Protocolo de varredura do relógio para análise de imagem: plugins ImageJ

Resumo

Este artigo descreve dois novos plugins ImageJ para análise de imagem 'Clock Scan'. Esses plugins expandem a funcionalidade do programa original visual 6 básico e, o mais importante, disponibilizam o programa para uma grande comunidade de pesquisa, agrupando-o com o pacote de software de análise de imagem gratuito ImageJ.

Resumo

O protocolo de varredura do relógio para análise de imagem é uma ferramenta eficiente para quantificar a intensidade média de pixels dentro, na borda e fora (fundo) de uma região de interesse convexa fechada ou segmentada, levando à geração de um pixel radial integral integral, Perfil de intensidade. Este protocolo foi originalmente desenvolvido em 2006, como um script básico visual 6, mas, como tal, teve distribuição limitada. Para resolver esse problema e se juntar a esforços recentes semelhantes por parte de outros, convertimos o código original do protocolo de varredura do relógio em dois plugins baseados em Java compatíveis com programas de análise de imagens patrocinados pelo NIH e livremente disponíveis, como ImageJ ou Fiji ImageJ. Além disso, esses plugins possuem várias funções novas, expandindo ainda mais a gama de recursos do protocolo original, como análise de múltiplas regiões de interesse e pilhas de imagens. O último recurso do programa é especialmente útil em aplicativos em que é importante determinar as mudanças relacionadasAo tempo e à localização. Assim, a análise da varredura do relógio de pilhas de imagens biológicas pode potencialmente ser aplicada à disseminação de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ em uma única célula, bem como à análise da atividade de espalhamento ( por exemplo , ondas de Ca ⁺⁺ ) em populações de forma sináptica - células acopladas ou juntas separadas. Aqui, descrevemos esses novos plugins de verificação de relógio e mostramos alguns exemplos de suas aplicações na análise de imagens.

Introdução

O objetivo deste trabalho é apresentar um protocolo de varredura de relógio que seja livre de plataforma e livremente disponível para qualquer pesquisador interessado neste tipo de análise de imagem. O protocolo Clock Scan foi desenvolvido originalmente em 2006 ¹ , com o objetivo de melhorar os métodos existentes de quantificação de intensidade de pixels dentro de regiões de interesse convexas (ROI), um método que possui melhor capacidade de integração e resolução espacial melhorada. Durante a aquisição, o protocolo coleciona seqüencialmente vários perfis de intensidade de pixel radial, digitalizados do centro ROI para a sua borda ou a uma distância predeterminada fora do ROI com o objetivo de medir a intensidade do pixel "background". O protocolo dimensiona esses perfis de acordo com o raio da célula, medido na direção da varredura. Assim, a distância do centro para a margem ROI de cada varredura radial individual é sempre 100% da escala X. Finalmente, o programa mede esse indivíduoPerfis em um perfil de intensidade de pixel radial integral. Devido à escala, o perfil médio de intensidade de pixel, produzido pelo protocolo "Clock Scan", não depende nem do tamanho do ROI nem, dentro de limites razoáveis, na forma ROI. Este método permite comparação direta ou, se necessário, média ou subtração de perfis de ROIs diferentes. O protocolo também permite a correção dos perfis integrados de intensidade de pixels, de qualquer objeto para o ruído de fundo, por uma simples subtração da intensidade média dos pixels localizados fora do objeto. Embora apenas tenha sido testado em amostras biológicas, nosso protocolo fornece uma adição valiosa a outras ferramentas de análise de imagem existentes usadas em estudos de imagens de processos físicos ou químicos dispostos em torno de um ponto de origem (como a difusão de substâncias de uma fonte pontual ) ¹ .

