Avaliando a insuficiência da memória espacial em um modelo de mouse de lesão cerebral traumática usando um labirinto de roda de água radial

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para um teste de cognição específico do mouse que não requer natação. Este teste pode ser usado para distinguir com sucesso os camundongos de traumatismos cerebrais traumáticos induzidos pelo impacto cortical controlados dos controles simulados.

Resumo

Apesar do recente aumento no uso de modelos de mouse na pesquisa científica, os pesquisadores continuam a usar tarefas cognitivas que foram originalmente projetadas e validadas para o uso de ratos. O teste de labirinto de Raios Radiais (RWT) de memória espacial (projetado especificamente para camundongos e que não requerem natação) foi mostrado anteriormente para distinguir com sucesso os camundongos TBI induzidos pelo impacto cortical controlados e controles simulados. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para esta tarefa. O labirinto RWT capitaliza a tendência natural de camundongos para evitar áreas abertas a favor de abraçar os lados de um aparelho (thigmotaxis). As paredes do labirinto são alinhadas com nove furos de escape colocados acima do chão do aparelho, e os ratos são treinados para usar pistas visuais para localizar o furo de escape que sai do labirinto. O labirinto é preenchido com uma polegada de água fria, suficiente para motivar a fuga, mas não suficientemente profundo para exigir que o mouse passe a nadar. O período de aquisição leva apenas quatro treinamentosDias, com um teste de retenção de memória no dia cinco e um teste de memória de longo prazo no dia 12. Os resultados relatados aqui sugerem que o labirinto RWT é uma alternativa viável para os testes cognitivos baseados na natação, validados por ratos, na avaliação do espaço Déficits de memória em modelos de mouse de TBI.

Introdução

As deficiências de memória estão entre os sintomas mais comuns relatados por pacientes após lesão cerebral traumática (TBI) ^{1 , 2} . A identificação e avaliação precisas de déficits de memória análogos em modelos animais de TBI, portanto, são essenciais para a nossa compreensão desta condição e sua gestão. Aqui, apresentamos um protocolo para testar a memória espacial em um modelo de mouse de TBI usando um labirinto de roda de água radial (RWT). Este aparelho foi previamente demonstrado para avaliar os déficits cognitivos em modelos de ratos de TBI ³ induzido por impacto cortical controlado (CCI) e representa uma alternativa potencial para testes de cognição com base em natação e validados por ratos.

A crescente diversidade e disponibilidade de modelos de ratos transgênicos levou a um aumento recente no uso de camundongos sobre ratos na pesquisa científica ⁴ . Apesar desta mudança, os pesquisadores continuam a depender de um comportamentoTarefas cognitivas que foram originalmente projetadas e validadas para o uso de ratos. Os ensaios mais comuns actualmente utilizadas para avaliar a cognição em ratinhos, o labirinto de água de Morris (MWM) e do labirinto circular Barnes, foram especificamente concebidos para capitalizar comportamentos instintivo encontrados em ratos ^{5, 6.} Considerando as diferenças genéticas, neuroeológicas e cognitivas que existem entre essas duas espécies ⁴ , não é surpreendente que os ratos continuem de forma consistente nessas tarefas ^{7 , 8} .

As diferenças dependentes de espécies na habilidade de teste são particularmente importantes em testes cognitivos baseados na natação, como o MWM. Enquanto os ratos e os ratos são nadadores proficientes, os pesquisadores identificaram várias cepas de mouse que desempenham notavelmente mal nas tarefas cognitivas baseadas na natação ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Mesmo em animais de tipo selvagem, os ratos geralmente superam os ratos ^{7 , 8} . Embora isso possa ser interpretado como uma diferença específica da espécie na memória espacial, testes de seguimento análogos usando um labirinto seco não revelaram diferenças dependentes de espécies no desempenho cognitivo ⁸ . Uma série de fatores não relacionados à cognição podem explicar esse achado, incluindo diferenças dependentes de espécies na capacidade de natação ou na estratégia de busca. Na verdade, a análise fatorial de estratégias de pesquisa específicas do mouse no MWM mostra que fatores não cognitivos (em particular, thigomotaxis e passividade [ isto é , flutuante]) podem desempenhar um papel mais significativo no desempenho de MWM do que a aprendizagem espacial ¹⁴ .

