Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio de aprendizagem e memória de Drosophila chamado condicionamento de namoro. Este ensaio clássico baseia-se numa redução do comportamento do namoro masculino após a rejeição sexual por uma mulher pré-administrada não receptiva. Essa forma natural de plasticidade comportamental pode ser usada para testar aprendizado, memória de curto prazo e memória de longo prazo.

Resumo

Muitas informações sobre os mecanismos moleculares subjacentes à aprendizagem e à memória foram elucidadas através do uso de ensaios comportamentais simples em organismos modelo, como a mosca da fruta, Drosophila melanogaster . Drosophila é útil para a compreensão da neurobiologia básica subjacente a déficits cognitivos resultantes de mutações em genes associados a distúrbios cognitivos humanos, tais como deficiência intelectual (ID) e autismo. Este trabalho descreve uma metodologia para testar aprendizagem e memória usando um paradigma clássico em Drosophila conhecido como condicionamento de namoro. O macho voa as mulheres do corte usando um padrão distinto de comportamentos facilmente reconhecíveis. As fêmeas prematuras não são receptivas ao acasalamento e rejeitarão as tentativas de copulação do macho. Em resposta a essa rejeição, moscas masculinas reduzem seu comportamento de namoro. Essa redução aprendida no comportamento do namoro é medida ao longo do tempo, servindo como um indicador de aprendizagem e memória. O número básicoA saída clínica deste ensaio é o índice de namoro (IC), que é definido como a porcentagem de tempo que um homem passa cortejando durante um intervalo de 10 min. O índice de aprendizagem (LI) é a redução relativa de IC em moscas que foram expostas a uma fêmea pré-comparada em relação a moscas ingênuas sem encontros sociais anteriores. Para a comparação estatística de LIs entre genótipos, é utilizado um teste de randomização com bootstrapping. Para ilustrar como o ensaio pode ser usado para abordar o papel de um gene relacionado ao aprendizado e à memória, caracterizou- se aqui o abatimento pan-neuronal da fosfato-aciltransferase de dihidroxiacetona ( Dhap-at ). O ortholog humano de Dhap-at , O-aciltransferase de glicerona fosfatada ( GNPT ), está envolvido na condrodisplasia punctata tipo 2 do rizomélico, uma síndrome autossômica recessiva caracterizada por identificação severa. Usando o ensaio de condicionamento de namoro, determinou-se que Dhap-at é necessário para a memória de longo prazo, mas não paraMemória de curto prazo. Este resultado serve como base para uma investigação mais aprofundada dos mecanismos moleculares subjacentes.

Introdução

Os mecanismos moleculares subjacentes ao aprendizado e à memória são conservados em muitas espécies. O trabalho pioneiro de rastreamento de linhas mutantes de Drosophila melanogaster para defeitos na aprendizagem olfativa e na memória forneceu insights moleculares fundamentais sobre os processos subjacentes ao aprendizado e memória ¹ . Esses estudos identificaram alguns dos primeiros genes envolvidos na aprendizagem e na memória, como o rutabaga ² , o amnésico ³ e o burro ⁴ , revelando um papel crítico para a sinalização cíclica de adenosina monofosfato (AMPc) ⁵ .

As telas genéticas iniciais para mutantes de memória foram conduzidas principalmente com o condicionamento olfativo. No entanto, vários métodos para medir outras formas de aprendizagem e memória emergiram ao longo do tempo. Um dos paradigmas de aprendizagem e memória mais amplamente utilizados, e o ensaio descrito aqui, é conhecido como cNosso condicionamento, descrito pela primeira vez por Siegel e Hall ⁶ e depois foi refinado por vários outros grupos de pesquisa ^{7 , 8 , 9} . O condicionamento do corte depende da presença de um feromônio específico, acetato de cis- vacactil (cVA), no abdômen feminino, que é depositado pelo macho durante a copulação. A detecção de cVA no abdômen feminino naturalmente reduz o comportamento do namoro, e quando combinado com o ato de rejeição pela fêmea, o efeito da CVA na redução do namoro masculino é dramaticamente aprimorado. A resposta das moscas masculinas neste ensaio pode ser facilmente quantificada observando seu comportamento de namoro distinto, que se caracteriza por orientar e seguir a fêmea, tocando, estendendo e vibrando a asa, lambendo e tentando copulação ¹⁰ ( Figura 1A ). Moscas masculinas aprendem a se distinguir H entre fêmeas receptivas virgens e não receptivas ¹¹ , e após a rejeição sexual, exibem comportamentos de namoro reduzidos em relação a fêmeas não receptivas por até 9 dias ⁸ . Esse comportamento natural pode ser usado para elucidar os mecanismos subjacentes à aprendizagem, memória de curto prazo (STM) e memória de longo prazo (LTM) ^{8 , 9 , 12} . O aprendizado é definido como a redução imediata do comportamento do namoro que ocorre durante o período de treinamento e muitas vezes é chamado de memória de recall imediato, medido de 0 a 30 minutos após a exposição a uma fêmea acasalada ^{6 , 8} . O STM é medido entre 30 min e 1 h após o treinamento, enquanto o LTM é mais freqüentemente medido 24 h após o treinamento ⁸ ( Figura 1B ). O STM pode ser induzido usando um período de treinamento de 1 h, mas ele só dura 2-3 hS = "xref"> 6 ^{, 8} . Na maioria dos paradigmas de aprendizagem, LTM só pode ser induzida por ataques espaçados de treinamento repetido. Mcbride et al . (1999) ⁸ mostraram que três sessões de treinamento espaciais de 1 h foram suficientes para induzir a memória do namoro durando até 9 dias, em contraste com os 2-3 h induzidos por uma única sessão de treinamento de 1 h. McBride et al . ⁸ também demonstraram que uma única sessão de treinamento de 5 horas produziu uma resposta LTM similar por até 9 dias. As moscas não fazem corte constante durante este período de 5 horas, produzindo seu próprio treinamento espacial para induzir LTM em uma única sessão de treinamento. Isso é muito importante desde uma perspectiva prática, aumentando enormemente a facilidade com que esse ensaio pode ser usado para investigar LTM. Os protocolos atuais usam predominantemente uma única sessão de treinamento de 7 horas para LTM ^{11 , 12} . Vários estudos investigaram diferentesCondições mutantes que apresentam defeitos específicos em diferentes aspectos da aprendizagem do namoro. Por exemplo, a ablação do corpo de cogumelo afeta STM e LTM, mas não está aprendendo ⁸ . Mutações no gene amnésico , que primeiro foi definido como um regulador específico da memória usando o condicionamento olfativo ³ , afeta o STM, mas não está aprendendo ⁶ . A interrupção do regulador de tradução orb2 (subfamília CPEB2 de ligação ao RNA oo18) e ecdysone sinalizam exclusivamente LTM ^{9 , 13} . Assim, o condicionamento do namoro é um paradigma útil para dissecar os mecanismos subjacentes às diferentes etapas da aprendizagem e da memória.