No entanto, a principal limitação do método de análise de imagem original foi que o protocolo foi dev.Eliminou-se como um Visual Basic 6 (VB6) (código e, portanto, era dependente da plataforma e difícil de distribuir (exigindo VB6). Para resolver este problema e juntar-se a esforços recentes semelhantes de outros investigadores ² , convertimos o VB6 Clock Scan Codifique o programa em dois plugins baseados em Java, compatíveis com os programas de análise de imagem independentes da plataforma open-source patrocinados pelo NIH e livremente disponíveis, ImageJ ³ e Fiji ImageJ ^4. Além disso, esses plugins possuem várias funções novas que expandem a capacidade Do protocolo original para processar vários ROIs e pilhas de imagens. Muitas aplicações de análise de imagem não são fáceis de usar, no que diz respeito à análise estatística de múltiplos objetos e, portanto, muitas vezes apenas dados representativos são mostrados. Com o plugin Multi Clock Scan ImageJ, É possível facilitar a análise de objetos múltiplos simultaneamente. Uma avaliação estatística robusta dos dados de microscopia,No que diz respeito à distribuição da intensidade do sinal em células / objetos únicos, agora é possível com esta extensão de plugin. Aqui, descrevemos os plugins do Clock Scan e mostramos exemplos de suas aplicações na análise de imagens.

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Protocolo

1. Instalação de software

1. Instale as versões mais recentes do Java agrupado e ImageJ ou Fiji ImageJ conforme recomendado nos respectivos sites (consulte a tabela de materiais para obter links para os sites correspondentes). No texto abaixo, ambos os programas são referidos como "ImageJ".
2. Copie os arquivos de plugin "Clock_Scan-1.0.1. Jar" e "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" usando o link fornecido na tabela de materiais e cole-os no diretório do plugin ImageJ. Como alternativa, use a opção de menu "Plugins | Instalar o plugin" para instalar esses arquivos depois de terem sido salvos no disco rígido do computador.

