Análise do elevado-throughput de comportamento Locomotor no ensaio de ilha de Drosophila

Resumo

O ensaio da ilha é um ensaio relativamente novo e econômico que pode ser usado para avaliar o comportamento locomotor básico de Drosophila melanogaster. Este manuscrito descreve algoritmos para processamento automático de dados e quantificação objetiva dos dados de ensaio de ilha, dificultando a ensaiar uma leitura sensível, elevado-throughput para telas grandes de genéticas ou farmacológicas.

Resumo

Avanços em tecnologias de sequenciamento de última geração contribuem para a identificação de genes de doença (candidato) para distúrbios do movimento e outras doenças neurológicas, a uma velocidade crescente. No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares que estão subjacentes a esses transtornos. A caixa de ferramentas comportamental, molecular e genética da Drosophila melanogaster faz com que este organismo modelo particularmente útil para caracterizar a nova doença de genes e mecanismos de forma elevado-throughput. No entanto, telas de alta produtividade exigem ensaios eficientes e confiáveis que, idealmente, são cost-effective e permitir a quantificação automatizada dos traços relevantes para esses transtornos. O ensaio da ilha é um rentável e facilmente de set-up método para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila . Neste ensaio, moscas são lançadas em uma plataforma de uma altura fixa. Isso induz uma resposta inata de motor que permite que as moscas escapar da plataforma dentro de segundos. Neste momento, análises quantitativas dos ensaios ilha filmadas são feitas manualmente, que é um empreendimento laborioso, particularmente ao realizar grandes ecrãs.

Este manuscrito descreve os algoritmos"Drosophila ilha ensaio" e "Ilha do ensaio análise" para alta produtividade, processamento automatizado de dados e quantificação de dados de ensaio da ilha. No menu configuração, uma simples webcam conectada a um computador portátil recolhe uma série de imagem da plataforma enquanto o ensaio é realizado. O algoritmo de"Drosophila ilha ensaio" desenvolvido para o software open-source Fiji processa estas séries de imagem e quantifica, para cada condição experimental, o número de moscas na plataforma ao longo do tempo. O roteiro de "Ilha do ensaio análise", compatível com o software livre R, foi desenvolvido para processar automaticamente os dados obtidos e calcular se tratamentos/genótipos são estatisticamente diferentes. Isto grandemente melhora a eficiência do ensaio ilha e torna uma leitura poderosa para locomoção básica e comportamento de voo. Assim, pode ser aplicado para telas grandes investigando voar capacidade locomotora, modelos da drosófila de distúrbios do movimento e a eficácia da droga.

Introdução

Nos últimos anos, avanços em tecnologias de próxima geração de sequenciamento contribuíram grandemente para a identificação de genes subjacentes transtornos degenerativa do cérebro (por exemplo, ataxia cerebelar e a doença de Parkinson), de periférico neuronal origem (por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica e paraplegia espástica hereditária) e de origem muscular (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne e distrofia miotônica)^1,2,3,4 . Apesar disso, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares que sustentam a maioria destes transtornos. Uma melhor compreensão desses mecanismos é essencial para o desenvolvimento de terapias.

Como em humanos, movimento em organismos-modelo, como voo e locomoção em Drosophila, é controlado pelo cérebro central, sistema nervoso periférico e músculos. Além disso, o tempo de geração rápida e caixa de ferramentas genética da Drosophila tornam este organismo modelo particularmente adequado para o rastreio de alto rendimento de genes envolvidos em distúrbios do movimento e para^{5,6 de testes de drogas} . Devido ao número substancial de condições que precisam ser testados em tais telas, confiáveis e econômicas e ensaios simples relativos, bem como ferramentas para quantificar os resultados de saída de forma automatizada, são altamente desejáveis.

Schmidt et al . (2012) ⁷ descreveu um teste de baixo custo chamado ensaio de"ilha" para avaliar o comportamento locomotor de Drosophila . O ensaio da ilha tem sido usado com sucesso em seleções em grande escala para identificar os genes com funções específicas glia⁷, na avaliação dos modelos de drosófila de deficiência intelectual⁸e para a avaliação geral de Voe de comportamento motor⁹. O design do princípio do ensaio ilha consiste em uma plataforma elevada sobre a qual são lançadas várias moscas. Isto induz um comportamento motor inato que permite saudáveis moscas escapar da plataforma dentro de segundos. O teste mede o número de moscas, permanecendo na plataforma sobre tempo^7,8,9. Todas estas características indicam que o ensaio da ilha pode ser uma ferramenta poderosa de triagem para genes envolvidos em distúrbios do movimento.

Atualmente, a análise quantitativa dos dados de ensaio filmado ilha é feita manualmente^7,8,9. Para melhorar a eficiência do ensaio, um método de baixo custo foi desenvolvido para quantificar semi-automática a fuga de moscas da plataforma. A instalação usa uma simples webcam conectada a um computador portátil para recolher imagem tempo série da plataforma, com quadros adquiridos a cada 0.1 s. quadros são processados em seguida com a macro"Drosophila ilha ensaio" que quantifica o número de moscas na plataforma sobre está na hora. A macro"Drosophila ilha ensaio" é dividida em três macros sub independentes: (I) o "Create pilha e projeção," macro sub identifica experiências diferentes ilha armazenadas nas subpastas diferentes e cria uma pilha e uma projeção de cada um série de tempo. (II) a macro sub "Definir a plataforma" consecutivamente abrirá todos os arquivos "Projection_image_name.tif", localizados nas subpastas individuais experimentais, no ponto em que o usuário é solicitado para definir manualmente a plataforma da ilha como a região de interesse (ROI). (III) "análise" automaticamente quantifica o número de moscas restante na plataforma durante o período de tempo. O sub macros podem ser executado consecutivamente (em uma corrida) ou de forma independente. Para análise estatística dos dados, um script foi desenvolvido para processar automaticamente os dados obtidos e aplicar um teste estatístico para determinar se os tratamentos/genótipos se comportam significativamente diferentes entre si (Figura 1). Finalmente, está demonstrado que esta configuração pode ser usada para avaliar e quantificar a capacidade de locomoção aberrante de um modelo de drosófila para ataxia-telangiectasia (AT).

