2. Adicione a solução SDS a cada solução de nanocarrier gota a gota enquanto se misturam suavemente em uma máquina vortex. Continue a vórtice por 30 s após a adição do SDS.
   3. Centrifugar as amostras a 3.000 xg por 5 s. Incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente durante 30 min.
3. Calibre e ajuste um laser UV com um filtro de 365 nm para uma intensidade de 200 W / m. Certifique-se de que a intensidade da luz seja medida a partir da localização em que o fundo da solução de amostra será assentado.
4. Coloque a solução nanocarrier / SDS em uma câmara de vidro composta por lâminas de vidro separadas por uma junta de borracha.
   1. Prelavar as lâminas de vidro em uma solução de etanol / água 7: 3 (v / v) em água e secar completamente. Corte um buraco (~ 2 x 3 cm de retângulo) em uma junta de borracha. Coloque a junta de borracha em uma lâmina de vidro.
   2. Pipetar a solução nanocarrier / SDS no slide de vidro dentro do orifício da junta de borracha. Carregue um excesso de solução (20 μL excedente) no deslize de vidro evitando o contato com a junta de borracha.
      NOTA: Alguns líquidos serão perdidos durante as etapas subsequentes.
   3. Coloque o segundo copoDeslize na parte superior da junta deslizante. Para evitar a geração de bolhas de ar, coloque uma extremidade do slide em primeiro lugar e, em seguida, abaixe lentamente a outra extremidade.
   4. Anexe clipes de ligação a cada lado da câmara de vidro para mantê-lo fechado.
5. Irradiate as amostras para o período de tempo desejado ( por exemplo , 0-60 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W / m. Remova os clipes da pasta e abra a câmara.
6. Pipetar 25 μL das amostras de nanocarrier / SDS irradiadas em um tubo de microcentrífuga. Incubar as soluções no escuro à temperatura ambiente durante 30 min.
7. Prepare um gel de agarose a 2% em peso pré-corado com 0,5 ug / mL de brometo de etidio em solução tampão Tris / Borate / EDTA (TBE) de acordo com os protocolos padrão ³¹ . Prepare um tampão de carga composto de 3: 7 (v / v) de glicerol / água.
8. Adicione 5 μL da solução tampão de carga a 25 μL de cada amostra nanocarrier / SDS. Incube as amostras no escuro emTemperatura ambiente por 10 min.
9. Carregue 30 μL de cada amostra nanocarrier / SDS no gel de agarose a 2%. Execute o gel no escuro a 100 V por 30 min. Imagine o gel usando um sistema de imagem em gel com filtros de brometo de etidio. Salve os arquivos de imagem em gel e avance para a etapa 2.10 para a quantificação da intensidade da banda. Certifique-se de que as intensidades da banda são suficientemente brilhantes para visualizar claramente, mas não muito brilhantes, que os sinais estão saturados.
10. Quantifique as intensidades da banda usando o software ImageJ disponível publicamente ³² .
    1. Usando a ferramenta ROI do ImageJ, determine a intensidade de fluorescência das bandas de siRNA gratuitas em cada faixa, desenhando um retângulo ao redor de cada banda. Trace as curvas de intensidade de cada pista e integre a área sob as curvas, desenhando uma linha horizontal através das curvas de intensidade e clicando na varinha de rastreamento dentro das áreas incluídas.
    2. Calcule a intensidade relativa de cada pista dividindo a área sob o comandoRve de cada amostra pela área sob a curva do controle positivo de siRNA (sem mPEG- b -P (APNBMA) adicionado e sem SDS adicionado). Relate a porcentagem de siRNA liberada como a intensidade da banda normalizada de cada amostra.

3. Medindo a liberação de siRNA usando a espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS)

1. Obtenha siRNA marcado com um único fluoróforo na extremidade 5 'da cadeia sensora.
   NOTA: O siRNA pode ser comprado pré-recozido com os rótulos conjugados no local desejado. O fluoróforo deve ser foto-estável e absorver / emitir entre 450 e 750 nm para evitar a extinção da luz UV e transferência de energia com mPEG- b- P (APNBMA).
2. Formule os nanocarriers de acordo com as etapas 1.1-1.2 usando o siRNA marcado. Dimensione os volumes para acomodar o número de amostras desejadas.
3. Incubar as soluções em SDS e irradiar durante o período desejado de acordo com as etapas 2.2-2.6.
4. PrepararCâmara de amostra FCS.
   1. Lave uma lâmina de vidro com uma solução de etanol / água 7: 3 (v / v) e secar completamente o vidro usando uma limpeza e uma corrente de ar.
   2. Remova os pedaços de papel de um espaçador adesivo de dupla face para expor o espaçador adesivo de dupla face. Anexe o espaçador a uma lamínula de vidro.
   3. Pipetar a solução de nanocarrier / SDS no deslizamento da cobertura no meio do orifício do espaçador adesivo.
   4. Coloque o slide de vidro em cima da lamínula. Pressione o escorregador de vidro para garantir que o escorregador de vidro e a lamínula estejam bem unidos e formem uma vedação.
5. Use um microscópio confocal para medições de FCS ³³ . Use um objetivo de apochromat de imersão em água 40X com uma abertura numérica de 1,2. Use o canal laser de excitação apropriado (488 nm) para coletar pelo menos 30 medidas de 10 s cada por amostra ³⁴ . Certifique-se de que a intensidade do laser eo alinhamento do detector permanecemO mesmo para cada amostra.
   1. Além das amostras experimentais, controle de medidas, incluindo: uma amostra em branco sem siARN marcado; E uma amostra de siRNA grátis com siRNA marcado, mas sem mPEG- b- P (APNBMA).
6. Analise os dados usando o software específico do FCS. Identifique a taxa de contagem de linha de base de cada amostra, determinando a taxa de contagem estável durante um período em que não há nanocarriers passando pelo volume confocal ²⁹ .
   1. Subtrair a taxa de contagem da amostra em branco de cada valor da taxa de contagem da base da amostra. Normalize os valores resultantes para o controle de siRNA gratuito para calcular a porcentagem de siRNA livre ³⁵ .