2. Análise de varredura do relógio

1. Plugin de verificação de relógio padrão ( Figura 1 ):
   1. Use o comando de menu ImageJ "Arquivo | Abrir" para abrir uma imagem de interesse.
   2. Clique na ferramenta 'polígono' ou 'seleção de linha segmentada'Ferramenta, e depois desenhe a imagem para descrever todo o ROI ou um segmento dessa região. Veja a Figura 1 A para um exemplo de seleção de polígono (contorno de traço interno).
      NOTA: Outras ferramentas de seleção, disponíveis no software (seleção de linha retangular, oval e a mão livre) também podem ser usadas.
   3. Selecione "Plugins | Clock Scan" no menu para abrir a janela de opção pop-up do protocolo de varredura do relógio padrão. Observe que esse comando também abrirá a janela ROI Manager com o contorno adicionado automaticamente a ele.
   4. Use a janela de opções do plugin para fazer o seguinte.
      1. Revise e altere as coordenadas X e Y do centro ROI (calculado automaticamente como coordenadas do centro de massa física) usando barras de rolagem ou alterando os valores nas caixas de entrada correspondentes. Veja a Figura 1 B.
      2. Dependendo de quanto da região de fundo fora do objeto shoVocê deve estar coberto pela digitalização, ajuste os limites de digitalização usando a barra de rolagem "limite de digitalização". Veja a Figura 1 A.
         NOTA: O limite de digitalização é o número fracionado que representa a distância que a verificação deve prosseguir além da borda dos objetos em qualquer direção; O valor padrão é 1.20, indicando que o comprimento da varredura será 20% maior do que o raio do objeto na direção da varredura; Veja a Figura 1 A , linha tracejada externa).
      3. Modifique a saída do plugin usando as caixas de seleção "raio real", "subtrair fundo", "transformação polar" e / ou "traçar com desvio padrão".
      4. Clique em "OK" para executar o plugin. Veja a Figura 1 C-H .
         NOTA: Exemplos da saída do protocolo com "trama com desvio padrão" e "transformada polar" ou "raio real" e "polar transfOrm "selecionadas são mostradas na Figura 1 C e 1D e Figura 1 E e 1F , respectivamente. Observe que os valores de desvio padrão calculado (SD) representam a variação entre varreduras de intensidade de pixel radial individuais do objeto. Observe também a" seleção ROI Comprimento "na janela do plugin, que exibe as informações no comprimento do contorno ROI medido em pixels.
   5. No "Lote de perfil de digitalização de relógio" gerado, use o comando "Listar" para traçar valores exibidos em duas colunas de dados X e Y para imagens em escala de cinza e em X e quatro colunas Y de imagens RGB, das quais Y0, As colunas Y1, Y2 e Y3 serão preenchidas com valores de intensidade de pixel do canal de cor integral e individual (vermelho, verde e azul).
2. Múltiplo ROI Clock Scan plugin - trabalhando com ROI múltiplo ( Figura 2 ):
   1. Abra uma imagem contendo vários ROI.
   2. Abra o ROI Manager clicando em "Analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROI".
   3. Sequencialmente descreva (veja o passo 2.1.2) e adicione cada ROI ao ROI Manager, clicando em "Adicionar" na janela ROI Manager; Faça isso para todos os ROIs dentro da imagem. Use o comando "Analisar | Medir" se as métricas ROI forem de interesse.
      1. Veja a Figura 2 A para um exemplo de múltiplas seleções de linha segmentada e Figura 2 E para um exemplo de múltiplas seleções de polígono.
   4. Selecione "Multi Clock Scan" no menu "Plugins" para abrir a janela pop-up das opções de protocolo.
   5. Use a janela de opção de protocolo para fazer o seguinte.
      1. Se necessário, reponha o limite de digitalização conforme o passo 2.1.4.2; O valor padrão é 1.20.
      2. Se necessário, selecione a opçãoPara traçar o perfil médio de varredura do relógio com barras SD, verificando a caixa "Traçar com desvio padrão". Veja a Figura 2 C e D.
         NOTA: Os valores de SD calculados representarão variação entre perfis de varredura de relógio integral de objetos diferentes. Além disso, observe a linha na janela do plugin que exibe informações no "número de ROIs selecionados".
      3. Clique em "OK" para executar o protocolo.
   6. No "Roteiro de perfil de verificação de relógio" gerado, use o comando "Listar" para traçar os valores exibidos na janela "Lote de valores". Consulte a legenda da janela "Multi Clock Scan Profile Plot" para a designação da coluna por canal de cores.
   7. Observe que os ROIs são numerados e seus perfis de varredura de relógio para qualquer canal de cor são traçados na mesma seqüência em que os ROIs foram delineados e adicionados ao "Gerenciador de ROI".
3. MulPlugin de verificação do relógio ROI da Tiple - trabalhando com uma pilha de imagens ( Figura 3 ):
   1. Abra uma imagem-pilha de interesse.
   2. Abra o ROI Manager clicando em "Analisar | Ferramentas | Gerenciador de ROI".
   3. Descreva o ROI das imagens dentro da pilha e adicione-o ao gerenciador de ROI como descrito nas etapas 2.1.2 e 2.2.3. Use o comando "Analisar | Medir" se as métricas ROI forem de interesse.
   4. Selecione "Multi Clock Scan" no menu "Plugins" para abrir a janela pop-up das opções de protocolo.
   5. Use a janela de opção de protocolo para fazer o seguinte.
      1. Repor o limite de digitalização conforme descrito na etapa 2.1.4.2; O valor padrão é 1.20.
      2. Selecione a opção para traçar o perfil médio de varredura do relógio com barras SD, verificando a caixa 'Traçar com desvio padrão'.
         NOTA: Os valores de SD calculados representarão a variação entre diferentes instâncias do objeto selecionado na imagem staCk. Além disso, observe a linha na janela do plugin que exibe informações sobre o "número de imagens na pilha".
      3. Clique em "OK" para executar o protocolo.
   6. Na janela "Relógio Scan Profile Plot", clique em "List" para traçar os valores exibidos na janela "Plot Values", onde o número da coluna Y representa a posição da imagem dentro da pilha - 1.

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Resultados

As imagens que são usadas aqui para fins ilustrativos são tiradas de bancos de dados criados durante nossos estudos biológicos biológicos de células e tecidos anteriores ^{5 , 6 , 7} e do Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Ambos os plugins foram testados com sucesso usando ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 e Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g...

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Discussão

Protocolo de varredura de relógio: o protocolo de varredura de relógio é uma ferramenta rápida e simples de análise de imagem. As vantagens deste protocolo, em comparação com abordagens comuns existentes de análise de imagem (como varreduras de intensidade de pixel linear ou cálculo da intensidade média de pixels do ROI), foram descritas em detalhes nas publicações anteriores ^{1 , 9} . Resumidamente, este protocolo permite a geração ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function