Protocolo

1. construção da caixa de ensaio ilha

1. Prepare uma bandeja feita de um material robusto, como poli metil metacrilato (PMMA), para conter uma camada de água (ou seja, um banho). Certifique-se de que o material não é branco.
   Nota: Dimensões de 40 x 35 x 2.5 cm ³ são recomendadas ( figura 1A).
2. Preparar uma caixa (42 x 38 x 25 cm ³) feita de um material robusto, transparente, tais como PMMA, colocados ao redor da banheira para evitar as moscas escapem para o espaço do laboratório. Coloque um buraco (20 x 30 cm ²) no lado lateral que é grande o suficiente para o experimentador facilmente manipular os frascos com moscas e deixá-los na ilha ( figura 1A).
3. Preparar uma plataforma elevada 10 x 15 x 2,5 cm ³ em dimensão, feita de um material impermeável (PMMA ou plástico) que é à prova d'água.
   Nota: Esta plataforma é necessário ter uma superfície uniforme branca para garantir bom contraste para análise de imagem. O tamanho não é necessariamente fixo, mas deve ser grande o suficiente para garantir que todas as moscas inicialmente pousar na plataforma e tem a chance de andar sobre ela ( figura 1A).
4. Consertar a plataforma por colagem em para o banho ou colocação de pesos ou outros objetos pesados dentro da caixa da plataforma para evitar mudanças posicionais da plataforma durante a sessão experimental/filmando.

2. Requisitos de software e instalação

1. instalação de software de gravação de imagem.
   1. Download de software de gravação de imagem para gravar a série de imagem de ilha (consulte a Tabela de materiais) e instalar o software em um computador.
      Nota: O software de gravação de imagem descrito no presente protocolo só é suportado pelo Windows. Uma alternativa para outros usuários foi adicionada para a Tabela de materiais.
2. " Ensaio de ilha de drosophila " instalação de macro.
   1. Baixar o " Drosophila ilha ensaio " macro e o Fiji compatível versão ¹⁰ (1.4 ou superior) do seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
   2. Move o cursor para o " ensaio ilha " diretório e clique em " vista. "
   3. Clique no " baixar tudo... " o conteúdo da pasta será baixado como um arquivo. zip, descompacte o arquivo baixado.
   4. Cópia da " Assay.ijm ilha de Drosophila " arquivo em " Fiji.app/plugins/directory. "
      Nota: Ao iniciar o Fiji, a " Drosophila ilha ensaio " macro aparecerá na parte inferior do menu dropdown plugins.
3. " Ilha ensaio análise " script de instalação e download.
   1. Download R ¹¹ partir do seguinte Web site: https://cran.rstudio.com. Instalado em um computador.
   Studio
   2. R download do seguinte site: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Instalado em um computador.
      Nota: O " teste de análise de ilha " script pode ser executado com R só. Studio R, com sua interface do usuário mais fácil, é apresentado como um passo alternativo para usuários inexperientes com R.
   3. Download a " ilha ensaio análise " script do " ensaio de ilha de Drosophila " diretório no seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Nota: depois de executar o passo 2.2, a " ilha ensaio análise " script também pode ser encontrado na pasta descompactada chamado " ilha do ensaio... "

3. Preparação das moscas para serem testados no ensaio de ilha

1. coletar encenado moscas para cada condição experimental sob frio ou anestesia de dióxido de carbono (CO ₂), como descrito anteriormente ¹³ (durante um período de 1 - 2 dias).
   1. Prepare um mínimo de 3 frascos de amostra por condição experimental, cada um contendo aproximadamente 15 encenado voa. Utilize apenas voa com asas intactas e que são da mesma idade e sexo.
      Nota: Para os experimentos descritos aqui, amostra 5 frascos contendo 15 moscas masculinas do genótipos w ^–; Actina-Gal4 / + (controle) e w ^–; Actina-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) foram coletados no dia da eclosão, envelhecido por 4 dias e foram usados para realizar o ensaio da ilha. RNAi, cepas de controle e o driver de actina-gal4 foram obtidos de um comercial de origem (consulte a Tabela de materiais).
2. Deixe as moscas recuperar para evitar efeitos de anestésicos (pelo menos 1 dia ao usar CO ₂) antes de testar as moscas coletadas no ensaio com a idade de interesse ilha.

4. instalação experimental

Nota: ver figura 1B.

1. Adicionar água fria com uma pequena quantidade de sabão para a bandeja de banho e posicionar a plataforma no meio.
   Nota: O sabão diminui a tensão superficial da água; moscas que tocam a água vão se afogar. Isso impede que quantidades crescentes de moscas voando na caixa durante a progressão da sessão experimental.
2. Coloque a caixa transparente em cima da bandeja e iluminar a plataforma acima usando uma lâmpada de.
   Nota: Iluminação da plataforma é principalmente necessária para garantir adequada a contraste. Uma luz de LED 12 V comum é apropriada para isto.
3. Posicione a webcam diretamente acima da plataforma (fora da caixa) e conectá-lo a um computador.
4. Criar novas pastas no computador para armazenar os dados experimentais diferentes antes dos experimentos.
   1. Seguem a estrutura do exemplo ilustrado na Figura 2A para criar as pastas. Por exemplo, se o delineamento experimental requer testes dois genótipos com cinco repetições cada, primeiro crie uma pasta principal, que contém a data do experimento. Dentro da pasta principal, crie duas subpastas (um por genótipo). Dentro das pastas de genótipo, criar cinco novas subpastas, uma por replicar.
      Nota: Para uma análise mais adicional, é essencial que a série de imagem correspondentes às experiências individuais é salvos em pastas com nomes exclusivos.

