Imagem altamente multiplexada e de super resolução de células T usando madSTORM

Resumo

Demonstamos um método para imagem de múltiplas moléculas dentro de nanoestruturas heterogêneas com precisão de molécula única usando ligação sequencial e eluição de anticorpos marcados fluorescentemente.

Resumo

A imagem de estruturas celulares heterogêneas usando microscopia de localização de molécula única foi dificultada por precisão de localização inadequada e capacidade de multiplexação. Usando marcadores fiduciários de nano-diamante fluorescentes, descrevemos os procedimentos de correção e alinhamento da deriva necessários para obter alta precisão em microscopia de localização única de moléculas. Além disso, uma nova estratégia de multiplexação, madSTORM, é descrita em que moléculas múltiplas são direcionadas na mesma célula usando ligação seqüencial e eluição de anticorpos fluorescentes. MadSTORM é demonstrado em uma célula T ativada para visualizar as localizações de diferentes componentes dentro de uma estrutura de múltiplas proteínas ligada à membrana chamada de microcluster do receptor de células T. Além disso, a aplicação de madSTORM como uma ferramenta geral para a visualização de estruturas multi-proteínas é discutida.

Introdução

Uma variedade de técnicas de microscopia de super resolução foi desenvolvida para superar o limite de difracção do microscópio de luz (~ 200 nm). Entre estas, uma categoria de técnicas denominada microscopia de localização de moléculas únicas (SMLM), que inclui microscopia de localização foto-ativação (PALM) e microscopia estocástica de reconstrução óptica (STORM). As técnicas SMLM compartilham o uso de fluoróforos que podem ser alternados entre os estados fluorescentes (offs) e off (dark / photo-switched), permitindo a localização sequencial da fluorescência a partir de moléculas únicas ^{1 , 2 , 3} .

Devido à sua compatibilidade com corantes e microscópios comercialmente disponíveis, o STORM direto (dSTORM) tornou-se uma técnica SMLM amplamente adotada ⁴ . DSTORM pode normalmente atingir uma precisão de localização de ~ 10 nm, definida como a incerteza no cálculo do centro de uma difraçãoFunção de espalhamento de ponto limitado a iões (PSF). No entanto, apesar da alta precisão estimada usando os algoritmos de localização ^{5 , 6 , 7} , a determinação precisa da localização real de moléculas únicas foi prejudicada por uma série de problemas. Primeiro, o movimento mecânico do estágio do microscópio durante a aquisição da imagem aumenta a incerteza significativa na precisão da localização. À medida que as imagens SMLM são obtidas através de milhares de quadros de lapso de tempo, os movimentos de nano-escala do estágio do microscópio podem comprometer significativamente a precisão da imagem super-resolução final ⁸ . Para compensar o movimento do palco durante a aquisição da imagem, a derivação do estágio é geralmente estimada a partir de ajustes baseados em regressão de localizações binadas da própria imagem (correlação cruzada) ou localizações seqüenciais de marcadores fiduciais (correção fiducial) ^{1 , 9} . HowevEsses métodos requerem a otimização de vários parâmetros para cada pilha de imagens e não podem ser considerados movimentos de estágio em escalas de curta duração, como a vibração mecânica. As nanopartículas de ouro e as esferas fluorescentes multicoloridas foram usadas como marcadores fiduciários no SMLM, mas não são estáveis ​​em fotos e resultam em precisão significativamente menor após a correção da deriva do que os nano-diamantes fluorescentes de centro de vacância de nitrogênio (FNDs) utilizados Em madSTORM ¹⁰ .