Este trabalho demonstra uma configuração experimental otimizada que permite o teste de alto rendimento do condicionamento de namoro. Além disso, descreve um script de análise estatística e discute fatores críticos do ensaio. É shÉ aqui que o gene Drosophila Dihydroxyacetone phosphate aciltransferase ( Dhap-at ) É necessário nos neurônios para LTM, mas não para STM. O ortholog humano deste gene, a O-aciltransferase de glicerona fosfatada ( GNPAT ), é mutado na condrodysplasia puncional de Rhizomelic tipo 2 ¹⁴ , um distúrbio autossômico recessivo caracterizado por deficiência intelectual grave, convulsões e várias outras características clínicas ¹⁵ . Neste contexto, o condicionamento do namoro pode ser usado para validar funcionalmente o papel dos genes da doença humana na aprendizagem e na memória, fornecendo uma base para estudos mecanicistas.

Protocolo

NOTA: No protocolo descrito abaixo, uma replicação de coleta, treinamento e teste é descrita. Para testar a reprodutibilidade dos resultados, essas etapas devem ser repetidas em paralelo, em vários dias e com grupos separados de moscas ( Tabela 1) . O protocolo baseia-se em um ciclo de vida de 10 dias de ovo para adulto, o que é normal quando a criação voa em condições constantes de 25 ° C, 70% de umidade e um ciclo de luz / escuridão de 12 h. Todos os aspectos deste protocolo assumem que as condições são mantidas constantes durante todo o ensaio. Os tempos são indicados como horas antes das luzes acendem (BLO) ou após as luzes acendem (ALO) na incubadora, pois isso pode ser convenientemente ajustado, dependendo do horário preferido do pesquisador. Use gás CO ₂ apenas para a coleta inicial de moscas masculinas naïves e para a coleta de fêmeas prematuros. Este protocolo para condicionamento de namoro é composto das seguintes etapas:

1. EEstabelecimento de culturas premiadas de colheita feminina
2. Estabelecimento de culturas para a coleta de sujeitos de teste masculinos
3. Preparação de blocos habitacionais
4. Estabelecimento de frascos de acoplamento para a produção de fêmeas prematualizadas padronizadas
5. Coleção de assuntos de teste masculino
6. Treinamento
7. Teste
8. Análise de dados de vídeo e estatísticas