5. A configuração configurações no " dispositivo de captura " seção da Interface do

1. abrir o software de gravação de imagem e, sob o " captura " guia, clique no " imagens do tempo-lapso … " e selecione a webcam apropriado como o " Capturar dispositivo. "
2. Coloque uma mosca morta na ilha; ajustar as configurações de vídeo clicando sobre a " configurações de vídeo " caixa. Percorrer as barras de ferramentas, ajuste de brilho, contraste e cor de uma forma tal que a mosca morta aparece preta sobre um fundo branco ( Figura 2B). Quando os ajustes estiverem concluídos, clique " Okey. "

6. Gravação e salvando as configurações configuração vídeo no " Time-Lapse " seção da Interface

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Ajustar as configurações do " tempo-lapso filme Setup " para salvar o experimento como um arquivo. avi. Clique no " procure …, " selecione o diretório onde será armazenado o filme, definir o nome do vídeo e pressione " salvar... "
Nota: O arquivo de vídeo não é usado para a quantificação de dados; no entanto, pode ser útil ter uma ideia geral sobre o experimento.

Ajustar as configurações do " tempo-lapso filme Setup " seção.

1. Na caixa compactação, selecione " código Intel IYUV " para compressão de vídeo e escolher " levar um quadro a cada 0,1 segundos, " com o " taxa de Play-back (imagens por segundo): " 10.
2. Salvar a série de tempo de experiência como. bmp frames clicando no " avançado … " selecione " criar uma imagem. bmp para cada capturado frame. " clique em " Browse. " selecione o mesmo diretório no " captura de filme AVI durante " janela (como escolhida na etapa 6.1), clique em " aberto, " e pressione " Okey. "
   Nota: Observe que, durante o experimento, os quadros são armazenados como arquivos. bmp (necessários para análise de dados). O programa nomeia os quadros como " A " seguido do número correspondente à sequência de captura de quadro (por exemplo, " A_number.bmp ") ( Figura 2). Sempre salve as imagens pertencentes a diferentes experiências em uma nova pasta para garantir que não será substituído série imagem gravada anteriormente. Esteja ciente de que as imagens não são salvas automaticamente na mesma pasta que o arquivo de vídeo a menos que esta pasta está selecionada em " procure … " ao clicar o " avançado " caixa.

7. Ilha de ensaio e coleta de dados

1. pressione o botão start na interface do lapso de tempo imagem do software de gravação de imagem para iniciar a gravação.
2. Toque o frasco experimental contendo moscas (etapa 3) 2 - 3 vezes para garantir que as moscas são na parte inferior do frasco. Rapidamente remover a tampa do frasco e, com um movimento vigoroso, toque o frasco na plataforma para que todas as moscas caem sobre a plataforma ao mesmo tempo ( Figura 1).
3. Após aproximadamente 30 s, pressione o " parar de " o botão para parar a gravação.
   Nota: Se todas as moscas desaparecem da plataforma, a gravação pode ser interrompida de antes.
4. Remover as moscas que permanecem por 30 s na plataforma por mão depois de parar a gravação de imagem.
5. Antes de prosseguir para a próxima experiência de gravação, alterar o diretório de destino para os arquivos. bmp e filmes (ver secção 6).

8. Processamento de dados: Executando o " ensaio de ilha de Drosophila " Macro

Nota: ver Figura 1.

