Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Resumo

O estabelecimento de circuitos neuromusculares funcionais depende de conexões precisas entre desenvolvimento de axônios motores e músculos alvo. Os neurônios motores estendem os cones de crescimento para navegar por caminhos específicos, respondendo a uma grande quantidade de pistas de orientação axônica que emanam do ambiente extracelular circundante. O reconhecimento do alvo do cone de crescimento também desempenha um papel crítico na especificidade neuromuscular. Este trabalho apresenta um protocolo de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. Este protocolo inclui algumas etapas importantes, incluindo um procedimento de genotipagem, para classificar os embriões mutantes desejados; Um procedimento de imunomarquação, para marcar embriões com anticorpo fasciclin II (FasII); E um procedimento de dissecação, para gerar preparações em filetes a partir de embriões fixos. As projeções do axônio do motor e os padrões musculares na periferia são muito melhor visualizados em preparações planas de embriões em filetes do que em whEmbriões de montagem clara. Portanto, a preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo, e também pode ser aplicado tanto às telas genéticas de perda de função como de ganho de função .

Introdução

As conexões precisas e seletivas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento embrionário são essenciais para a locomoção normal em larvas de Drosophila . O padrão embrionário de 30 fibras musculares em cada um dos hemisegmentos abdominais A2-A7 é estabelecido pelo estágio 16 ¹ . Os 36 neurônios motores que são gerados no nervo ventral prolongam seus axônios na periferia para inervar os músculos alvo específicos ² . A identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo podem ser visualizados por imuno-histoquímica com um anticorpo (anticorpo monoclonal de mouse 1D4) ^{3 , 4} . Múltiplas imagens dos padrões de projeção do axônio do motor em embriões de tipo selvagem estão disponíveis na web ⁵ . O anticorpo 1D4 rotula todos os axônios motores e três fascículos do axônio longitudinal em cada lado da linha mediana do sistema nervoso central embrionário (SNC) ^{4 , 6} ( Figura 1C e Figura 2A ). Portanto, a imuno-histoquímica com anticorpo FasII fornece uma poderosa ferramenta para identificar os genes necessários para a conectividade neuromuscular para demonstrar mecanismos moleculares subjacentes à orientação do axônio motor e ao reconhecimento do alvo.

Em cada um dos hemisegamentos abdominais A2-A7, os axônios motores projetam e se fasciculam seletivamente em dois ramos nervosos principais, o nervo segmentar (SN) e o nervo intersegmental (ISN) ^{2 , 4} e um ramo nervoso menor, o nervo transversal (TN ) ⁷ . O SN seletivamente defascicula para dar origem a dois ramos do nervo chamados SNa e SNc, enquanto a ISN se divide em três ramos do nervo chamado ISN, ISNb e ISNd ^{2 , 4} . Entre eles, o ISN do motor ISN, ISNb e SNaOs padrões de projeção são visualizados de forma mais precisa quando os embriões do estágio final 16 são corados com anticorpo FasII e são fileados ( Figura 1C e Figura 2A ). Os neurônios motores ISN estendem seus axônios para inervar os músculos dorsais 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). Os neurônios motores ISNb inervam os músculos ventrolatares 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 ^{2 , 4} ( Figura 2A e 2B). O ramo do nervo SNa projeta para inervar os músculos laterais laterais 5, 8, 21, 22, 23 e 24 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). O TN, que consiste em dois axônios motores, projeta-se ipsilateralmente ao longo da borda segmentar para inervar o músculo 25 e faz sinapses com o neurônio dendrítico bipolar lateral (LBD) noPeriferia ⁷ ( Figura 2A ). Essas inervações musculares alvo exigem não apenas a defasciculação seletiva de axônios motores em pontos de escolha específicos, mas também o reconhecimento muscular alvo. Além disso, algumas células putativas mesposéricas de guia que atuam como objetivos intermediários foram encontradas nas vias ISN e SNa, mas não ao longo da via ISNb ⁴ . Isso pode sugerir que a direção do axônio do motor ISNb pode ser regulada de forma distinta em relação à orientação do axônio do motor ISN e SNa, e também indica que a orientação axônica do motor periférico fornece um modelo experimental atraente para estudar os papéis diferenciais ou conservados de uma única guia de orientação Molécula ⁸ .

Este trabalho apresenta um método padrão para visualizar os padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila . Os protocolos descritos incluem como dissecar embriões fixos corados com 1D4 aNitido e processado em 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para preparações em filetes. Uma vantagem crítica das preparações planas de embriões fixos é a melhor visualização das projeções axonais e dos padrões musculares na periferia. Além disso, este trabalho também mostra como genótipos embriões fixos para classificar os embriões mutantes desejados usando o método de coloração LacZ.