1. Estabelecimento de Culturas Premiadas de Coleção Feminina

1. Prepare alimentação de energia ¹⁶ . Ferver 0,8% (p / v) de agar, fermento a 8% (p / v), extracto de levedura a 2% (p / v), peptona a 2% (p / v), sacarose a 3% (p / v), 6% ( P / v) de glucose, 0,05% (p / v) de MgSO4 e 0,05% (p / v) de CaCl2 em água durante 15 min. Deixe a solução esfriar a 70 ° C antes de adicionar 0,05% (p / v) de metilparabeno (ATENÇÃO: tóxico) e 0,5% (v / v) de ácido propiónico (ATENÇÃO: tóxico). Misture bem por agitação enquanto se arrefece ainda mais a 50 ° C para obter uma solução homogênea.
2. Antes da comida, entãoSe lidifica à temperatura ambiente, adicione ~ 50 mL de alimentação para cada frasco de plástico de 175 mL. Permita que o alimento esfriasse ainda mais. Feche o frasco com um plugue.
   NOTA: A Powerfood é uma mistura de alimentos especializada formulada especificamente para a produção de um grande número de moscas, presumivelmente induzindo a colocação de ovos. Powerfood não é usado para produzir moscas do sexo masculino que serão usadas para análise de comportamento (passo 2) porque a dieta atípica e o aglomerado potencial podem influenciar o desenvolvimento.
3. No dia -11 ( Tabela 1 ), inicie 5-20 culturas de tipos selvagens com aproximadamente 60-100 moscas (uma mistura de machos e fêmeas) em frascos de alimentação; Estes serão utilizados na etapa 4 para produzir fêmeas prematualizadas padronizadas ¹⁷ . Adicione um papel de filtro a cada frasco para aumentar a área em que as larvas podem pupate; Isso aumentará o número de moscas que podem ocorrer.
4. Repita periodicamente as etapas 1.1-1.3 durante todo o experimento para obter moscas recém-descobertas novas como entrada para o"Estabelecimento de frascos de acoplamento para a produção de fêmeas prematualizadas padronizadas" (passo 4).

2. Estabelecimento de culturas para a coleção de sujeitos de teste masculinos

1. Preparar o alimento normal ¹⁶ , preparado com 0,5% (p / v) de agar, 2.75% (p / v) de fermento, 5,2% (p / v) de farinha de milho, 11% (p / v) de açúcar, 0,05% (p / v ) Metilparabeno e 0,5% (v / v) de ácido propiónico em água, como descrito nos passos 1.1 e 1.2. Feche os frascos de plástico de 175 mL com um bujão do frasco para mosca.
2. No dia -10 ( Tabela 1 ), coloque cerca de 10-20 machos com aproximadamente 30-75 fêmeas virgens ( Tabela de Materiais / Equipamentos ) em cada frasco de 175 mL contendo alimentos normais. Adicione um papel de filtro para aumentar a área de superfície para pupação e maximizar a produtividade.
3. Estabeleça três a seis frascos de 175 mL por genótipo para obter o número necessário de machos sujeitos ao teste.
   NOTA: Mais frascos podem ser necessários, dependendo da produtividade da geração desejadaOtype.

3. Preparação de blocos de alojamento ( Figura 2A )

1. Derreta aproximadamente 50 ml de alimentação por bloco de alojamento em um microondas, ou prepare-o fresco.
2. Adicione 500 μL de alimentação para cada poço de um bloco de fundo plano de 96 poços usando uma pipeta multidispensadora.
3. Deixe a comida se solidificar à temperatura ambiente.
4. Cubra os blocos com filme adesivo de PCR e use uma agulha para fazer pelo menos 4 furos por poço para fornecer ar fresco às moscas.
5. Para poder abrir cada poço, use uma lâmina de barbear para cortar o filme adesivo longitudinalmente entre cada linha. Deixe o filme intacto em uma extremidade do bloco.
6. Os blocos podem ser armazenados a 4 ° C por até 2 dias.
   NOTA: Permita que os blocos se re-equilibrem à temperatura ambiente antes da utilização.

4. Estabelecimento de frascos de acoplamento para a produção de fêmeas premiadas padronizadas

1. No dia -1, remova eDescarte todas as moscas selvagens adultas das culturas premiadas de colheita feminina às 2-5 h BLO.
2. Recolher moscas usando o aspirador ( Figura 2B ) desses frascos em intervalos de 2 a 3 h ( por exemplo, a 30 min, 2,5 h e 5 h de ALO) e colocá-los em um novo frasco de alimentação de energia suplementado com uma pequena quantidade de levedura Colar e filtrar papel.
3. Para evitar o aglomeração e promover uma ótima atmosfera de acasalamento, não transfira mais de 150-200 moscas para cada novo frasco para injectáveis. Assegurar o acasalamento de todas as fêmeas, fornecendo pelo menos 25% de machos. Certifique-se de que fêmeas suficientes estejam presentes nos frascos de acoplamento para acomodar o tamanho da experiência.
   NOTA: Como este é um passo crucial no protocolo, certifique-se de que apenas as moscas recém-eclosed e as moscas, larvas ou pupas antigas são transferidas para o novo frasco de contato.
4. Incubar estes "frascos de acoplamento" por quatro dias para permitir tempo suficiente para que todas as fêmeas tenham se acasalado.

5. ColLection of Male Test Subjects

1. No dia 1 ( Tabela 1 ) a 2-3 h BLO, use CO ₂ para remover todas as moscas adultas dos frascos de coleta masculinos (passo 2), Mas deixe mais voa eclose nas próximas horas.
2. Durante as próximas 5-6 h, remova as moscas recém-eclosed a cada 20-30 min usando CO ₂ e coloque cada macho em um poço individual do bloco de alojamento (passo 3) usando o aspirador ( Figura 2B ).
3. Re-selar o poço com o filme de PCR adesivo.
   NOTA: Este é um passo crucial no protocolo. Os machos devem ser coletados com freqüência. Os machos coletados devem ser isolados no bloco de habitação perto do tempo da eclosão, quando eles demonstram pigmentação pálida e a presença do mecônio no abdômen translúcido.
   NOTA: O uso suave do aspirador permite a transferência de moscas; No entanto, o uso inadequado irá estressar as moscas, causando variação no ensaio (veja a Discussão).
4. Visar para coSelecione até 48 machos por genótipo. Isso proporciona um pequeno excesso ao número máximo de machos necessários para a análise de condições ingênuas e treinadas, permitindo alguma perda durante etapas de transferência posteriores.