1. Executar o " criar a pilha e projeção " macro sub eu produzir pilhas e projeções da série imagem coletada.
   1. Fiji iniciar, clique em " Plugins " na barra de ferramentas e escolheu " ensaio de ilha de Drosophila " no menu suspenso; aparecerá uma nova janela.
   2. Enter o " primeira imagem identificador de série de tempo " configuração na interface gráfica do macro.
      Nota: Os quadros de imagem gravada são salvos como " A-number.bmp " de acordo com a ordem em que as imagens são obtidas. No " primeiro frame identificador " interface de macro, preencha a configuração com o número dado ao primeiro quadro pelo programa e com a extensão de arquivo. Preencher " primeiro frame identificador " com "-0001.bmp, " desde o primeiro quadro chama-se " A-0001.bmp " ( Figura 2). No caso de outros formatos de imagem (por exemplo,. TIFF ou. jpeg) são gerados pelo software do webcam, especificar a extensão de arquivo correto da primeira imagem no " primeira imagem identificador de série de tempo. "
   3. Selecione apenas o " criar a pilha e projeção " sub macro, clique em " Okey, " e selecione o diretório principal que contém todas as subpastas com experimentos de ensaio individual ilha.
      Nota: Os arquivos. bmp em cada indivíduo experimentar a pasta que contém o " primeiro frame identificador " posteriormente será processado. Dois novos arquivos aparecerá em cada subpasta da experiência individual, chamado por padrão " Stack_image_name.tif " e " Projection_image_name.tif " ( Figura 1). Uma vez que esta etapa é executada, os arquivos. bmp podem ser excluídos. Pilha e projeção. tif arquivos contêm todos os dados e são suficientes para uma análise mais aprofundada.
2. Executar o " definir a plataforma " II sub macro para selecionar a localização exata da plataforma.
   1. Abrir a interface gráfica do " ensaio de ilha de Drosophila, " selecione apenas o " definir plataforma " checkbox e pressione " Okey. "
   2. no " escolher um diretório " janela, selecione o diretório principal onde experimentais subpastas são armazenadas e pressione " Select. "
      Nota: O " definir a plataforma " macro sub procura automaticamente por " Projection_image_name.tif " arquivos em todas as subpastas armazenados no diretório principal. O " Projection_image_name.tif " imagem armazenada na pasta primeira, juntamente com duas janelas — " definir a plataforma " e " Gerenciador de ROI " — abrirá.
   3. Selecione o " seleções polígono " ferramenta da barra de ferramentas para desenhar uma seleção que coincida com a plataforma ilha.
      Nota: É muito importante excluir o limite da plataforma da seleção. Ver Figura 2D.
   4. Depois de selecionar a plataforma na primeira imagem, clique no " adicionar " no " ROI Manager " janela; a vontade de área selecionada aparecem na janela de Gerenciador de ROI como um conjunto de valores ( Figura 2D). Imprensa " Okey " no " definir a plataforma " janela. A macro deverá prosseguir para a próxima Projeção.
   5. Clique sobre os números ( Figura 2D) armazenado no " gerente de ROI " janela; a vontade de seleção anterior aparecem automaticamente na projeção atual imagem.
      Nota: desde a ilha plataforma é provável que tenha o mesmo tamanho e posição quando são realizados experimentos em uma fileira (desde que a posição da webcam e da ilha permanece inalterado), é útil armazenar o ROI definindo a plataforma no " ROI manager. " por fazê-lo, o usuário vai economizar tempo; nas próximas projecções, é necessário apenas clicar sobre a seleção temporariamente armazenada no Gerenciador de ROI.
   6. Se a posição da ilha mudou um pouco em comparação ao experimento anterior, ajuste a posição da seleção clicar no centro da seleção e arrastando a área selecionada para a posição desejada.
   7. Se a seleção não coincide com a plataforma, clique fora da seleção e delinear uma nova seleção para a plataforma usando o " seleção de polígono " ferramenta. Armazenar a nova seleção no Gerenciador de ROI clicando " adicionar; " uma nova seleção aparecerá no " gerente de ROI " janela que pode ser usada continuamente.
   8. Quando a seleção é ajustada, clique " Okey " no " definir a plataforma " janela e repita o procedimento até que todas as plataformas são definidas.
      Nota: Observe que uma imagem binária da plataforma correspondente à área ROI delineada em branco sobre um fundo preto, chamado " Platform_image_name.tif, " apareceu para cada imagem processada na subpasta mesma experimental como a pilha e projeção imagens geradas no passo 8.1.3 ( Figura 1).
3. Define o tamanho mínimo de mosca.
   Nota: Esta definição define o tamanho mínimo de voar em pixels. Partículas menores que o tamanho mínimo especificado serão excluídas da análise para evitar falsos positivos devido ao ruído.
   1. Abrir uma pilha de imagem criada pelo " criar a pilha e projeção " macro sub I.
   2. Converter a pilha de imagem de 8 bits clicando em imagem > > tipo > > 8-bit.
   3. Ir para o menu, pressione a imagem > > ajuste > > limiar, certifique-se de que o " fundo escuro " caixa está selecionada e pressione " aplicar; " uma segunda janela chamado " limiar " aparecerá. Clique no " backgro escuround " e pressione " Okey. "
      Nota: uma pilha de imagem binária será criada em que as moscas são definidas na plataforma em branco e preto. Quando isto não for o caso, aplicar o " invertido " função clicando em Editar > > inverter > > executar.
   4. Definir a escala para detectar o número de pixels clicando Analyze > > escala definida. Aplique as seguintes configurações: distância em pixels = 1, conhecido distância = 1, relação de aspecto do pixel = 1 e a unidade de comprimento = pixel. Imprensa " Okey. "
   5. Selecione a " varinha " ferramenta (rastreamento) na barra de ferramentas e clique em uma mosca (ponto preto) presente na plataforma. Pressione ctrl + m (usuários do Windows) ou cmd + m (para usuários Mac); um novo " resultados " janela irá indicar a área do ponto selecionado em pixels. Fazer isso consecutivamente para várias moscas e determinar o tamanho mínimo de mosca.
      Nota: Quando executar a macro, defina o " voar tamanho mínimo " configuração para o menor tamanho voar observado menos uma margem de 10%. ( Figura 2E).
4. Executar o " análise " sub macro III quantificar voa escapar da plataforma.
   1. Ir à barra de ferramentas, selecione " Plugins, " e escolheu o " ensaio de ilha de Drosophila. "
   2. ajustar o " voar tamanho mínimo " configuração de acordo com o valor definido no passo 8.3.
      Nota: Uso o valor definido no passo 8.3 apenas se a configuração padrão de " mosca tamanho mínimo " faz com que a exclusão das moscas que estavam presente na plataforma ou se a macro detecta o sinal de fundo como moscas.
   3. No " número de moscas por frasco " configuração, preencha o número máximo de moscas presentes nos frascos durante a experiência completa. Por exemplo, se um experimento tem frascos contendo 15 moscas, outros contendo 20 moscas e outros contendo 23 moscas, o " número de moscas por frasco " deve ser indicado como 23.
   4. Selecione o " Analyze " caixa de seleção e pressione " Okey; " um novo " escolher um diretório " janela aparecerá. Selecione o diretório principal (com todas as subpastas e arquivos dentro) e pressione " seleccionar. "
      Nota: A macro vai analisar todas as imagens armazenadas nas subpastas, contanto que eles contêm o " stack_image_name, " " Projection_image_name, " e " Platform_image_name " arquivos. A macro irá processar a imagem após imagem. A macro de saída consiste em uma pilha de imagem resultado binário chamada “ result_stack_subfolder_name.tif ” e um arquivo de texto de resultado chamado " result_subfolder_name.txt, " que aparecem em cada pasta de dados... O arquivo de texto (. txt) resultante contém medições quantitativas correspondentes à imagem pilha e é composto por 9 colunas. O conteúdo dessas colunas está resumido na tabela 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " corresponde à série de tempo a imagem de um experimento, onde moscas detectadas durante o experimento são representadas como pontos pretos em um fundo branco ( Figura 1E).
   5. Inspeccione cuidadosamente a pilha de resultado para garantir que nenhum artefato ocorreram e que a macro trabalhou com precisão ( Figura 2F).
      Nota: Exemplos de artefatos podem ser elementos de imagem que são não voa, mas que são detectados como tal pelo algoritmo de segmentação de imagem (falsos positivos). Isto pode, por exemplo, ser devido à deteção do sinal de fundo por causa de uma seleção imprecisa do ROI.