Protocolo

1. Preparação

1. Preparar 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com solução de t-octilfenoxipoletoxietanol (PBT) adicionando 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5 mL de t-octilfenoxipoletoxietanol (ver Tabela de Materiais) a 500 mL de PBS 1X E mexendo durante pelo menos 30 min. Armazenar a 4 ° C. Use quando relativamente fresco e guarde a solução em uma garrafa limpa.
2. Faça 10 mL de paraformaldeído a 4% adicionando 2,5 mL de solução de paraformaldeído em estoque a 16% e 1 mL de PBS 10x a 6,5 ​​mL de água desionizada. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana.
   CUIDADO: Evite o contato da pele com a solução de paraformaldeído porque é altamente tóxico.
3. Faça o substrato X-Gal (10% p / v de X-Gal em dimetilsulfóxido (DMSO)) dissolvendo 0,1 g de substrato X-Gal por 1 mL de DMSO. Armazenar a -20 ° C em alíquotas de 100 μL.
4. Faça solução de coloração de X-Gal usando tampão de fosfato 10 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, 3 mMK4 [FeII (CN) ₆ ], K ₃ [FeIII (CN) ₆ ] 3 mM e 0,3% de t-octilfenoxipoletoxietanol. Armazenar a 4 ° C no escuro.
5. Faça 3% de solução de peróxido de hidrogênio diluyendo 30% de peróxido de hidrogênio em estoque 1:10 com água desionizada.
6. Faça solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) dissolvendo completamente 1 comprimido (10 mg) de DAB em 35 mL de solução de PBT fresca. Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 μm e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 910 μL.
   CUIDADO: Descarte todos os resíduos DAB em água sanitária para destruir o DAB.
7. Faça ovos com suco de maçã. Adicione 35 g de ágar e 1 L de água desionizada a um balão de 2 L. Adicione 33 g de sacarose, 2 g de tegosept e 375 mL de suco de maçã a um balão de 1- L. Derreta-os por autoclave por 30 min. Permita que ambas as soluções esfriem a cerca de 60 ° C. Combine e misture bem estas soluções por agitação. Despeje ~ 11 ml de solução combinada por prato de cultura de 60 mm.
8. Faça pasta de fermento misturando o padeiro simSt em água desionizada (razão 1: 0,8) e armazenar a 4 ° C.

2. Coleção de embriões (dia 1)

1. Colecione moscas jovens do sexo feminino e do sexo masculino (menos de 5 dias) e, durante 1-2 dias, mantenha-as em uma gaiola de plástico com uma placa de ovo (60 mm x 15 mm) que contém uma pequena quantidade de pasta de levedura no centro.
2. Para a recolha óptima de embriões de fase final 16, crie uma gaiola de garrafa com moscas (> 50) por volta das 5 horas e deixe-as colocar ovos a 25 ° C por 3 h.
3. Transfira as moscas para uma garrafa de comida fresca.
4. Feche a placa de ovo com a tampa e incuba-a à cabeça a 25 ° C numa incubadora humidificada (~ 70% de umidade) durante a noite.

3. Preparação de embriões para imunossinção (dia 2)

1. Adicione 1,8 ml de solução PBT à placa de ovo por volta das 10:20 AM e use um cotonete de algodão para afrouxar os embriões da placa enquanto o inclina.
   Nota: Misturando suavemente a pasta de fermento usando um cottNo cotonete, dissolva-o no caso de um grande número de embriões serem encontrados nele. Comece a colecionar os embriões ~ 40 min antes da fixação (cerca de 11:00 da manhã).
2. Transfira os embriões da placa de ovo para um microtubo de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta de 1 ml.
3. Permita que os embriões se assentem e aspirem a solução PBT tanto quanto possível. Enxágüe os embriões duas vezes com 1 mL de solução de PBT. Aspirar a solução PBT tanto quanto possível.
4. Encha o tubo com 1 mL de água de lavagem a 50% ( isto é, diluído em água desionizada) e desencoride os embriões incubando-os em uma porca durante 3 minutos à temperatura ambiente (RT).
   Nota: Esta etapa não mata os embriões dechorionados.
5. Permitir que os embriões dechorionados se assentem, aspirar o lixívia a 50% o máximo possível e enxaguar os embriões 3 vezes com 1 mL de solução de PBT.
6. Adicione 0,5 mL de heptano e, subsequentemente, adicione 0,5 mL de solução de paraformaldeído a 4% ao tubo na RT por volta das 11:00 da manhã.
7. Incube oEmbriões em um nutator por 15 minutos na RT.
8. Remova a solução de paraformaldeído a 4% (a camada inferior).
9. Adicione 0,5 mL de 100% de metanol e desvitellinize os embriões agitando vigorosamente o tubo durante 30 s.
10. Remova o heptano ( ou seja, a camada superior).
11. Adicione 0,5 mL de metanol a 100% e agite vigorosamente o tubo durante 10 s.
12. Permitir que os embriões se assentem tocando o tubo e aspirar o metanol o máximo possível. Enxaguar os embriões com 1 mL de metanol a 100%, agitando por menos de 10 s.
    Nota: exposição prolongada ao metanol destrói a atividade de β-Gal.
13. Remova o metanol e enxágue os embriões devitellinizados 3 vezes com 1 mL de solução de PBT.