6. Treinamento

1. Remova as moscas do frasco de acasalamento (passo 4.2) usando CO ₂ e separe as fêmeas prematuras dos machos.
2. Usando o aspirador, adicione uma única fêmea pré-sintetizada e prematura a cada poço em uma linha de um novo bloco de habitação.
3. Usando o aspirador e sem anestesia, transfira um homem nativo individual do bloco de alojamento configurado no passo 5.2 para o poço que contém uma fêmea pré-determinada. Depois que o macho é colocado no poço, re-selar imediatamente com a película adesiva; Não permita que o macho escape.
   NOTA: transfira moscas masculinas do aspirador para o bloco de alojamento aproveitando o comportamento natural de "geotaxis negativas" (veja a Discussão).
4. Repita as etapas6.2-6.3 até que sejam estabelecidos pares masculinos / femininos suficientes. Idealmente, estabeleça 24 pares, duas linhas inteiras de um bloco de habitação, por genótipo. Deixe os machos naïves restantes no bloco de alojamento original configurado no passo 5.2.
5. Deixe os pares masculino e feminino sem perturbações durante o período de treinamento ( Tabela 2 , Figura 1B ).
   NOTA: Durante este tempo, o macho será julgado e será rejeitado pela mulher prematura. Para aprender e STM, o período de treinamento é de 1 h e para LTM, o período de treinamento é 7-9 h.
6. Termine o treinamento ( Tabela 2 , Figura 1B ) usando um aspirador para separar suavemente o macho da fêmea prematurada; Não use anestesia. Coloque o macho separado em um novo bloco de alojamento.
7. Use o aspirador para transferir todos os machos ingênuos gentilmente e sem anestesia do bloco de alojamento configurado no passo 5.2 para um novo bloco de alojamento.
   NOTA: Esta etapa é opcional para STM e leaMas é muito importante para o LTM porque as moscas são alojadas 24 horas adicionais para testar o LTM.
8. Para STM e LTM, permita que os machos descansem por 1 h e ~ 24 h, respectivamente ( Tabela 2 , Figura 1B ) antes do teste (passo 7).
9. Para aprender, teste imediatamente os machos treinados e naïve (passo 7).

7. Teste

1. Recolher moscas dos frascos de acoplamento (passo 4.2) usando CO ₂ e separar as fêmeas prematuras dos machos.
2. Deixe as fêmeas se recuperar da anestesia por pelo menos 1 h em um frasco contendo alimentos normais.
3. Monte os videogravadores com antecedência ( Figura 2C ), para que todos os equipamentos estejam prontos antes do início do teste.
4. Comece o teste de acordo com as diferentes linhas de tempo para aprender, STM e LTM ( Tabela 2 , Figura 1B ). Execute testes imediatamente após o treinamentoPara aprender, 1 h após o treinamento para STM e 24 h após o treinamento para LTM.
5. Usando o aspirador, transfira suavemente um macho individual do bloco de alojamento em repouso ou do bloco de alojamento de treinamento se o aprendizado estiver sendo testado (passo 6.7, treinado, passo 6.8, naïve) para a metade de uma arena de namoro com o divisor fechado ( Figura 2D , Veja o Arquivo S1 para um plano de construção).
   NOTA: O uso do comportamento natural de "geotaxis negativas" deve ser suficiente para transferir as moscas do homem do aspirador para a arena do namoro (Discussão).
6. Mova com rapidez, mas gentilmente, o orifício de entrada para a próxima arena e repita o passo 7.5 até que todas as 18 arenas contenham um macho.
7. Usando o aspirador e sem CO ₂ , adicione uma fêmea prematura (coletada no passo 7.2) para a outra metade das 18 arenas.
8. Coloque cuidadosamente a câmara de namoro sob a câmera, com a abertura dos poços voltados para baixo ( Figura 2C ).
9. Remova o divisor das arenas para permitir a interação direta entre os machos e fêmeas prematuros.
10. Inicie imediatamente a gravação do comportamento durante pelo menos 10 min.
    NOTA: Ao usar uma configuração de duas câmeras, a gravação paralela de duas placas de namoro pode ser feita em períodos de sobreposição para maximizar a eficiência.
11. Esvazie as arenas de namoro usando uma aspiradora de mão e permita que a câmara de namoro se ventilue antes da reutilização.
12. Repita o passo 7.4-7.11 até que o teste de todos os genótipos e condições ( ou seja, naïve e treinada) tenha sido concluído.

