Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Resumo

As experiências tradicionais de eletroforese em gel de laje (SGE) requerem um aparelho complicado e alto consumo químico. Este trabalho apresenta um protocolo que descreve um método de baixo custo para separar fragmentos de DNA dentro de um prazo curto.

Resumo

A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais comum para a separação de fragmentos de DNA; Portanto, é amplamente aplicado ao campo da biologia e outros. No entanto, o protocolo SGE tradicional é bastante tedioso, e o experimento leva muito tempo. Além disso, o consumo químico em experimentos SGE é muito alto. Este trabalho propõe um método simples para a separação de fragmentos de DNA com base em um chip SGE. O chip é feito por uma máquina de gravura. São utilizadas duas folhas de plástico para os comprimentos de onda de excitação e emissão do sinal óptico. O sinal de fluorescência das bandas de DNA é coletado por smartphone. Para validar este método, as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb foram separadas. Os resultados demonstram que uma escala de DNA menor que 5.000 pb pode ser resolvida dentro de 12 min e com alta resolução ao usar este método, indicando que é um substituto ideal para o método SGE tradicional.

Introdução

A eletroforese em gel de laje (SGE) é o método mais eficaz para a separação dos fragmentos de DNA ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} e, portanto, é considerada uma ferramenta versátil nas análises bioquímicas e biológicas ^{6 , 7 , 8} . No entanto, muitas experiências indicam que o SGE é restrito pelos seguintes quatro problemas: (1) as separações demoram muitas horas e até dias; (2) o consumo químico é muito alto; (3) requer um aparelho complicado ( por exemplo, célula de eletroforese 2D, fonte de energia de eletroforese e sistema de imagem em gel); (4) o sistema de imagem em gel só pode observar os fragmentos de DNA separados quando a experiência terminar. Além disso, o brometo de etídio (EtBr), que é comumente usado no SGE ^{9 ,}Ass = "xref"> 10, é mutagênico e cancerígeno ^{11 , 12} . Assim, sempre devem ser usadas luvas ao entregar géis contendo EtBr.

A eletroforese capilar (CE) tem inúmeras vantagens ^{13 , 14 , 15 , 16 , 17} em comparação com SGE, como operação automática, tempo de separação curto e menor consumo. No entanto, o instrumento CE é bastante caro. Portanto, para superar essas limitações, um sistema foi desenvolvido ( Figura 1 ) para a separação do DNA. Tal sistema não só pode reduzir muito o consumo de produtos químicos e economizar no tempo de experiência de SGE (<8 min), mas também pode realizar rastreamento em tempo real do processo de separação de DNA no gel de agarose pelo smartphone. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, os estudantes shouPoderia projetar e fabricar o chip SGE, preparar o gel de agarose no chip, configurar um sistema SGE simples com um smartphone e registrar o processo de migração do DNA no gel de agarose.

Protocolo

1. Projeto básico do chip SGE

1. Use qualquer plástico transparente, como polimetilmetacrilato (PMMA) ou policarbonato.
   Nota: O chip SGE está demonstrado na Figura 1B . O chip SGE consiste em furos cilíndricos para o tampão TBE, canais para separação de DNA e duas pistas incorporadas ao longo dos orifícios para o eletrodo.
2. Fabricação de matrizes de canais SGE no bloco PMMA usando uma máquina de gravura a laser.
   Nota: Os parâmetros geométricos do chip dependem do tamanho do DNA a ser separado. Por exemplo, os parâmetros de canal ótimos para o chip SGE são de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largura x profundidade x comprimento) se o fragmento de DNA for menor que 1.000 pb.
3. Com base no design SGE, fabrica pentes para criar os poços no chip para carregar a amostra de DNA.

2. Preparação do Gel de Agarose

1. Prepare 0,5 × TBE misturando 10 × TBE (1 × TBE =Tris 89 mM, ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM; PH 8,4) e água destilada numa proporção 1:19.
2. Preparar 1,0% de gel de agarose para a separação de escadas de DNA de 100 pb.
   Nota: A concentração de agarose em tampão TBE 0,5x depende dos tamanhos dos fragmentos de DNA a serem separados.
3. Colocar 0,1 g de agarose num balão e adicionar 10 mL de tampão TBE 0,5x.
   Nota: O volume da solução preparada deve ser inferior a 1/3 da capacidade do balão.
4. Selar o balão com película conservante e depois aquecer a mistura de agarose / tampão em um microondas (meio, 1,0 min). Antes de colocar o balão no microondas, faça alguns orifícios no filme de conservação em caso de explosão.
5. Despeje 2,7 mL de solução de agarose derretida em 4 canais do chip SGE. Coloque o pente na solução de agarose para criar os poços.
   Nota: A solução de agarose derretida arrefecerá para o estado de gel à temperatura ambiente 3 minutos depois.
6. Remova o pente do gE adicionar 0,9 mL de tampão TBE 0,5x para cobrir o gel.

3. Correndo a eletroforese no chip SGE

1. Ligue a fonte de luz LED e coloque um filtro de passagem de banda de 425 a 505 nm acima da fonte de luz.
2. Misture 14,4 μL de uma escala de DNA de 100 pb e 1,6 μL de SYBR Green usando um vortexer.
3. Carregar 4 μL de mistura em cada poço do gel de agarose no chip SGE ( Figura 2 ).
4. Coloque o eletrodo nas duas faixas do chip SGE.
5. Coloque um filtro de passagem de banda de 550 a 700 nm acima do chip SGE.
6. Ligue a fonte de alimentação. Ajuste a tensão elétrica para 180 V (20 V / cm). Ligue o smartphone para gravar o processo de separação de fragmentos de DNA ( Figura 3 ).
7. Quando a eletroforese terminar 10 minutos depois, desligue a fonte de energia e a luz LED.
8. Limpe o chip SGE.

Resultados

A Figura 4 , Figura 5 , e a Figura 6 representam um resultado típico após a eletroforese em gel de 50, 100 e 1.000 pb de escadas de DNA. Após o experimento, os fragmentos de DNA estavam bem separados. Além disso, as mesmas amostras foram separadas nos 4 canais do chip SGE, mostrando que fragmentos de DNA do mesmo tamanho movem a mesma distância em cada experimento.

O desempenho de separação...

Discussão

A eletroforese em gel de agarose é amplamente empregada para a separação de DNA, ARN e proteína. Este trabalho propõe um novo método para substituir o protocolo tradicional de eletroforese em gel. Os resultados demonstram que as escadas de DNA de 50, 100 e 1000 pb podem ser separadas bem em um dispositivo tão pequeno montado. A grande vantagem deste método é que não só pode separar os ácidos nucleicos com pouco consumo químico, mas também pode registrar o processo de separação. Embora os fragmentos de DN...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10×TBE	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.	T1051
50 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3421A
100 bp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3422A
1 kbp DNA ladder	Takara Bio Inc.	3426A
SYBR GREEN	Takara Bio Inc.	5760A
Agarose	Sigma-Aldrich Corporate	V900510