Além do limite de difracção, o microscópio de luz é ainda restringido por limites espectrais. A visualização simultânea de múltiplos alvos requer sondas fluorescentes com perfis espectrais não sobrepostos, geralmente restringindo o microscópio de luz à base de fluorescência a 6 cores e SMLM a 2-3 cores ^{4 , 11 , 12} . Além disso, a aberração cromática não linear provoca desalinhamento de imagens multicoloridas, wQue exigem extensos procedimentos de alinhamento usando marcadores fiduciários multicoloridos ^{8 , 13} . Para superar esses limites, estudos anteriores criaram imagens de múltiplos alvos usando fotobloco repetitivo ou extinção química de fluoróforos ^{14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19} . Embora estes métodos possam superar os limites espectrais da microscopia, o branqueamento com fluorescência é conhecido por ser um processo tóxico ²⁰ , e o branqueamento prolongado ou a extinção pode causar efeitos colaterais indesejáveis, como perda de reticulação. Além disso, o acúmulo de sondas fluorescentes poderia levar ao bloqueio estérico de locais de ligação na amostra, evitando a multiplexação em grande escala e a segmentação robusta de epítopos. Para evitar tais interferências estéticas, uma recente sTudy conseguiu a multiplexação usando a troca estocástica de fragmentos de proteínas que difundem livremente ²¹ . Considerando que este método permite rotulagem densa de estruturas celulares, requer uma preparação bioquímica extensa para isolar fragmentos de péptidos, não pode localizar posições de moléculas únicas e não prontamente facilita a multiplexação em larga escala usando sondas comercialmente disponíveis. Apresentamos um protocolo de vídeo detalhado que descreve a ligação seqüencial e a eluição de anticorpos fluorescentes para imagens multiplexadas, tamanho limitado de anticorpos dSTORM (madSTORM) e uso de nano-diamantes fluorescentes para obter correção e alinhamento preciso da deriva.

Protocolo

Cuidado: consulte todas as folhas relevantes de dados de segurança de material (MSDS) antes de usar. Vários dos produtos químicos utilizados neste protocolo são tóxicos e cancerígenos. Use todas as práticas de segurança adequadas ao executar o protocolo, incluindo o uso de controles de engenharia (exaustor, porta-luvas) e equipamento de proteção pessoal (óculos de segurança, luvas, bata de laboratório, calças completas, sapatos fechados).