8. Análise e Estatística de Dados de Vídeo

1. Calcule o índice de namoro (CI), definido como a porcentagem de tempo que os tribunais masculinos durante os primeiros 10 minutos do período de teste, para cada mosca masculina individual.
   NOTA: Isso pode ser feito manualmente observando o comportamento de namoro estereotipado ( Figura 1A ) ou por vocêCante softwares de computação para quantificação automatizada do comportamento do namoro (Discussão).
   NOTA: Recomenda-se a análise de 40-60 machos por condição no decorrer de três dias, a fim de obter poder estatístico suficiente e avaliar a consistência dos dados CI.
2. Calcule o índice de aprendizagem (LI), definido como a redução percentual na média CI de machos treinados em comparação com machos naïve (LI = (CI _ingênuo - CI _treinado ) / CI _ingênuo ). Avalie o LI por cada dia de teste e compare-o ao LI acumulado calculado a partir de todos os dias de testes combinados.
3. Faça um arquivo separado de dados de separação de duas colunas com "Genótipo" e "CI" como cabeçalho.
   NOTA: Esses cabeçalhos diferenciam maiúsculas de minúsculas. O nome do genótipo para cada IC deve consistir em uma descrição do genótipo seguido por um título de sublinhado e a condição de treinamento ( por exemplo, genótipo_N e genotype_LTM, etc., onde N = naïve e LTM = longo prazomemória; Consulte o arquivo suplementar S2 para um exemplo). Esta anotação é essencial, pois a função analearn identificará moscas treinadas e ingênuas com base nos caracteres presentes após o primeiro sublinhado na coluna "Genótipo".
4. Use o script analearn R (Supplemental File S3) para realizar um teste de randomização para avaliar a significância estatística das diferenças entre os valores de LI de diferentes genótipos.
   1. Fonte do script (Supplemental File S3) em R ¹⁸ , que define uma função chamada "analearn".
      NOTA: A definição da função é: analearn <- function (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Inicie a função digitando "analearn ()" na linha de comando R e selecionando o arquivo de dados a ser analisado (produzido no passo 8.3) através da janela pop-up.
   3. Escolha a mutação de referência, queÉ o genótipo de controle, inserindo o número correspondente e pressionando enter.
      NOTA: Depois de selecionar o genótipo de referência, o script leva vários segundos para executar 10.000 replicações de inicialização.
   4. Observe a tabela de saída (Tabela 3), que contém o genótipo, condição de aprendizagem ( ie, aprendizado, STM ou LTM), CI médio naïve, IC médio treinado, LI, a diferença entre o LI do controle em comparação com a condição experimental (LI dif), o limite inferior (LL) eo limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% da LI dif e o valor p indicando a probabilidade de não haver diferença significativa.
      NOTA: analearn armazenará um arquivo de texto de saída no diretório onde o arquivo de dados está localizado. No entanto, a tabela de saída também aparece no console do R-Studio. O nome padrão é construído com base no nome do arquivo de dados fornecido.
   5. Existem vários argumentos na função analearn que podem ser usados ​​para alterar oConfigurações de falha da função para ajustar os parâmetros do bootstrapping.
      NOTA: "nboot" define o número de repetições do bootstrap e está definido para 10.000 por padrão. Esse valor pode ser alterado para qualquer número inteiro maior que zero. A Tabela 5 alista vários argumentos que podem ser usados ​​para alterar as configurações padrão da função. No entanto, não é recomendado usar dados produzidos com um número reduzido de réplicas de inicialização.

Resultados

O ensaio de condicionamento do namoro pode ser usado para medir a aprendizagem e a memória na Drosophila . Para demonstrar isso, os resultados apresentados aqui analisam STM e LTM no controle de moscas em comparação com as moscas com o knockdown específico do neurônio de Dhap-at. Controle os machos expressam uma seqüência de hairpin de interferência de ARN visando um gene específico de Caenorhabditis elegans , proteína de dedo de zinco putativa C02F5.12 ¹⁹ . Esta tensão de controle garante um número igual de elementos de seqüência de ativação a montante (UAS) entre o knockdown e o controle no mesmo fundo genético, eo controle RNAi hairpin é responsável por quaisquer efeitos não específicos do sistema RNAi. Os machos controle (genotipo: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) mostram uma redução significativa na IC em treinamento versus ingênuo para ambos os STM ( Figura 3A , p = 1,2 x 10 ^{- 4} , Mann-WhitneY U-test) e LTM ( Figura 3B , p = 1,2 x 10 ^-4 , teste U de Mann-Whitney). Este resultado reflete a capacidade normal de aprendizagem e memória nessas moscas. As moscas Dhap-at knockdown (genótipo: UAS-dcr2 / +; P {KK101437} VIE-260B / +; elav-Gal4 / + ) também mostram uma redução significativa de IC em moscas treinadas versus não ingênuas para STM ( Figura 3A , p = 1,2 x 10 ^-4 , teste U de Mann-Whitney). No entanto, eles não mostram uma redução significativa na IC após o treinamento LTM ( Figura 3B , p = 0,33, teste U de Mann-Whitney). O teste U de Mann-Whitney foi usado para comparar o IC médio de moscas ingênuas e treinadas devido à distribuição não-paramétrica dos dados CI para algumas condições ( Figura 3A e 3B ). As diferenças observadas através da análise de ICs são refletidas pelo LI para cada genótipo, que mede a redução percentualNa CI em moscas ingênuas versus treinadas ( Figura 3C ). Não há diferença significativa em LI entre controles e Dhap-em moscas knockdown para STM ( p = 0.115, 10.000 repetições bootstrap, Figura 3C , Tabela 3 ), enquanto que o LI para LTM é significativamente menor nas moscas Dhap-at knockdown ( p = 0,0034, 10 000 repetições de bootstrap, Figura 3C , Tabela 3 ). Para a comparação de LI entre genótipos, um teste de aleatorização ²⁰ adaptado de um método primeiro recomendado por Kamyshev et al. ⁷ foi usado. Uma vez que o LI é um valor único derivado de dados populacionais ( ou seja, meio médio não treinado e treinado com CI), métodos estatísticos padrão que dependem de distribuições derivadas experimentalmente não se aplicam. O teste de randomização é livre de distribuição e usa bootstrapping ( ou seja, sampli aleatórioNg com substituição) para gerar conjuntos de dados hipotéticos que são derivados dos dados reais. O script analearn (File S3) gera um conjunto de LI hipotéticas para cada genótipo e calcula a diferença entre o controle e o genótipo do teste (LIdiff). Este processo é repetido 10.000 vezes e os valores resultantes são usados ​​para determinar o intervalo de confiança de 95% de LIdiff ( Tabela 3 ). Esses dados são usados ​​para gerar um valor- p que indica a probabilidade de que o LI dos dois genótipos seja diferente. Os resultados mostrados aqui demonstram que Dhap-at é necessário nos neurônios para LTM, mas não para STM.

