Aplicação de correia de patch automatizada com guia de imagem para estudo de neurônios em fatias de cérebro

Resumo

Este protocolo descreve como conduzir experimentos de grampos-grampos guiados por imagem usando um sistema desenvolvido recentemente para equipamentos de eletrofisiologia padrão in vitro .

Resumo

O grampo de patch de células inteiras é o método padrão de ouro para medir as propriedades elétricas de células isoladas. No entanto, o grampo de patch in vitro continua a ser uma técnica desafiadora e de baixo débito devido à sua complexidade e alta dependência da operação e controle do usuário. Este manuscrito demonstra um sistema de grampo de correção automático guiado por imagem para experiências in vitro de grampos de grampos de células inteiras em fatias agudas do cérebro. Nosso sistema implementa um algoritmo baseado em visão computacional para detectar células marcadas com fluorescência e direcioná-las para o patch totalmente automático usando um micromanipulador e controle de pressão interna da pipeta. Todo o processo é altamente automatizado, com requisitos mínimos para a intervenção humana. As informações experimentais em tempo real, incluindo a resistência elétrica e a pressão interna da pipeta, são documentadas eletronicamente para análise futura e para otimização para diferentes tipos de células. Embora o nosso sistema seja descrito no contexto do brai agudoN grava gravações, também pode ser aplicada à braçadeira automatizada de patch guiada por imagem de neurônios dissociados, culturas de fatias organotípicas e outros tipos de células não neuronais.

Introdução

A técnica de grampos de parches foi desenvolvida pela primeira vez por Neher e Sakmann na década de 1970 para estudar os canais iônicos de membranas excitáveis ¹ . Desde então, o aperto de patch foi aplicado ao estudo de vários assuntos diferentes a nível celular, sináptico e de circuito - tanto in vitro como in vivo - em vários tipos de células diferentes, incluindo neurônios, cardiomiócitos, oócitos Xenopus e lipossomas artificiais ² . Este processo envolve a identificação correta e a segmentação de uma célula de interesse, o controle intrincado de micromanipulador para mover a pipeta de remendo próxima à célula, a aplicação de pressão positiva e negativa para a pipeta no momento adequado para estabelecer um patch gigaseal apertado, E uma invasão para estabelecer uma configuração de patch de células inteiras. O aperto do patch normalmente é conduzido manualmente e requer treinamento extensivo para dominar. Mesmo para um pesquisador com o patchClamp, a taxa de sucesso é relativamente baixa. Mais recentemente, várias tentativas foram feitas para automatizar experiências de patch-clamp. Duas estratégias principais evoluíram para realizar a automação: aumentando o equipamento padrão de grampo de patch para fornecer controle automático do processo de correção e o design de novos equipamentos e técnicas desde o início. A estratégia anterior é adaptável ao hardware existente e pode ser usada em uma variedade de aplicações de grampos patch, incluindo grampos de patch cegos in vivo ^{3 , 4 , 5} , grampo de patch in vitro de fatias de cérebro agudo, culturas de fatia organotípicas e neurônios dissociados cultivados ⁶ . Ele permite a interrogação de circuitos locais complexos usando múltiplos micromanipuladores simultaneamente ⁷ . O método de patch planar é um exemplo da nova estratégia de desenvolvimento, que pode atingir o alto desempenho simultâneo pBraçadeira de grampo de células em suspensão para fins de triagem de drogas ⁸ . No entanto, o método de patch plano não é aplicável a todos os tipos de células, particularmente neurônios com processos longos ou circuitos intactos contendo conexões extensas. Isso limita sua aplicação ao mapeamento dos intrincados circuitos do sistema nervoso, que é uma vantagem fundamental da tecnologia tradicional de grampos de patch.