4. Genotipagem dos embriões com coloração LacZ (dia 2)

1. Adicione 1 mL de solução de PBT ao tubo e incuba o tubo em um bloco de calor de 37 ° C ou banho de água durante 15 min.
2. Durante a incubação, coloque solução de coloração com X-Gal (1 mL por tuSer) a 65 ° C em banho-maria até ficar nublado. Incubar em um banho de água a 37 ° C.
3. Aspirar a solução PBT e adicionar 1 mL de solução de coloração X-Gal e 20 μL de substrato X-Gal ao tubo.
4. Incubar o tubo a 37 ° C com nutação até um precipitado azul ser evidente.
   Nota: O tempo de incubação para o ^2º e ^3º balanços azuis em geral varia de 2-4 h.
5. Remova a solução de coloração X-Gal e enxágue os embriões 3 vezes com 1 mL de solução de RT PBT.
6. Usando uma sonda ou agulha de agulha, separe os embriões do genótipo desejado ( isto é, embriões brancos não manchados) com um microscópio de dissecação leve (objetivos de 1,6 x 2,5 x).
   Nota: Uma vez que alguns equilibradores azuis, como CyO, actina-LacZ e TM3, actina-LacZ , carregam uma construção transgênica que expressa a β-Gal bacteriana (LacZ) sob o controle do promotor de actina , os embriões manchados de azul de maneira omnipresente contêmUma ou duas cópias dos cromossomos do balanço azul. Portanto, os embriões brancos não manchados são homozigotos para o alelo letal desejado.

5. Imunossinção de Embriões com Anticorpos Anti-Fasciclin II (Dia 2-3)

1. Recolher e transferir os embriões do genotipo desejado ( ou seja, embriões brancos não manchados) para um microtube de 0,5 mL usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
   Nota: Nesta etapa, os embriões podem ser organizados grosseiramente de acordo com critérios morfológicos, incluindo os padrões de segmentação da cutícula e as estruturas da cabeça e da cauda ⁹ . Durante a involução da cabeça, entre 10 e 16 h após a deposição dos ovos, o embrião sofre uma redução pronunciada do segmento anterior anterior ⁹ .
2. Lavar os embriões uma vez com 0,4 ml de solução de PBT e adicionar 0,3 mL de solução de bloqueio (5% de soro normal de cabra e 5% de DMSO na solução de PBT).
3. Bloqueie os embriões com nutação à TA por 15 min.
4. Adicionar 75 μL de anticorpo anti-Fasciclin II e incubar o tubo com nutação à TA durante a noite.
5. Lavar os embriões 4 vezes com 0,4 mL de solução de PBT durante pelo menos 20 minutos por lavagem.
6. Adicione 0,3 ml de solução de bloqueio (5% de soro normal de cabra na solução de PBT) contendo anticorpo de cabra anti-rato-HRP (2 μg / mL) e incuba o tubo com nutação à TA durante a noite.
7. Lavar os embriões 6 vezes com 0,4 mL de solução PBT durante pelo menos 20 min por lavagem.
8. Adicione 0,3 mL de solução DAB ao tubo.
   CUIDADO: Use luvas e coloque todos os resíduos / sugestões DAB em água sanitária.
9. Adicione 2 μL de peróxido de hidrogênio a 3% e incuba o tubo no escuro com nutação à TA até que a quantidade desejada de precipitado seja produzida.
   Nota: O tempo de incubação para a imuno-histoquímica 1D4 em geral varia de 0,5-1 h.
10. Lave os embriões 4 vezes com 0,4 mL de solução de PBT.
    CUIDADO: remova a solução DAB e as duas primeiras lavagens com uma pipeta e diEspreite-os em água sanitária.
11. Adicione 0,2 mL de solução de glicerol a 70% / PBS ao tubo e armazene à TA ou 4 ° C.
    Nota: Mantenha o tubo longe da luz. Podem obter-se preparações mais claras colocando os embriões numa solução a 90% de glicerol / PBS ¹⁰ . No entanto, é mais difícil dissecar embriões eliminados em 90% de solução de glicerol / PBS do que os desmatados em solução de glicerol a 70% / PBS ¹⁰ .