Para controlar a variabilidade do dia-a-dia, as ICs e LIs são comparadas entre dias replicados ( Tabela 4 ). Embora seja observada uma certa flutuação na LI desde o dia-a-dia, os resultados são geralmente reprodutíveis. É importante notar que os dados CI podem variar muito de acordo com o controle strUsado e as condições ambientais de testes. Os dados de CI mostrados aqui são típicos desse genótipo de controle, mas outros genótipos podem apresentar uma CI média e distribuição maior ou menor.

Figura 1: Determinação do Índice de Corte e Visão Geral Experimental. ( A ) Imagens que mostram o comportamento de namoro masculino estereotipado em relação a uma mosca feminina. Diferentes estágios do comportamento de namoro são mostrados: orientação (I), seguindo (II), vibração de asa (extensão) e toque (III), lambendo (IV) e tentativa de copulação (V). ( B ) Visão geral esquemática dos tempos de treinamento e teste em relação ao ciclo da luz da incubadora, marcado em horas. Os tempos de treinamento são indicados com barras, os períodos de repouso para STM e LTM são indicados com uma linha tracejada e o ponto de início do teste é indicado como uma seta. Observe que oO tempo de teste para LTM é um dia depois do treinamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Equipamento utilizado para o ensaio de condicionamento do corte de Drosophila. ( A ) O bloco de alojamento é um bloco plano e inferior com 500 μL de alimentação por poço. É selado com uma película adesivo qPCR com pelo menos 4 furos por poço que foram criados usando uma agulha de seringa com 0,8 mm de diâmetro. As linhas individuais são cortadas longitudinalmente em tiras usando uma lâmina de barbear para permitir a abertura e fechamento. ( B ) O aspirador é necessário para a transferência suave de moscas masculinas e femininas sem o uso de anestesia. A inserção mostra a ponta do aspirador, fechada com um pedaço de algodão para keAs moscas dentro da ponta. ( C ) Configuração de um sistema de duas câmeras para gravação simultânea de duas câmaras de namoro. ( D ) Uma câmara de namoro com 18 arenas. Os orifícios de entrada deslizantes são usados ​​para colocar as moscas nas arenas. As divisórias brancas podem ser abertas simultaneamente para iniciar a interação entre machos e fêmeas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise de STM e LTM em Controle e Dhap-at Knockdown Flies. ( AB ) Boxplots que mostram a distribuição de valores de CI para mosquitos naïve (N) e treinados (T) dos genótipos de controle (cinza) e Dhap-at knockdown (branco) testados para STM (A) e LTM (B). ( C ) CorrespoEstabelecendo valores de LI para controle e Dhap-em moscas knockdown testadas para STM e LTM. As diferenças de LI entre os genótipos de controle e knockdown foram comparadas usando um teste de randomização (10.000 repetições de bootstrap). As barras de erro indicam o erro padrão da média derivada dos valores de LI calculados em diferentes dias de teste. Os genótipos são: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; E elav-Gal4 / + (Controle) E w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; E elav-Gal4 / + ( Dhap-at- ARNi). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Geral	Coletar	Trem	Teste
Dia -11	Iniciar culturas de coleta feminina prematuro (passo 1.3)
Dia -10	Iniciar culturas para a coleta de sujeitos de teste masculinos (passo 2.2)
dia 1		Representante. 1
dia 2		Representante. 2
dia 3		Representante. 3
Dia 4		Representante. 4	Representante. 1
Dia 5			Representante. 2	Representante. 1
Dia 6			Representante. 3	Representante. 2
Dia 7			Representante. 4	Representante. 3
Dia 8				Representante. 4
Dia 9	Análise de dados de vídeo e estatísticas (etapa 8)
Rep = repetir

Tabela 1 : Exemplo de Cronograma para Testar LTM em Três Replicas em Dias Individuais.