Aqui, demonstramos o uso de um teste cognitivo projetado para capitalizar oComportamento incisivo dos camundongos, e que não requer natação, para medir o comprometimento da memória espacial em um modelo de mouse do TBI induzido por CCI. Enquanto o labirinto RWT (Figura 1 A-B) foi concebida como um novo híbrido do labirinto circular MWM e Barnes, que foi especificamente desenhado para tirar vantagem de comportamento instintivo thigmotactic para ratos ^{15, 16.} O aparelho consiste em uma cuba de aço galvanizado de 32 polegadas de diâmetro, na qual nove orifícios de saída uniformemente espaçados foram aborrecidos. Os orifícios são centrados a 2-1 / 4 polegadas acima do chão da banheira e são dimensionados para caber adaptadores disponíveis de 1/2 polegadas ABS DWV SPG x SJ. Oito das saídas são limitadas do lado de fora e cegadas até uma profundidade de 1 polegada com rolhas de borracha. O nono é conectado por um cotovelo de acrilonitrilo e nitrogênio (ABS) de 90 ° a uma caixa de plástico opaco a partir da qual o mouse pode ser facilmente removido após o teste. Ao longo de umBreve período de aquisição, o mouse é treinado para usar as pistas visuais únicas que alinham o labirinto para localizar esta caixa de fuga. Durante o teste, o labirinto é preenchido com uma polegada de água fria (12-14 ° C), suficientemente aversivo para promover a fuga, mas não suficientemente profundo para que o mouse seja obrigado a nadar.

O labirinto RWT representa uma alternativa de baixo custo e de baixa manutenção para o MWM, e tem sido utilizado com sucesso em ratos envelhecidos e transgênicos ^{15 , 17 , 18 , 19} e modelos de ratos induzidos por CCI de TBI ³ . O protocolo descrito aqui representa um método simples e eficaz para medir o comprometimento da memória espacial que não requer treinamento pré-lesão e pode ser facilmente modificado para atender às necessidades particulares de um laboratório de pesquisa.

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Protocolo

Todos os procedimentos e manipulação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes de cuidados com animais emitidas pelos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Comitê de Uso e Cuidados com Animais da Universidade de Washington.

1. Cirurgia

1. Anestesiar o mouse a 5% de isoflurano em uma caixa de indução até inconsciente. Confirme a anestesia por uma redução na taxa de respiração e na ausência de um reflexo de retirada após a pitada do dedo do pé.
2. Manter a anestesia através do cone do nariz em 2-2,5% ao longo da cirurgia. Monitore a taxa de respiração durante a cirurgia para garantir que o mouse permaneça inconsciente.
3. Coloque o propenso ao mouse sobre uma almofada de aquecimento e posicione o mouse no dispositivo estereotáxico usando barras de ouvido, garantindo que a cabeça seja segura e plana.
4. Remova o cabelo do couro cabeludo usando creme de depilação. Enxaguar o couro cabeludo com solução salina.
5. Limpe o local cirúrgico com iodo alternado e 70% de lavagem com etanol.
6. AdministradorInjeção subcutânea de Lidocaína e Bupivacaína (1 mg / kg) no couro cabeludo.
7. Com tesoura cirúrgica, faça uma incisão longitudinal longitudinal e retraia a pele para revelar o crânio.
8. Usando uma serra de trebina de 5 mm, prepara uma craniotomia sobre o córtex frontoparietal esquerdo com ponto central a 2,5 mm atrás da bregma e 2,5 mm à esquerda da linha média. Remova cuidadosamente o círculo de osso para expor o cérebro.
9. Coloque o dispositivo do pêndulo em uma velocidade de 6 m / s e tempo de espera de 200 ms.
10. Posicione o dispositivo do pêndulo até que a ponta de impacto convexa de 3 mm toque levemente a superfície do cérebro a 2,5 mm atrás da bregma e 2,55 mm à esquerda da linha média. Retirar a ponta de impacto e diminuir em 1 mm (profundidade de impacto). Quando estiver pronto, dispare o dispositivo, gerando o impacto desejado.
11. Cubra a craniotomia com um disco de polipropileno estéril cimentado a derma com adesivo de tecido e sutura a incisão fechada.
12. Remova o mouse da anestesia e dê injeção de IP de BuprEnorfina (0,5 mg / kg).
13. Permita que o mouse se recupere em uma gaiola limpa, aquecida por uma almofada de aquecimento. O mouse deve ser monitorado quanto a sinais de dor ou dificuldade nas próximas 24 h.
    NOTA: Os controles Sham devem receber tratamento idêntico ao descrito acima, com as etapas 1.8-1.9 omitidas.