4. Modelagem cinética para prever o silenciamento de genes

1. Crie scripts em uma linguagem de programação matemática usando o conjunto simples de equações diferenciais ordinárias para prever o silenciamento de genes ²9.
   NOTA: Os scripts podem ser disponibilizados mediante solicitação.
   1. Escreva o conjunto de equações diferenciais ordinárias como:
      (1)
      (2)
      (3)
      NOTA: Para as equações 1-3, os termos k _mRNA , k _siRNA e k _prot são as constantes de taxa para a produção de mRNA, siRNA e proteína, respectivamente. Os termos k _{m, deg} , k _{s, deg} e k _{p, deg} são as constantes de velocidade para a degradação de mRNA, siARN e proteína, respectivamente. As constantes da taxa de degradação são calculadas com base nas semi-vidas dos componentes e as constantes da taxa de produção são adequadas para garantir que os valores do mRNA e da estabilidade da proteína sejam atingidos na ausência oSIRRNA.
      1. Determine as meias-vidas do mRNA e da proteína para o (s) gene (s) de interesse, seja experimentalmente como descrito na referência ³⁶ ou da literatura (ver Discussão ). Além disso, determine o tempo de duplicação para a linha celular. Insira esses valores nas expressões da taxa de degradação apropriada.
      2. Sintonize as constantes de taxa de produção para que os níveis de expressão de genes permaneçam estáveis ​​a um valor normalizado de 100 se nenhum siARN for introduzido. Especificamente, definir [siRNA] para zero e variar os valores das constantes de taxa de produção k _mRNA , k _siRNA e k _prot até [mRNA] e [proteína] permanecerem dentro de 1% do valor normalizado inicial de 100% durante a duração de A simulação.
      3. Usando as quantidades relativas de siRNA liberado da eletroforese em gel previamente descrita e dos ensaios FCS como estimativas, ajuste a concentração relativa inicial de siRNA no script. Especificamente, variar [siRNA] para ser proporcional à quantidade relativa de siRNA liberado, com um valor de 100 correspondente à quantidade máxima ²⁹ .

5. Cultura celular e entrega in vitro de siRNA

1. Cultura NIH / 3T3 fibroblastos embrionários murinos de acordo com os protocolos do fornecedor.
   1. Crescer as células em meio de crescimento (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro de bovino fetal inactivado pelo calor e 1% de penicilina-estreptomicina). Manter as células a 37 ° C em um ambiente humidificado com 5% de CO ₂ .
2. Semeie as células em placas tratadas com cultura de tecido de 6 poços.
   1. Siga o procedimento de subcultivação recomendado do fornecedor. Contar as células usando um hemocitômetro. Diluir as células em meios de crescimento suplementados a uma concentração de 75.000 células / mL.
   2. Adicionar 2 mL de suspensão celular (75.000 célulasS / mL) para cada poço da placa de 6 poços. Deixe as células aderir e recuperar durante 24 h na incubadora.
3. Prepare as células para transfecção lavando com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionando 1,5 ml de meio de transfecção sem soro e antibiótico (ver Tabela de Materiais ) a cada poço.
4. Formule os nanocarriers siRNA de acordo com as etapas 1.1-1.2. Adicione 25 μL de solução de nanocarrier contendo 30 pmol de siRNA para cada poço. Agrida levemente a mídia para cima e para baixo para misturar. Coloque as células na incubadora por 3 h.
5. Remova o meio de transfecção e lave cada poço com PBS. Adicione 1 mL de meio de crescimento suplementado e coloque as células na incubadora para recuperar durante 30 min.
6. Para preparar as células para tratamento com um fotoestimulante, remova os meios de crescimento suplementados. Adicione 1 mL de meio de transfecção (sem vermelho fenol) a cada poço.
   NOTA: Certifique-se de que a mídia de transfecção não contém vermelho de fenol.
7. Calibre e ajuste um laser UV com um filtro de 365 nm para uma intensidade de 200 W / m. Certifique-se de que a intensidade da luz seja medida a partir da localização em que o fundo da placa celular será assentado.
8. Coloque as células em uma placa quente ajustada para 37 ° C. Remova a tampa da placa das células. Irradiate as células de acima da placa durante o tempo desejado (até 20 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W m ^-2 .
9. Remova o meio de transfecção e adicione 2 mL de meio de crescimento suplementado. Coloque na incubadora até análise posterior ( por exemplo , 24 h para qPCR e 48 h para Western blot).
   1. Medir mudanças na expressão de genes usando uma variedade de técnicas, tais como Western Blot ³⁷ e qPCR. ³⁸ Para genes com sinais visíveis, como GFP, use microscopia de fluorescência ²⁹ .
      NOTA: Estas técnicas são sugeridas devido à sua facilidade de uso e precisãoNa quantificação da expressão gênica