	Aprendendo	STM	LTM
Tempo de treino	1 h.	1 h.	8 h.
Tempo de descanso	0 h.	1 h.	~ 24 h.
comece a treinar	0H. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
Pare de treinar	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
Teste de início	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (no dia seguinte)
ALO = depois que as luzes se acendem, BLO = antes que as luzes se liguem, STM = memória de curto prazo, LTM = memória de longo prazo

Tabela 2 : Duração do treinamento, tempos de treinamento e tempos de teste para aprendizado, STM e LTM.

Genótipo	Aprendendo condição	CI ingênuo	CI treinado	LI	LI diferença	Limite inferior (Intervalo de conficiência de 95%)	Limite superior (Intervalo de conficiência de 95%)	P-valor
Ao controle	STM	0.467	0.116	0.752	N / D	N / D	N / D	N / D
Dhap-at-RNAi	STM	0.699	0,257	0.633	0.119	-0,030	0,265	0.116
Ao controle	LTM	0,590	0,384	0.348	N / D	N / D	N / D	N / D
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0,650	0,068	0.280	0.103	0.446	0.003

Tabela 3: Dados estatísticos produzidos a partir do roteiro Analearn.
Dados estatísticos produzidos a partir do script analearn. O arquivo de saída do script R de inicialização contendo o genótipo, condição de aprendizagem ( ie, aprendizado, STM ou LTM), média CI naïve, média CI treinada, LI, diferença entre LI do controle em comparação com a condição experimental (LI dif) , O limite inferior (LL) e o limite superior (UL) do intervalo de confiança de 95% de LI dif e o valor de p indicando a probabilidade de não haver diferença significativa.

		Ao controle			Dhap-at-RNAi
		CI médio naïve	CI treinado	LI	CI médio naïve	CI treinado	LI
STM	Dia 1	0.300	0,125	0,584	0.679	0.239	0.648
	Dia 2	0.634	0.107	0.831	0.720	0,276	0.617
	Todos os dias	0.467	0.116	0.752	0.699	0,257	0.633
LTM	Dia 1	0,590	0.441	0,252	0,630	0.646	-0,027
	Dia 2	0.640	0.363	0.432	0,709	0,710	-0,002
	Dia 3	0,547	0.349	0.363	0,738	0,598	0.190
	Todos os dias	0,590	0,384	0.348	0.697	0,650	0,068

Tabela 4 : Valores de CI e LI obtidos em dias de teste separados.

"Naivelevel" determina o texto que identificará valores naïves para cada genótipo. O padrão é "N", mas isso pode ser alterado para qualquer outro texto alfanumérico.

"Refmutation" é definido como "NA" (não aplicável) por padrão, mas pode ser alterado para o nome do controle ou o genótipo, a fim de realizar comparações estatísticas. Isso causará o sCript para selecionar automaticamente o genótipo de controle.

"Datname" refere-se ao nome do arquivo de dados e pode ser especificado neste argumento em vez da seleção de arquivo padrão.

"Cabeçalho" pode ser usado para indicar se o arquivo de dados contém ou não cabeçalhos de coluna. O padrão é "VERDADEIRO", mas um arquivo sem cabeçalho pode ser usado quando esse argumento é alterado para "FALSO".

"Semente" inicializa o gerador de números aleatórios. Isto é definido por padrão para "NA" e garante um número aleatório cada vez que o script é usado. Por design, uma análise de bootstrap dará resultados ligeiramente diferentes sempre que for executada, mesmo quando se usa o mesmo arquivo de dados. Quando a semente é especificada por qualquer número inteiro maior que zero, é obtido o mesmo conjunto de amostras de inicialização aleatória.

"Writeout Colocar "pode ​​ser configurado para" VERDADEIRO "ou" FALSO "para determinar se um arquivo de saída será gerado. O padrão é verdadeiro."

Tabela 5: Argumentos usados ​​na função Analearn que pode alterar as configurações padrão da função para ajustar os parâmetros do Bootstrapping

Arquivo suplementar S1: plano de construção de uma câmara de namoro. O arquivo pode ser aberto com qualquer aplicativo que permita extensões .stp (arquivos CAD) . Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar S2 : Exemplo de um arquivo de entrada para o Script Analearn .S2.zip "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar S3 : The Analearn.R Acript. O arquivo pode ser aberto com o R-studio ¹⁸ . Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O ensaio de condicionamento de namoro é um paradigma clássico para a análise de aprendizagem e memória em Drosophila . O protocolo apresentado aqui segue a metodologia geral descrita anteriormente ^{6 , 7 , 8 , 9 ,} mas inclui aspectos únicos, tais como diretrizes práticas, equipamentos especializados e um script de análise de dados ^{9 , 12} para testes de randomização. Usando este protocolo, é possível analisar um grande número de moscas em paralelo usando blocos de fundo plano de 96 poços ( Figura 2A ) para coletar e treinar machos. Os blocos são selados com filme adesivo de PCR, o que torna as moscas facilmente acessíveis quando necessário. Além disso, as câmaras de namoro únicas descritas aqui permitem o aparecimento simultâneo de 18 pares macho-mulher em um espaço quase bidimensional que euÓtimo para análise de vídeo. As câmaras de namoro personalizadas são fáceis de usar, e um plano de construção é fornecido ( Arquivo S1 , Figura 2D ). Este protocolo, a partir do estabelecimento das culturas utilizadas para coletar sujeitos de teste para a aquisição de dados de vídeo, leva aproximadamente 20 dias ( Tabela 1 ). É necessário tempo adicional para a análise de dados de vídeo. Na nossa experiência, o ensaio STM é extremamente robusto. O ensaio LTM também é bastante robusto, mas é mais sensível às variáveis ​​ambientais confusas e, portanto, pode ser mais difícil de dominar.