1. Imagem multiplexada de células T ativadas

1. Conjugar conjuntamente anticorpos com o corante Alexa-647 (A647) usando o kit de rotulação de anticorpos Alexa 647. Siga o protocolo de rotulagem fornecido pelo fabricante.
   NOTA: Recomenda-se a diálise da solução de anticorpos em 1x PBS antes deste passo para aumentar a eficiência da rotulação de anticorpos.
2. Anticorpos rotulados por rotação durante 5 min a 20,800 rcf e coletar o sobrenadante para remover anticorpos agregados.
3. Preparação de lâminas fluorescentes com revestimento em nano-diamante
   1. Cubra as câmaras de lamínula de 8 poços (ver lista de reagentes / materiais) com 250 μL de poli-L-lisina (PLL) a 0,01% durante 15 minutos, aspirar e secar a 65 ° C durante 30 min. (Não lavar antes de secar).
   2. Prepare uma diluição de FND de 100 nm em 1x PBS. Teste várias diluições para garantir que FNDs suficientes sejam visíveis em cada campo de visão no passo 1.2.7 (estamos usando uma diluição de FND de 1: 200 fornecida pelo fabricante).
   3. Vortex as FND diluídas por 1 min.
   4. Sonicate o sobrenadante FND por 30 s em uma configuração de alta potência.
   5. Incubar o sobrenadante de FND sonicado em uma câmara de lamínula de 8 poços revestida com PLL por 30 minutos à temperatura ambiente.
   6. Lavar 5x com 1x PBS e visualizar a câmara revestida com FND usando excitação a laser de 647 nm no microscópio TIRF. Idealmente, 4-10 FNDs individuais devem ser visíveis em um campo de visão dada a diluição adequada de FNDs no passo 1.2.2 (estamos usando um objetivo 100X com configuração de pixel de câmera 256 x 256 para produzir um campo de visão de 61 x 61 μm) Com emPelo menos um FND presente em cada quadrante do campo de imagem. Se os FNDs parecem estar agrupados ( ou seja, FNDs com sinal significativamente maior do que os FND circundantes e uma função de propagação do ponto maior que 200 nm), centrifugem FNDs a 6,800 rcf por 1 min e repitam o procedimento de revestimento usando o sobrenadante FND.
   7. Adicionar 250 μl de anticorpo anti-CD3 (10 μg / mL) em cada poço e incubar durante 1 hora a 37 ° C, ou durante a noite a 4 ° C.
   8. Remova a solução e adicione 1x PBS por 30 segundos. Repita este passo de lavagem 5 vezes (lavar 5x).
4. Ativação de células T Jurkat
   1. Girar 1 ml de células Jurkat T a 800 rcf durante 6 min e ressuspender em 300 μl de solução 1x HBS. As células T Jurkat devem, idealmente, estar em uma concentração de 0,5-1,0 x 10 ⁶ células / ml antes da centrifugação. A solução 1x HBS consiste em solução salina tampão HEPES com 1% de albumina de soro bovino como descrito anteriormente ²² .
   2. Adicionar 150 μLDe solução 1x HBS em cada poço e incuba a 37 ° C durante 15 min.
   3. Adicionar 50 μL de células Jurkat T ressuspendidas a cada poço e incubar durante 3 min a 37 ° C.
   4. Adicionar 300 μL de Paraformaldeído a 4% a cada poço e incubar durante 30 min a 37 ° C.
   5. Lave 3x com 1x PBS.
   6. Permeabilize as células adicionando 250 μL de solução de Triton-X a 0,1% durante 5 min à temperatura ambiente.
   7. Lave 3x com 1x PBS.
   8. Adicionar 250 μL 1% de solução de gelatina de peixe em 1x PBS a cada poço durante 30 min à temperatura ambiente.
   9. Lave 3x com 1x PBS.
5. Imaging ativou células Jurkat T usando madSTORM
   1. Adicionar 200 μL de anticorpo marcado a 0,1-0,5 μg / mL a células fixas durante 1 hora à temperatura ambiente.
   2. Lavar 5x com 1x PBS.
   3. Adicione 1 ml de tampão STORM e cubra a câmara com uma lamínula de vidro para limitar a exposição ao ar. O buffer STORM foi descrito anteriormente ¹⁰ . Recomendamos maKing novo buffer STORM para cada rodada de imagem e girando o buffer STORM a 20,800 rcf durante 2 min para remover precipitados.
   4. Usando baixa potência de laser de 647 nm no modo TIRF, localize uma célula corada com pelo menos 3 FNDs no campo de visão. Para ajudar a localizar FNDs, a excitação concomitante com laser de 568 nm pode ser usada para aumentar o brilho do sinal FND.
      NOTA: O desempenho da correção fiducial média descrita na seção 2.1 melhora com a inclusão de mais FNDs.
   5. Aumente o poder laser de 647 nm e adquira imagens. Normalmente, nós adquirimos 10.000 quadros com exposição de 200 ms, laser de 125 mW 647 nm, lente de objetivo TIRF 100X (1,49 NA), ganho EM 100X (5 MHz em 16 bits, ganho de conversão 1). Os detalhes de nossa configuração de imagem foram descritos anteriormente ¹⁰ .
   6. Lavar 5x com 1x TBS.
   7. Adicione 1 ml oO tampão de eluição (MgCl2 3,5 M, PIPES 20 mM, Tween-20 a 0,1%, pH 6,5) e incuba à temperatura ambiente durante 1 min.
   8. Repita a eluição 3 vezes. (As condições exactas de eluição e o número de enxaguamentos de eluição necessários para remover o sinal devem ser verificados para cada anticorpo utilizado).
   9. Lave 3x com 1x TBS e adicione 1 ml de 1x PBS.
   10. Photobleach com laser de 647 nm com alta potência (125 mW) com laser de 405 nm a 2-5 mW para foto-ativar corantes A647 em estado escuro. Aguarde até que todo o sinal restante de anticorpos não eluídos seja fotoblechado. Normalmente, isso leva 2-5 s de exposição a laser. A aquisição de imagens de amostra (~ 100 quadros) usando as configurações de TEMPORADA em 1.3.5 após eluição e foto-brilho é recomendável para confirmar a remoção do sinal.
       Normalmente, removemos 99,8% do sinal usando este método. Recomendamos testar a eficiência de eluição de cada anticorpo antes de usar em madSTORM como mostrado anteriormente ¹⁰ .
   11. Adicionar 250 μL de Paraformaldeído a 4% durante 15 min. Este prOs eventos revertem a reticulação de moléculas fixas na célula.
   12. Lave 3x com 1x PBS.
   13. Repita as etapas 1.3.1-1.3.12 para rotulagem seqüencial de múltiplos destinos. A Figura 1 mostra uma imagem composta de múltiplas moléculas em uma célula T Jurkat ativada adquirida usando madSTORM.