2. Construção de labirinto de roda de água radial

1. Orifícios de saída de orifício 9, grandes o suficiente para acomodar adaptadores de travagem DWV SPG x SJ de 1-1 / 2 polegadas, em intervalos iguais ao redor da circunferência de uma banheira de aço galvanizado de 32 polegadas de diâmetro. Centralize esses orifícios de saída aproximadamente 2-1 / 4 polegadas acima do chão da banheira.
2. Coloque um adaptador de tração ABS DWV SPG x SJ de 1-1 / 2 polegadas em cada um dos orifícios de saída e segure com as porcas de anel incluídas.
3. Com rolhas de borracha, tampa oito das nove saídas do exterior do aparelho. A saída final, não aberta, servirá como a rota de fuga. Não importa qual saída seja designada como a rota de fuga.
4. Anexe um ABS de 90 °Cotovelo para o exterior da saída restante. A curva de 90 ° serve para evitar que os sujeitos de teste determinem visualmente a rota de fuga correta do interior do labirinto.
5. Construa a caixa de escape de qualquer caixa opaca capaz de ser higienizada e com aproximadamente 30 cm x 15 cm x 15 cm de tamanho. Corte um buraco no lado da caixa, diretamente acima do chão, grande o suficiente para acomodar um cotovelo ABS de 90 °.
6. Anexe a caixa de escape à extremidade do cotovelo 90 ° ABS.
7. Levante ligeiramente a caixa de escape (menos de uma polegada) acima da superfície do chão. Isso permite um amplo espaço para uma almofada de aquecimento elétrico, ou outra fonte de aquecimento, para ser colocado sob a caixa de fuga.
8. Imprima e elimine pelo menos 5 sugestões visuais únicas. Use imagens simples e de alto contraste que possam ser facilmente discernidas dentro do aparelho. São recomendadas formas de clipart em preto e branco (triângulo, quadrado, círculo).
9. Usando ímãs, aderir as pistas visuais às paredes internas doaparelho. As indicações devem ser aproximadamente iguais à distância, em torno da circunferência do aparelho.

3. Protocolo de labirinto de roda de água radial

NOTA: O teste de labirinto de água deve começar apenas após o local cirúrgico ter cicatrizado (aproximadamente uma semana após a cirurgia).