6. Estadiamento, Dissecação, Montagem e Imagem dos Embriões (Dia 4)

1. Para o estadiamento, transfira os embriões equilibrados com 70% de glicerol / PBS em uma lâmina de vidro.
2. Recolher embriões de estágio final 16 que tenham os nervos do nervo ISN 7 do segmento abdominal (A7), A8 e A9 que convergem para tocar-se e / ou ter o intestino médio subdividido em três bandas.
   Nota: Os embriões corados com anticorpo 1D4 podem ser encenados com base nos padrões de projeção dos axônios motores ISN e ISNb. Depois de sair do SNC, A7, A8 e A9 ISN neDe embriões do estágio final 16, convergem para se tocar uns aos outros e subsequentemente divergem para se estender para os músculos dorsais (seta na Figura 1A ). Em embriões de meio estágio 16, no entanto, os nervos A7 ISN se estendem em paralelo com os nervos A8 / A9 (suporte quadrado na Figura 1B ). Além disso, os eixos de projeção dos nervos A6 ISNb (perpendiculares aos músculos ventrolaterais) em ambos os hemregmentos são aproximadamente alinhados com a extremidade posterior dos fascículos do axônio longitudinal do SNC (setas e uma linha na Figura 1C ). Estes critérios morfológicos variam um pouco entre diferentes genótipos. Alternativamente, os embriões podem ser encenados com base na morfologia intestinal ^{9 , 11} . Antes do estágio 17, o intestino médio tem uma forma semelhante a um coração, enquanto o intestino médio é subdividido em três bandas pelo estágio 17 ¹² .
3. Dissecar os embriões.
   1. Usando 1 mL, mova cada embrião para fora da gota de glicerol e coloque o embrião com a face ventral para cima. Corte a parte anterior em 1/4 do comprimento do corpo e na região mais posterior que está livre de axônios motores.
   2. Usando uma sonda de agulha, mova o embrião final para fora da gota de glicerol, role para orientá-lo de lado dorsal para cima e coloque-o horizontalmente no campo.
      Nota: Quando o embrião é removido da gota de glicerol, um pouco de glicerol associado ao embrião torna-o pegajoso.
   3. Corte o embrião ao longo da linha média dorsal usando uma única agulha de tungstênio muito fina ¹³ . Faça um pequeno corte na extremidade posterior do embrião e depois continue a reduzir a linha média dorsal em direção à anterior; O corte na direção oposta também é bom.
   4. Usando uma sonda de agulha, mova o embrião da linha média para a gota de glicerol, coloque-o de lado dorsal para cima e separe o intestino da parede do corpo, desdobrando cada parede do corpo em uma direção ventrolateral (diagonal) (2Objetivo .5X).
      Nota: Certifique-se de que a linha média dorsal está totalmente cortada, resultando na separação completa entre as paredes do corpo esquerdo e direito.
   5. Mova com cuidado o embrião da linha média para fora da gota de glicerol e, em seguida, coloque duas abas da parede do corpo para baixo no slide de vidro usando uma sonda de agulha fina (objetivo 2.5X).
   6. Usando uma agulha de tungstênio muito fina, remova os órgãos internos do embrião dissecado empurrando-os lateralmente (objetivo 5X).
      Nota: uma descrição mais detalhada de outro procedimento de dissecção semelhante pode ser encontrada no site ⁵ .
4. Para a montagem, adicione 2-3 μL de solução de glicerol / PBS a 70% para limpar os embriões dissecados e, usando uma sonda de agulha fina, transfira-os para uma nova corrediça de vidro sobre a qual foram colocados 8 μL de solução de glicerol a 70% / PBS em O centro (objetivo 2.5X).
5. Coloque uma lamínula (18 mm x 18 mm). Selar as bordas da lamínula com esmalte de unhas regulares (ouClaro ou colorido é bom).
6. Capture imagens em alta resolução (objetivos de imersão de óleo 20X, 40X e 63X) sob um microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC), de acordo com as instruções do fabricante.
   Nota: melhor visualização e caracterização fenotípica, especialmente para axônios motores ISNb, podem ser produzidos usando um objetivo de imersão a óleo 63X.

Resultados

As conexões precisas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento neural dependem da repulsão axônica-axônica seletiva e do reconhecimento de alvo em pontos de escolha específicos ⁴ . Em Drosophila , a repulsão seletiva entre axônios motores é em parte regulada pela ação combinada de semaforinas de classe 1 e 2 (Semas), incluindo Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b ^{8 , 14}

Discussão

Os detalhes dos defeitos de orientação do axônio do motor são mais rápidos e com melhor precisão pela preparação em filetes de embriões corados com DAB do que por microscopia confocal de varredura laser de marcadores fluorescentes. Portanto, a preparação em fileira de embriões corados fixos e 1D4 é mais adequada para a caracterização funcional de moléculas de orientação. Quatro principais classes de dicas de orientação, incluindo netrins, Slits, semaforas (Semas) e ephrins, e seus receptores cognatos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)