Desenvolvemos um sistema que automatiza o processo de grampeamento manual in vitro , aumentando o hardware padrão de grampos de parafusos. Nosso sistema, Autopatcher IG, fornece calibração automática de pipeta, identificação de alvo de célula fluorescente, controle automático de movimento de pipeta, patches automáticos completos e registro de dados. O sistema pode adquirir automaticamente múltiplas imagens de fatias de cérebro em diferentes profundidades; Analise-os usando a visão por computador; E extrair informações, incluindo as coordenadas de células com marcação fluorescente. Esta informação pode então serUsado para segmentar e corrigir automaticamente células de interesse. O software está escrito em Python - uma linguagem de programação livre e de código aberto - usando várias bibliotecas de fonte aberta. Isso garante a sua acessibilidade a outros pesquisadores e melhora a reprodutibilidade e o rigor das experiências de eletrofisiologia. O sistema possui um design modular, de modo que o hardware adicional pode ser facilmente interagido com o sistema atual demonstrado aqui.

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Protocolo

1. Configuração do sistema

1. Construa a unidade de controle de pressão.
   1. Monte a unidade de controle de pressão de acordo com o mapa de circuitos ( Figura 1 ). Solde as peças necessárias na placa de circuito impresso (PCB) fabricada de acordo com os esquemas do circuito elétrico ( Figura 1b ). Use resistências padrão, LEDs, Transistores de Efeito de Campo-Óxido de Metal-Óxido (MOSFETs), capacitores e conectores (veja a Tabela de Materiais ). Solde as válvulas de solenóide na PCB. Conecte a bomba de ar e o sensor de pressão de ar à PCB com fio elétrico.
      NOTA: Deve demorar cerca de 2 h para construir a unidade de controle de pressão com todas as peças necessárias disponíveis.
2. Conecte a placa de aquisição de dados secundária (DAQ).
   1. Conecte as saídas de dados da placa de circuito impresso à placa DAQ, seguindo a Tabela 1 .
      NOTA: A placa DAQ iráEu estou correndo em "Modo single-ended". O mapa de portas pode ser encontrado no manual do usuário (veja a Tabela de Materiais ).
   2. Conecte "AIn Pr S" a um dos canais de entrada analógica (AI) e "R-Gr" a um dos motivos analógicos na placa DAQ secundária.
   3. Conecte a saída primária do amplificador a um dos canais AI e o chão ao solo analógico da placa DAQ secundária.
      NOTA: Um cabo BNC padrão pode ser usado para conectar a saída primária do amplificador.
   4. Tire a outra extremidade e conecte o sinal positivo ( ou seja, o núcleo de cobre) ao canal AI e ao solo ( ou seja, o fio fino ao redor do núcleo) ao solo analógico. Repita esta etapa para um segundo canal se for utilizado mais de um canal de patch.
      NOTA: A entrada analógica para a placa DAQ será configurada em etapas posteriores.
   5. Conecte a alimentação à saída de energia da placa DAQ secundária. Use uma energia separada de 12 V paraPara a bomba.
3. Conecte a tubulação.
   1. Conecte a bomba de ar e as duas válvulas de acordo com a Tabela 2 . Use um conector de 3 vias para conectar a tubagem macia da porta superior da válvula 2, do sensor de pressão e do suporte da pipeta na última etapa.
   2. Adicione outro conector de 3 vias à tubulação conectada ao suporte da pipeta se forem usadas duas pipetas. Alternar manualmente entre as válvulas e as pipetas em uso ao corrigir.
4. Instale o Autopatcher IG.
   NOTA: Requisito do sistema: O Autopatcher IG só foi testado em um PC com o Windows 7. Não foi validado para outros sistemas operacionais. O procedimento descrito aplica-se especificamente ao hardware listado na Tabela de Materiais.
   1. Faça o download do Autopatcher-IG do GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Instale o Python (veja a Tabela de Materiais para a versão e o endereço de download).
   3. Desinstale o PyQt4Biblioteca digitando "pip desinstalar PyQt4" em um terminal de linha de comando.