9. Análise de dados usando " ilha ensaio análise "

1. estrutura os dados conforme indicado na Figura 2A, para permitir a análise com a " ilha ensaio análise " script. Gerar um diretório principal com subpastas, onde cada subpasta corresponde a uma condição experimental para ser analisado.
2. Nas subpastas, gerar pastas que contêm as repetições experimentais independentes ( Figura 2A) e os arquivos de Results, produzidos pelo " ensaio de ilha de Drosophila " macro.
   Nota: A " ilha ensaio análise " macro processará todas as condições experimentais, localizadas no diretório principal de uma só vez.
3. Começar R ou R-studio. Clique no arquivo > > abrir o arquivo … na barra de ferramentas e selecione a " ilha ensaio análise " script
   1. Instalar o ggplot2 e matrixStats pacotes quando executando o " ilha ensaio análise " roteiro pela primeira vez. Digite o seguinte na janela do console:
      > install.packages("ggplot2"), digite
      > install.packages("matrixStats"), digite.
4. Especificar o local da saída de dados e análise de arquivos no script. Inserir as seguintes linhas de script:
   1. linha 16: inserir o caminho para o diretório principal que contém as experiências a serem analisados e comparados (na Figura 2A, este é o caminho direcionando para o " ilha ensaio " pasta).
   2. Linha 19: inserir o caminho para a pasta onde os arquivos de saída de análise são armazenados.
      Nota: O diretório indicado na linha 16 só pode conter as pastas a serem analisados. O script também não funcionará corretamente se os caminhos, inseridos na linha 16 e linha 19 são as mesmas.
5. Executar o script clicando em código > > região de executar > > executar todos na barra de ferramentas.
   Nota: Observe que três arquivos. csv resultante e um arquivo. txt resultante ( Figura 1E) aparecem no diretório definido na linha 19. Estas são: (I) a " data_all_conditions.csv " arquivo contém os dados processados correspondente para cada condição experimental e repetições experimentais, organizadas conforme descrito na tabela 2. (II) a " summary.csv de estatísticas " arquivo resume a média, o desvio padrão (SD) e o erro padrão da média (SEM) da percentagem de moscas na plataforma para cada condição experimental. (III) a " AUC.csv " arquivo contém a área sob a curva para cada replicar experimental. (IV) dependendo do número de condições presentes na pasta principal, o script irá de qualquer exportação um " Welch_t-test_results.txt " arquivo (2 condições) ou um " AUC_anova_results.txt " arquivo (mais de 2 condições), onde os resultados do teste-t ou ANOVA, comparando a área sob a curva entre as condições experimentais é indicado. Observe que quatro tipos diferentes de arquivos de imagem TIFF ( Figura 1E) aparecem no caminho definido na linha 19. Estes são chamados: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (onde Name_Of_Data_Folder representa o nome da pasta dado pelo usuário), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " e " AUC_anova.tiff. " informações detalhadas sobre o conteúdo destes gráficos podem ser encontrados nos resultados do representante deste manuscrito e na Figura 3.

Resultados

No protocolo descrito, dados de ensaio de ilha de Drosophila são adquiridos e processados em três etapas. Em primeiro lugar, a resposta de fuga de voo de Drosophila lançada para a plataforma da ilha é gravada com uma webcam e armazenada como imagens individuais. bmp (seções de protocolo 1-7). Em segundo lugar, a macro"Drosophila ilha ensaio" (passo 8) processa os quadros, gerando um arquivo de texto "result" (tabela 1), em que o número de objetos detectados em cada quadro é resumido e uma pilha de imagem "Result_stack.tiff", que mostra os objectos detectados dentro da área da plataforma em cada quadro. Em terceiro lugar, o roteiro de "Ilha do ensaio análise" (protocolo seção 9) processa os dados de macro armazenados nos arquivos de "Results" das experiências individuais. Vários passos são incorporados no script para filtrar e combinar os dados para a análise estatística. O primeiro quadro em que as moscas são lançadas na plataforma é detectado e considerado como o ponto do tempo 1. Quadros anteriores são eliminados do conjunto de dados. 100 frames seguindo tempo ponto 1 (correspondente a 10 s) são selecionados para análise. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma é menor do que 5 são excluídas automaticamente a partir da análise, eliminando resultados não-confiáveis de experimentos de fraca potência. Experiências em que o número inicial de moscas detectado na plataforma excede a configuração de "Número de moscas por frasco", mais uma tolerância de 3 são também excluídas. Isso elimina os conjuntos de dados no qual ruído partículas erroneamente foram detectadas como moscas. O script, em seguida, calcula a porcentagem de moscas detectado para cada ponto de tempo em comparação com o maior número de moscas detectado na série. Em conjuntos de dados causados por moscas andar dentro e fora do ROI (detectado como um decréscimo seguido por um aumento da percentagem de moscas na plataforma, ao longo do tempo) são automaticamente corrigidos os erros por considerando-os como consistentemente presente na plataforma em fases anteriores . Todos os conjuntos de dados replicar para uma determinada condição experimental que estavam presentes no diretório principal são combinados e exportados para o arquivo "data_all_conditions.csv". Suas colunas representam as variáveis descritas na tabela 2. O script também irá exportar um gráfico de linha para cada condição experimental, nomeado de acordo com a pasta que contém os dados. Este gráfico mostra a porcentagem de moscas, permanecendo na plataforma, ao longo do tempo (resposta de fuga de voo) para o experimental Replica presente na pasta respectiva (Figura 3A-B). A média, SD e SEM para cada condição experimental são calculados e resumidas no arquivo "Summary.csv de estatísticas". Um gráfico de linha, chamado "Escape_response_all_conditions.tiff" mostra a resposta de fuga de voo média para até 12 experimental condições presentes na pasta principal, a (Figura 3). Finalmente, a área sob a curva para todas as condições experimentais presentes na pasta principal é calculada e resumida no arquivo "AUC.csv". Dependendo do número de condições presentes na pasta principal, o script irá realizar também um bicaudal pareado Welch-teste t (2 condições) ou uma ANOVA com correção de Tukey para vários testes (mais de 2 condições) determinar se o experimental condições diferem entre si significativamente. Esses resultados estão resumidos no "Welch_t-test_results.txt" ou "AUC_anova_results.txt." Ao realizar a ANOVA, o script também irá exportar um arquivo de "AUC_anova.tiff" que exibe a diferença entre a média AUC e os intervalos de confiança de 95% das condições experimentais que são comparados. Os valores da área total sob a curva das repetições experimentais para todas as condições experimentais são exibidos como pontos de dados individuais com medianas em "AUC.tiff" (Figura 3D).