6. Controlando o silenciamento de genes de forma Spatiotemporal

1. Cultura, semente e células transfectadas de acordo com as etapas 5.1-5.7.
2. Prepare uma fotomátema que bloqueie completamente a luz de 365 nm e minimiza as reflexões.
   NOTA: Neste caso, foram utilizados fragmentos de papel de alumínio de 10 x 10 cm e papel de construção preto para bloquear a luz e reduzir as reflexões, respectivamente. A folha de alumínio e o papel de construção foram colados para formar uma única unidade.
   1. Corte / soco / máquina a forma desejada na fotomáscara. Por exemplo, use uma lâmina afiada e um perfurador para formar um padrão de linha reta (~ 5 cm de comprimento) e um padrão circular (~ 7 mm de diâmetro) na fotomáscara, respectivamente.
3. Cola a fotomask no fundo da placa de 6 poços com o padrão centrado sob o poço contendo as células com o lado anti-reflexo ( por exemplo , preto cPapel de impressão) de frente para a placa. Certifique-se de que a cola não está colocada perto da borda (dentro de ~ 3 mm) do padrão.
4. Configure dois suportes de anel a aproximadamente 25 cm de distância e prenda uma plataforma a cada suporte de anel para que as plataformas sejam de igual altura. Suspenda a placa da célula entre os dois suportes, descansando a placa sobre as plataformas. Certifique-se de que a placa esteja nivelada.
5. Irradiar as células de abaixo da amostra durante o tempo desejado (até 20 min) usando o laser UV com um filtro de 365 nm com uma intensidade de 200 W / m ² .
6. Remova o meio de transfecção e adicione 2 mL de meio de crescimento suplementado. Coloque na incubadora para recuperar por pelo menos 24 h. Imagem das células usando microscopia de fluorescência como descrito ²⁹ .

Resultados

Após a formulação dos nanocarriers, os ensaios de libertação de siRNA foram conduzidos para informar as condições de irradiação a serem utilizadas nas transfecções in vitro . Várias doses de luz foram aplicadas para determinar a porcentagem de siRNA que foi liberado. O primeiro ensaio utilizou eletroforese em gel para separar as moléculas de siRNA gratuitas das moléculas de siRNA ainda complexas / associadas ao polímero. Nanocarriers que não foram tratados com lu...

Discussão

Existem alguns passos no método que são particularmente críticos. Ao formular os nanocarriers, a ordem de adição de componentes e velocidade de mistura são dois parâmetros importantes que influenciam a eficácia ³⁹ . Este protocolo requer que o componente catiónico, mPEG- b- P (APNBMA), seja adicionado ao componente aniónico, siARN, de forma gota a gota enquanto se agita com vortex. Dependendo do volume total da formulação, este processo de mistura leva 3-6 s. Para testar se o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
siRNA	Sigma-Aldrich	SIC001	non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA)	synthesized in our lab	N/A	photo-responsive polymer
HEPES	Fisher Scientific	BP310-100
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	436143
rubber gasket	McMaster-Carr	3788T21	0.5 mL thick
UV laser	Excelitas Technologies	Omnicure S2000	collimating lens and 365 nm filter used
agarose	Fisher Scientific	BP160-100
ethidium bromide	Fisher Scientific	BP1302-10
siRNA labelled with Dy547	GE Healthcare Dharmacon, Inc.	custom order	fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide	Fisher Scientific	12-550-A3	pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer	Life Technologies	S24735	double-sided adhesive
LSM 780	Carl Zeiss	N/A	confocal microscope
ZEN 2010	Carl Zeiss	N/A	FCS analysis software
MATLAB	MathWorks	N/A	programming language
NIH/3T3 cells	ATCC	ATCC CRL-1658
DMEM	Mediatech	10-013-CV	growth media
fetal bovine serum	Mediatech	35-011-CV	heat-inactivated
penicillin-streptomycin	Mediatech	30-002-CI
6-well plates	Fisher Scientific	08-772-1B
Opti-MEM	Life Technologies	11058021	transfection media