1. Preparando-se para testes.
   1. Permita que os ratos aclimatem a sala de testes durante pelo menos 30 min antes de iniciar o teste.
   2. Desinfecte o aparelho usando um spray de etanol a 70%.
   3. Encha o aparelho com aproximadamente 1 polegada de água fria (12-14 ° C).
   4. Coloque uma almofada de aquecimento elétrico, ou outra fonte de aquecimento, diretamente embaixo da caixa de fuga. Mantenha a caixa de escape escura e quente ao longo da duração do teste.
   5. Posicione uma fonte de luz brilhante sobre o aparelho.
      NOTA: se estiver usando uma lâmpada que possa ser visível para pesquisar animais do próprio aparelho, tenha cuidado para garantir que a lâmpada seja colocada no mesmo poTodos os dias. A lâmpada em si pode representar outra sugestão visual para que os ratos usem para localizar a caixa de fuga, e movê-la drasticamente do dia a dia pode complicar os resultados.
2. Protocolo de Teste
   1. Retire o mouse da gaiola suavemente pela cauda e coloque no centro do aparelho.
   2. Assim que o animal estiver no aparelho, comece o tempo.
   3. Uma vez que o animal encontrou a saída correta e localizou / entrou na caixa de fuga, pare o tempo e grave o número de segundos necessários para encontrar o caminho correto.
   4. Se o animal tentar subir de um buraco de terminação e não voltar a entrar espontaneamente no labirinto após 10 s, guie o animal de volta ao centro do labirinto à mão.
   5. Se o animal não conseguir encontrar o caminho correto para a caixa de escape dentro de 3 min (180 s), marque o teste como uma falha e registre como 180 s. Guie cuidadosamente o animal em direção ao caminho correto à mão.
   6. Permitir oMouse para permanecer na caixa de fuga por 1 minuto, resto inter-trial.
   7. Uma vez que o restante de 1 min passou, remova o animal da caixa de fuga e regresse à sua gaiola de casa.
   8. Desinfecte completamente a caixa de fuga e saia com um spray de etanol a 70% para evitar que o mouse use as pistas olfativas para localizar a rota de fuga correta. Este passo não deve demorar mais do que alguns segundos.
   9. Retorne o mouse para o labirinto para o próximo teste.
   10. Repita as Etapas 3.2.1-3.2.9 até que o mouse complete um total de três ensaios e tenha localizado ou sido conduzido à caixa de fuga três vezes.
   11. Após o último final de 1 min, volte o mouse para a sua gaiola de casa.
   12. Drenar e substituir a água no aparelho entre animais para garantir uma temperatura constante durante o teste.
   13. Repita as etapas 3.2.1-3.2.12 para cada mouse a ser testado.
   14. No dia seguinte, repita as etapas de preparação 3.2.1-3.2.5. Tenha especial cuidado em garantir que as pistas visuais permaneçamEm posições consistentes entre dias de teste.
   15. Teste os animais usando o protocolo de teste diário acima para três ensaios por dia durante quatro dias (período de treinamento), com um teste final de três testes para retenção de memória no quinto dia. Um sexto teste de três testes (retenção de memória de longo prazo) pode ser dado no dia doze.
   16. Não realize testes entre os dias de teste cinco e doze.
3. Análise
   1. Se um mouse falhar ao completar o labirinto em menos de 180 s durante um período de dois dias ( ou seja, um total de 6 testes consecutivos, todos obtidos a 180 s), considere o mouse insuficientemente motivado pelas condições de teste e remova da análise.
   2. Calcule a latência média para completar o labirinto para cada assunto, testando a data, com a média de seus três ensaios diários para esse dia.
   3. Obtenha diferenças grupais na retenção de memória utilizando t-testes padrão para comparar grupos no teste do quinto dia e data de teste de memória de longo prazo. Se mMais do que dois grupos estão sendo comparados, a ANOVA unidirecional seguida de uma análise pós-hoc apropriada (como o teste de Tukey) para acompanhar qualquer significância obtida deve ser empregada.
   4. Obtenha diferenças de grupo no período de aquisição (dias 1-4) através de análise de variância de medida repetida.

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Resultados

O labirinto RWT ( Figura 1 ) foi utilizado para investigar os déficits de memória espacial dependentes de lesões em camundongos atribuídos aleatoriamente para receber um TBI induzido por impacto cortical controlado ou uma cirurgia simulada. A lesão foi gerada usando um impacto cortical accionado por solenóide com uma ponta convexa de 3 mm e os seguintes parâmetros de lesão: velocidade de ataque de 6 m / s, 1 mm de profundidade de penetração e 200 m...

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Discussão

O protocolo de labirinto RWT apresentado aqui distingue com sucesso os camundongos TBI induzidos por CCI e os controles simulados, e representa uma alternativa viável, centrada no mouse, ao labirinto circular MWM e Barnes. Enquanto os resultados relatados aqui falam apenas do uso do labirinto RWT em um modelo de mouse TBI, este aparelho foi utilizado com sucesso em modelos idosos e transgênicos, onde o incumprimento induzido pelo estresse resultante de testes baseados em natação feitos usando o MWM impraticável

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 Gal. Hot Dipped Steel Round Tub	Home Depot	Internet #206638142	Needed: 1
1-1/2 in. ABS DWV SPG x SJ Trap Adapter	Home Depot	Internet #100344703, Store SKU #188956	Needed: 9
1-3/4 in. x 1-7/16 in. Black Rubber Stopper	Home Depot	Internet #100114974 Store SKU #755844	Needed: 8
1-1/2 in. ABS DWV 90 Degree Hub x Hub Elbow	Home Depot	Internet #100346663 Store SKU #188603	Needed: 1
HDX 10 Gal. Storage Tote	Home Depot	Internet #202523587 Store SKU #258804 Store SO SKU #258804	Needed: 1
Impact One Stereotaxic Impactor for CCI	Leica Biosystems	39463920	Needed: 1
Vernier Stereotaxic w/ Manual Fine Drive Stereotaxic Instrument for Small Animals	Leica Biosystems	39463001	Needed: 1