Ataxia Telangiectasia (AT) é uma desordem autossômica recessiva movimento caracterizada por início precoce de ataxia cerebelar devido a mutações no gene Ataxia Telangiectasia mutado (ATM)¹⁴. Mutantes da Drosophila orthologue de ATM, tefu, exibem defeitos em mobilidade e longevidade¹⁵. Para avaliar a macro "Ensaio de ilha dedrosófila" , um modelo de Drosophila da AT foi testado no ensaio de ilha, e a saída de dados da macro foi comparado com a contagem manual de dados. Os resultados mostram que onipresente tefu nocaute (w^–; Actin-Gal4/GD11950) diminui significativamente a capacidade dessas moscas para deixar a plataforma em comparação com seus controles de fundo genético (w^–; Actin-Gal4/+) (Figura 4). Depois de 1 s, 50% das moscas controle tinha escapado da plataforma, em contraste com o < 1% de tefuRNAi - voa. Importante, os dados obtidos com a macro fielmente reproduzidos os dados obtidos pelo manual, contando, indicando que a macro é uma ferramenta confiável que pode ser usada para a quantificação dos dados de ensaio da ilha e a avaliação de defeitos do movimento ( Figura 4 A-B).

Figura 1: fluxograma descrevendo os requisitos, procedimento experimental e análise do ensaio ilha. (A) ilha do ensaio o equipamento. (B) instalação Experimental para o ensaio da ilha. (C) ilha do ensaio. (D) processamento de dados de ensaio ilha com a macro"Drosophila ilha ensaio". A macro"Drosophila ilha ensaio" é composta de 3 macros sub: 1) fazer a pilha e projeção, 2) definem plataforma e 3) a análise. (E) processamento e avaliação estatística de dados usando o script de "Análise do ensaio de ilha". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: exemplos de diferentes ajustes necessários durante o protocolo de. (A) a necessária estrutura de diretórios em que ilha experimentos de ensaio devem ser armazenados para processamento de dados e análise. (B) ao ajustar as configurações de vídeo, devem aparecer moscas preto sobre um fundo branco. (C) quadro de imagem arquivos de saídacomo salvo pelo software de gravação de imagem descrito neste manuscrito. Estrutura de tópicos (D), o amarelo mostra a seleção de plataforma. A seleção de plataforma armazenado no "ROI Manager" é destacada em azul. (E) moscas são representadas como pontos brancos durante a adaptação do "mosca tamanho mínimo ajuste." A janela de resultados mostra a área das moscas em pixels. (F) exemplo de uma moldura única imagem gravada (à esquerda) e o correspondente quadro na pilha de imagem resultante, obtido com a macro"Drosophila ilha ensaio" (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: imagens do resultado obtido após o processamento de dados com o roteiro de "Ilha do ensaio análise" (A) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada controle experimental replicar. (B) linha gráfico mostrando a resposta de fuga de voo para cada tefu RNAi experimental replicar. (C) resposta de fuga de voo médio indicadas condições experimentais; as barras de erro representam os lotes do SEM. (D) ponto que representa a área sob a distribuição da curva para controle e condições mutantes. Experimental é replicada para ambas as condições de RNAi e controle tefu é exibidas como pontos de dados individuais (em preto) com medianas (linha vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Onipresente tefu knockdown moscas mostram uma capacidade significativamente diminuída de deixar a plataforma. Os dados representam a porcentagem de moscas na plataforma ao longo do tempo (s) para o controle (w^–; Actin-Gal4/+) e tefu RNAi (w^–; Actin-Gal4/GD11950) voa. (número de repetições = 5; as barras de erro representam o SEM). (A) dados brutos obtidos com a macro"Drosophila ilha ensaio". (B) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para as condições de controle e tefu RNAi, obtidos com a macro"Drosophila ilha ensaio" (Welch não emparelhadas, teste-t * * p < 0,01). (C) dados brutos obtidos contando manualmente o número de moscas presentes na ilha por segundo. (D) ponto parcelas que representa a área sob a distribuição da curva para controle e Tefu RNAi condições obtidas por contagem manual (Welch não emparelhadas, teste-t * * p < 0,01). As barras de erro representam o SEM. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da coluna	Descrição
Fatia	Nome do frame.
Contagem	O número de objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI).
Área total	Área total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.
Tamanho médio	Área total dos objetos detectados no quadro dividido pelo número de objetos dentro dos limites da plataforma (ROI).
% De área	A porcentagem de área ocupada pelos objetos em relação a área total da plataforma (ROI).
Perim.	Perímetro total dos objetos detectados no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.
Min. tamanho de voar	O mínimo voar a configuração de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio" (em pixels).
Área de ROI	A área da plataforma (ROI) definida pelo usuário durante a execução da macro sub definir plataforma (em pixels).
Número de moscas	O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio".