O comportamento animal pode ser bastante variável. Portanto, as etapas críticas no protocolo devem ser realizadas com cuidado para reduzir essa variância. Em primeiro lugar, o uso suave do aspirador ( Figura 2B ) reduzirá o estresse que pode ser imposto por manipulação brusca ou por soprar com muita força. Um método sugerido de transferência de indivíduoVoa fora do aspirador é usando geotaxis negativa. À medida que as moscas tendem a caminhar, pode simplesmente apontar a ponta do aspirador para cima; Antes que a mosca chegue à ponta, um golpe suave é suficiente para deixar a mosca fora. Além disso, para deixar os machos nas câmaras de namoro antes de testar, um golpe muitas vezes não é necessário.

Outro passo importante é a coleta e geração de sujeitos de teste masculino. Todos os machos devem ser coletados quando são muito jovens e socialmente ingênuos. Isso pode ser conseguido por coleta freqüente durante os períodos de pico da eclosão (etapa 5.2). Se os machos não são coletados nesse prazo apertado, eles podem ter interações sociais iniciais, o que pode resultar em uma aprendizagem fraca ou alta variabilidade na IC. Outro fator de sujeitos de teste masculino que deve ser avaliado é o fundo genético. Diferentes antecedentes genéticos exibirão diferentes níveis de namoro naïve e também podem diferir em atividade geral ou habilidade locomotora. Quando compaAnelar genótipos múltiplos, deve-se tomar cuidado com relação ao fundo genético, a fim de evitar esses fatores de confusão que podem influenciar os escores de LI. Além disso, a distribuição dos dados de CI deve ser cuidadosamente avaliada. Os dados CI podem ser paramétricos e não paramétricos, dependendo do genótipo ou de outros fatores ambientais. Em alguns casos, se a distribuição de CI estiver dramaticamente distorcida de uma distribuição normal, pode ser melhor usar a IC mediana do que a média para o cálculo de LIs. No entanto, em nossa experiência, o uso de IC mediana ou média não faz diferença na interpretação estatística dos dados, e o uso da IC média é a prática comum na literatura.

Para o condicionamento de namoro bem sucedido, a rejeição ativa das tentativas de namoro masculino por mulheres prematuros é crucial durante o período de treinamento. É importante garantir que as fêmeas prematuros utilizadas neste ensaio tenham sido efetivamente acopladas e sejamNão permitindo copulação. Esta prematura é estabelecida nos frascos de acasalamento preparados no passo 4, onde moscas masculinas e fêmeas são alojadas juntas durante 4 dias ( Tabela 1 ). Posteriormente, o acasalamento pode ser monitorado por exame regular de vídeos de teste e observando pares macho-fêmea durante o treinamento. Se o acasalamento ocorrer, existem várias medidas que podem ser tomadas durante a preparação de fêmeas prematuros. Em primeiro lugar, as fêmeas prematuros devem ser criadas sob condições óptimas de reprodução. Os frascos podem ser suplementados com pasta de levedura e um papel de filtro dobrado para aumentar as superfícies de acoplamento potenciais. A incubação de moscas nas condições descritas aqui produziu fêmeas prematuras robustas no passado, mas isso pode variar em diferentes laboratórios e com o uso de diferentes cepas genéticas. Portanto, pode ser necessário otimizar a geração de fêmeas prematuros, variando o tempo e as condições de incubação.

A quantificação do comportamento do namoro éOutro passo crítico neste protocolo. Isso pode ser feito manualmente ou automaticamente usando programas de software especializados ⁹ . A quantificação automatizada é rápida e, em princípio, imparcial. Vários programas foram publicados ^{21 , 22 , 23} ; No entanto, eles não são fáceis de usar, muitas vezes exigindo formatos de vídeo especializados e habilidades computacionais avançadas. A quantificação manual é fácil e precisa, mas é altamente intensiva em mão-de-obra e está sujeita a variabilidade e preconceito individual. É importante enfatizar que este protocolo não aborda os requisitos de formatação de vídeo que são potencialmente necessários para a quantificação automatizada de ICs. Para a quantificação manual, use qualquer dispositivo de gravação de vídeo simples que tenha o potencial de produzir um vídeo de qualidade suficiente para observar com precisão o comportamento do namoro. Para a quantificação automatizada, provavelmente haverá diferentesRequisitos dependendo do software usado, e os usuários devem investigar isso completamente se for desejada a quantificação automatizada.

Em combinação com as extensas ferramentas disponíveis para a manipulação genética das moscas, o ensaio de condicionamento do namoro fornece uma leitura robusta que pode ser usada para dissecar mecanismos moleculares e redes neuronais envolvidas na aprendizagem e na memória.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-