2. Correção de tração e alinhamento de pilhas de imagens multiplexadas

1. Correção de deriva de pilhas de imagem madSTORM
   1. Abra imagens usando o ImageJ. Recomendamos converter os arquivos de imagem em um formato TIFF antes de abrir no ImageJ. Use ROI do retângulo para selecionar um único FND. Jogue o lapso de tempo para se certificar de que o FND está visível em cada quadro da pilha de imagens. Use Run Analysis no plugin ThunderSTORM para localizar o FND. Para o método de correção fiducial calculado em 2.1.5, é importante que um FND único seja localizado em cada quadro de imagem ( ou seja, o número de picos identificados deve ser eQual o número de quadros).
   2. Se o FND não for identificado em cada quadro, selecione outro FND. Se vários picos estiverem localizados em um único quadro, remova o pico que se desvia mais dos picos anteriores.
   3. Repita 2.1.2 para cada FND na pilha de imagens. Tenha em mente que alguns FNDs não devem ser incluídos no processo de correção de deriva para que eles possam servir como um indicador independente para a precisão de correção de deriva como descrito no passo 2.1.7.
   4. Para uma correção de deriva mais rápida e menos precisa, use os algoritmos de correção cruzada ou de correção fiduciária incluídos no ThunderSTORM para corrigir as imagens do FND. Normalmente, usamos 100 lâminas, 5 ampliação e 0,1 fator de alisamento da trajetória para correlação cruzada e 10 distância máxima, relação de visibilidade do marcador de 0,1 min e fator de alisamento da trajetória 0,01 para correção fiducial. A correlação cruzada e a correção fiducial renderão um arquivo de correção que pode ser aplicado a outros FNDs para testar a precisão da correção de deriva.
   5. Para uma correção de deriva mais rigorosa e mais precisa, use o algoritmo de correção fiducial (AFC), conforme descrito anteriormente ¹⁰ . Este processo não requer otimização de parâmetros e produz maior precisão de localização do que o previsto pelos algoritmos de localização SMLM. No entanto, a correção de deriva média requer pelo menos 4 FNDs e para que os FNDs sejam localizados em cada quadro da pilha de imagens. A correção de deriva AFC funciona melhor com a inclusão de mais FNDs porque um grande número de FNDs localizadas diminuirá o efeito de distorção de um pico outlier em uma determinada moldura.
   6. Localize todas as funções de propagação de pontos dentro da pilha de imagens usando ThunderSTORM como descrito anteriormente ¹⁰ . Normalmente, usamos tamanho de pixel de 100 nm, fotoelétrons por contagem A / D de 4,28, contagem A / D de nível básico de 100, ganho EM de 100, PSF: localização Gaussiana integrada, raio de ajuste de 5 pixels, método de ajuste de máxima verossimilhança e 1,3 Sigma inicial de pixel.
   7. Aplique o fator de correção de deriva adquirido de FNDs para localizações de toda a pilha de imagens. Inspecione visualmente a imagem final para garantir correção adequada da deriva ( Figura 2 ). O fator de correção de deriva resultante deve ser testado independentemente em FNDs não incluídos no procedimento AFC para medir o nível de precisão de correção de deriva. A precisão de FNDs corrigidos por deriva e independente deve ser próxima do valor médio de precisão / incerteza calculado a partir do algoritmo de localização utilizado no passo 2.1.6.
   8. Repita as etapas 2.1.1-2.1.7 para as pilhas de imagem madSTORM de anticorpos marcados sequencialmente. Tenha em mente que localizar o mesmo conjunto de FNDs em cada pilha de imagem madSTORM é crítico para o seguinte procedimento de alinhamento.
2. Alinhamento de imagens madSTORM
   1. Calcule a posição centróide das FND corrigidas por derivação em cada imagem madSTORM. Para fazer isso, encontre o eixo médio x e y poPara cada FND localizado e média das posições médias x e y de todos os FNDs em cada imagem madSTORM. O algoritmo detalhado para este passo foi descrito anteriormente ¹⁰ . Alinhe imagens sequST madSTORM utilizando as posições centroid de marcadores fiduciais FND. Para realizar o alinhamento, calcule o deslocamento entre duas imagens de madSTORM localizadas, subtraindo a posição centroid de FNDs na segunda imagem madSTORM a partir do primeiro. Então, subtrai a quantidade de deslocamento de todas as localizações na segunda imagem do madSTORM.
   2. Recomendamos usar a primeira imagem madSTORM como uma imagem de referência e repetir este passo de alinhamento entre o primeiro eo terceiro, primeiro e quarto, etc. Teste a precisão do alinhamento medindo o deslocamento entre FNDs não incluídos no processo de alinhamento. Grandes deslocamentos podem indicar que diferentes conjuntos de FNDs foram usados ​​ao calcular as posições centroides de imagens sequST madSTORM.
   3. Em caso afirmativo, as etapas 2.2.1-2.2.2 shouPode ser repetido usando o mesmo conjunto de FNDs para realizar o alinhamento.
      NOTA: São fornecidos códigos personalizados para a correção de deriva AFC e procedimentos de alinhamento.