Tabela 1: Parâmetros medidos pela macro"Drosophila ilha ensaio". Os parâmetros descritos na tabela aparecerá no arquivo "Results" ao executar a macro"Drosophila ilha ensaio".

Nome da coluna	Descrição
Fatia	Número do quadro.
Contagem	O número de moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI).
X.Area	Área total das moscas detectado no quadro dentro dos limites da plataforma (ROI) em pixels.
Min. tamanho de voar	O mínimo voar a configuração de entrada de tamanho definida pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio" (em pixels).
Área de ROI	A área da plataforma (ROI, em pixels) definida pelo usuário quando executar a macro sub "definir a plataforma".
Número de moscas	O número de moscas usado por experimento definido pelo usuário na interface gráfica da macro"Drosophila ilha ensaio".
X.Count	% voa presentes na plataforma no respectivo fatia/quadro relativo para o maior número de moscas detectado na plataforma durante o experimento.
Commit	Ponto do tempo 1 representa o primeiro quadro a ser analisado e corresponde ao quadro onde as moscas aparecem pela primeira vez na plataforma. Há um total de 100 frames por replicar analisados (correspondente a 10 s, quando usando as configurações descritas.
Experimento	Número de repetições por condição.
Condição	Indica o nome da condição experimental (de acordo com o nome definido pelo usuário da pasta que contém os dados).

Tabela 2: Descrição das variáveis obtidas após o processamento dos dados com o roteiro de "Ilha do ensaio análise" Os parâmetros descritos nesta tabela aparecem no arquivo "data_all_conditions.csv" após o processamento dos dados com o roteiro de "Análise do ensaio de ilha".

Discussão

Este protocolo descreve a macro"Drosophila ilha ensaio" que avalia quantitativamente o comportamento motor de Drosophila durante o ensaio da ilha. A macro conta com precisão as moscas na plataforma ao longo do tempo, tornando o ensaio da ilha altamente sensível e adequado para avaliação quantitativa do elevado-throughput de defeitos do aparelho locomotoras. A metodologia permite a comparação de qualquer condição, com moscas cultivadas sob diferentes condições genéticas e/ou ambientais, incluindo a exposição da droga. Esta leitura é, portanto, particularmente útil como ferramenta de descoberta ao realizar grandes telas genéticas ou farmacêuticas, quando estudar modelos da drosófila de distúrbios do movimento e outras doenças neurológicas, ou aquando da análise de locomoção ou voo comportamento.

O protocolo de ensaio ilha apresentado neste manuscrito fornece vantagens sobre os métodos existentes/alternativa. Por exemplo, a locomoção de controle de vídeo é muito mais demorado e menos apropriado para o teste de tamanhos de amostra grande. O ensaio da ilha é uma ferramenta de seleção da elevado-produção e, neste sentido, é comparável com o ensaio de geotaxis negativo interativo rápida (anel)¹⁶. A diferença entre os dois é que os ensaios da ilha permite a detecção de uma gama mais ampla de problemas de locomoção; a incapacidade de moscas para deixar a plataforma pode ser causada por defeitos em voo, saltando, ou andando de comportamento causada pela asa (músculo/neuronal) e/ou perna (músculo/neuronal) defeitos. Por outro lado, o ensaio do anel avalia defeitos de comportamento escalada/caminhada causadas por defeitos de perna (músculo/neuronal). No caso de usuários estão interessados em múltiplas leituras comportamentais, o ensaio da ilha também facilmente pode ser combinado com outros ensaios, tais como o ensaio do anel. Além disso, laser necessário para optogenetics pode ser facilmente instalado na caixa de ensaio da ilha, e a instalação é tão simples que facilmente podem ser movido para uma sala onde a temperatura e a luz podem ser controladas.

Para garantir o sucesso e a reprodutibilidade do ensaio ilha descrita aqui, várias recomendações devem ser seguidas. Alíquota e transferência as moscas para o teste experimental frascos pelo menos um dia antes do experimento para evitar os efeitos da anestesia de CO₂ ou frio. Não sobrecarregar os frascos experimentais (usar moscas de 10-15 por frasco; é melhor colocar sempre o mesmo número de moscas por frasco). Manter as moscas em alimentos frescos em todos os momentos. Se não ainda familiarizado com a realização do ensaio, prática jogando voa na plataforma para maximizar o rendimento. Também praticar retraindo rapidamente a mão logo depois, como ela interfere com a análise de dados (análise de imagem e mosca contando o início somente depois que a mão está fora do quadro). Manter as condições ambientais e experimentais idênticas em experiências que precisam ser comparados (por exemplo, controles versus mutantes ou um genótipo testaram em diferentes idades). Sempre realizar os experimentos ao mesmo tempo do dia e manter os frascos sob condições de umidade e temperatura controlada. Para poder estatístico, o teste de pelo menos três repetições técnicas por replicar biológica.

Para assegurar a execução bem sucedida da macro descrita aqui, configurações de webcam e a imagem devem ser ajustadas para atingir o máximo contraste: voa aparecendo como objetos pretos em uma plataforma de branco. Quando o número de moscas corretamente não é contado pela macro, ajuste as configurações de contraste, verifique se o ROI está selecionado corretamente e certifique-se de que o tamanho das moscas na plataforma é acima do mínimo especificado voar tamanho configuração (consulte a etapa 8.3 do presente protocolo). As configurações só precisam ser definido uma vez. São aplicáveis a todas as experiências, contanto que a distância entre a plataforma e a webcam não é alterada. O Circularity_min e configurações máximas definem a circularidade das partículas (partículas = contadas moscas) que irá ser tidos em conta para a análise (voa = objetos contados). 1 representa um círculo perfeito, e 0 representa uma linha¹⁷. Uma vez que as moscas sempre apresentam um certo grau de circularidade (uma mosca não pode aparecer como uma linha reta), a definição de "Circularity_max" é definida de 1 e a definição de "Circularity_min" é definida de 0,4. É improvável que o usuário precisa ajustar essas configurações.

A macro ocasionalmente faz contagem de erros quando uma mosca está localizada perto da fronteira da plataforma. Isso pode ocorrer se as moscas não voam mas andar dentro e fora o ROI de definido pelo usuário. Na maioria dos casos, forem o ROI (montagem tanto quanto possível para a plataforma) pode facilmente resolver esse problema. No entanto, o roteiro de "Ilha do ensaio análise" é capaz de detectar e contagens de dados corretos imprópria causaram por moscas andar dentro e fora do ROI relativamente bem. Embora a resolução da webcam apresentada aqui é alta o suficiente para discriminar moscas nas proximidades razoavelmente bem, nós implementamos algoritmos adicionais no processo de processamento de imagem da macro"Drosophila ilha ensaio", tais como o bacias hidrográficas e corroer a função¹⁷. Estas facilitam a adequada delimitação das moscas que ficam nas proximidades da plataforma. Além disso, a macro é incapaz de distinguir entre moscas que pulou da plataforma ou voaram longe. No entanto, geralmente observa-se que cepas de mosca jovens saudáveis voam imediatamente quando caiu da plataforma, Considerando que moscas mais velhas e moscas com défices locomotoras permanecem por mais tempo na plataforma e serão eventualmente saltar ou cair fora da plataforma. Apesar dessas limitações, o ensaio e análise fornecem uma medida muito precisa de comportamento locomotor.

Para garantir a execução bem-sucedida do script "Ilha ensaio análise", o usuário tem que certificar-se de inserir os caminhos corretos para os arquivos de entrada e saídos nas linhas roteiro indicados no protocolo e fornecer os dados no formato de pasta correta (conforme indicado na Figura 2). Se o usuário encontra os critérios usados para filtrar dados experimentais confiáveis demasiado rigorosos (linha 68: o primeiro valor na coluna "Contar" é menor ou igual a 5; linha 71: o primeiro valor na coluna "Contagem" é maior do que o número total de moscas lançada sobre o Epics RM + 3), desligar essas configurações de filtro adicionando um # na frente o texto em linhas 68 e 71 no script "Ilha ensaio análise". Neste caso, todos os conjuntos de dados serão incluídos na análise. Alternativamente, as configurações de filtro podem ser alteradas, ajustando os valores nas linhas 68 e 71 de acordo com as necessidades do usuário. Possíveis artefatos em valores de contagem no "Results" gerado pela macro"Drosophila ilha ensaio" também podem ser ajustados manualmente, e o script pode ser executado novamente os dados ajustados. Quando o usuário está interessado no processamento de mais de 10 fps, ou mais de 10 s de dados, o número de quadros processados pelo script "Ilha ensaio análise" deveser ajustada. A análise estatística também pode ser substituída por alternativas definidas pelo usuário.

Uma pasta chamada "Exemplos ilha do ensaio," que contém exemplos com imagem séries temporais obtidas usando o ensaio da ilha, pode ser encontrada no seguinte site: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Baixar a pasta "Exemplos ilha ensaio" e siga os passos descritos no presente protocolo rapidamente tornar-se familiarizado com a estrutura de armazenamento de arquivos, o processamento das imagens com a macro "Ensaio de Drosophila ilha" e a análise de ensaio"ilha" script.

O ensaio da ilha, em combinação com a macro desenvolvida e roteiro de análise, pode ser usado para avaliar e quantificar o comportamento aberrante de movimento de um modelo de drosófila de Ataxia-Telangiectasia. Desde que o ensaio pode ser aplicado eficientemente para várias idades, é bem adequado para analisar a natureza potencialmente progressiva dos fenótipos.

Em resumo, o ensaio da ilha, em combinação com a macro"Drosophila ilha ensaio" e o roteiro de "Análise do ensaio de ilha", é um ensaio altamente eficiente, confiável e econômico objetiva analisar e quantificar locomotoras defeitos de Drosófila modelos de distúrbios de movimento de uma forma de alta produtividade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 x 95 mm Drosophila vials	Flystuff	32-116SB	-
Logitech C525 HD Webcam	Logitech	-	Any webcam with USB connection is suitable.
Stand to hold webcam	-	-	-
Lamp	-	-	12 V LED lights are appropriate
Pounding pad	-	-	Any mouse pad works
Island Assay box	-	-	Dimensions 40x35x2.5 cm. Hole 20x30 cm. Transparent.
Island Assay bath	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Non white.
Island/platform	-	-	Dimensions 42x38x25 cm. Uniform white.
Soap	-	-	Standard dishwashing detergent is suitable.
Computer	-	-	Scripts run both on Windows and Mac
Image-recording software: HandiAvi®	AZcendant®	-	HandyAvi is only compatible with Windows and has been described throughout the manuscript. It can be downloaded from: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (version 5.0)
Image-recording software: WebcamCapture	-	-	Fiji/ImageJ plugin that can be used on Mac alternative to HandyAvi for image-recordings and can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ When using this method, the user has to use the same folder setup and image-recording settings indicated in this manuscript, with the exception that for each experimental replicate, the captured image stack should be exported as Stack.tiff to the corresponding experimental replicate folder. Upon running the "Drosophila Island Assay" macro on this data, no text should be present in the "First frame identifier" setting.
Fiji	-	-	Version 1.4 or higher, can be downloaded from: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
R studio	-	-	Can be downloaded from: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
R	-	-	Version 3.3.2, can be downloaded from: https://cran.rstudio.com