Resultados

O método de eluição e coloração seqüencial foi utilizado para produzir a imagem madSTORM multiplexada de microclusters e outras estruturas em uma célula T Jurkat ativada ( Figura 1 , verifique os alinhamentos das figuras). Cada imagem pseudo-colorida representa uma rodada de imagens madSTORM adquiridas nas etapas 1.1.1 a 1.3.13. Conforme descrito anteriormente ¹⁰ , o campo de visão deve ser monitorado quanto ao sinal residual ...

Discussão

Os procedimentos de multiplexagem seqüencial, correção de deriva e alinhamento em madSTORM permitem uma visualização precisa e altamente multiplexada de estruturas heterogêneas nas células. ¹⁰ Além disso, madSTORM evita as limitações de STORM multicolor, como a aberração cromática e as propriedades de troca / troca de fotos sub-ótimas de corantes vermelhos não distantes ^{9 , 12} . À medida que o passo de eluição reduz sign...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8 well coverslip chamber	Lab-tek	155409
0.1% Poly-L-Lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
NV-100 nm Fluorescent Nano-diamond	Adamas	Red FND
anti-CD3ε antibody	BD Biosciences	555329
Bovine serum albumin, Fraction V	KSE Scientific	98-100P
Triton-X	Sigma-Aldrich	T9284
10% Paraformaldehyde	EMS	15712	Carcinogen
Gelatin from fresh water fish skin	Sigma-Aldrich	G7041
Alexa 647 antibody labeling kit	Thermo Fisher	A20186
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	138924
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7154	Highly toxic, air sensitive
Cysteamine	Sigma-Aldrich	30070	Highly toxic
Cyclooctatetraene 98%	Sigma-Aldrich	138924	Highly toxic, air sensitive
10x PBS	KD Medical	RGF-3210
10x TBS	KD Medical	RGF-3385