      NOTA: O sistema usa uma versão mais antiga da biblioteca PyQt4 para obter compatibilidade com as bibliotecas Qwt e Opencv.
   4. Instale bibliotecas Python a partir de arquivos de roda históricos (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Encontre os seguintes arquivos: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) e Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Para instalar os arquivos de roda, vá para o diretório onde os arquivos são salvos e digite "pip install *** wheelfilename ***. Whl". Substitua "*** wheelfilename ***" com o nome real do arquivo.
         NOTA: "cp27" no nome do arquivo da roda indica Python 2.7 e "win32" indicou Windows 32-bit. Se "win32" não funcionar, tente "win64".
   5. Para controlar a câmera CCD, baixe e instale o instaladorPara 64 bits (https://www.qimaging.com/support/software/). Em seguida, baixe o MicroManager para 64 bits (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) para controlar a câmera em Python.
   6. Para controlar os manipuladores e o estágio do microscópio, instale o software de controle fornecido pelo fabricante.
      NOTA: Ao fazer isso, o driver necessário para controlar os manipuladores também está instalado. O pacote de instalação geralmente é fornecido em um CD-ROM.
   7. Para controlar a placa DAQ secundária, instale a Biblioteca Universal a partir do CD-ROM, com a compra da placa DAQ.
5. Configure o hardware para Autopatcher IG.
   1. Conecte os controladores do palco do microscópio e do manipulador ao computador via portas USB.
   2. Atribua números de porta COM à unidade 0: etapa do microscópio, unidade 1: manipulador esquerdo e unidade 2: manipulador direito, nesta ordem, no arquivo de configuração "ports.csv" na pasta "configuração". euEave os outros parâmetros no arquivo ports.csv ( ou seja, "SCI" ​​e "1") inalterados.
      NOTA: As informações do número da porta COM podem ser encontradas executando o software de configuração do manipulador fornecido pelo fabricante. Vá para a guia "configurações", selecione "configurações" e a página "Movimento", e leia as etiquetas para cada guia na parte superior. Alternativamente, esta informação pode ser encontrada no PC Device Manager.
   3. Atribua números de canais de entrada analógicos na placa DAQ para um sensor de pressão e canal de parches 1 e 2 (correspondente às unidades 1 e 2). Digite o número do canal no arquivo "DAQchannels.csv" na pasta "configuração".
      NOTA: Recomenda-se abrir os arquivos .csv com o aplicativo Notepad em vez de uma planilha, pois pode alterar as informações ao salvar as alterações.
6. Execute o Autopatcher IG.
   1. Ligue o amplificador, controlador de microscópio e controlador de manipulador. EnsuRe que o software do amplificador está funcionando.
   2. Execute Autopatcher IG com Python a partir de um terminal de linha de comando da seguinte maneira: primeiro, altere o diretório (comando "cd" para os terminais mais comuns) onde Autopatcher IG está instalado, digite "python Autopatcher_IG.pyw" no terminal da linha de comando e pressione o botão "Tecla Enter.
      NOTA: Não execute o software de controle do manipulador antes de executar o Autopatcher IG porque ele ocupará o estágio do microscópio e manipulador, fazendo com que o Autopatcher IG não consiga encontrar o hardware. O software de controle do manipulador pode ser executado depois que o Autopatcher IG é totalmente iniciado se houver módulos adicionais a serem controlados ( por exemplo, o aquecedor em linha).
7. Calibre a pipeta primária.
   1. Puxe as pipetas de remendo como descrito anteriormente ⁹ . Preencha uma pipeta de vidro puxada com solução interna e carregue-a na fase principal.
      NOTA: as pipetas de vidro vazias têm diferentes contrastesO microscópio e pode levar a uma calibração imprecisa.
   2. Mova a ponta da pipeta para o campo visual do microscópio e coloque-a no foco. Se o teclado de discagem for usado para mover os manipuladores e / ou o estágio do microscópio, atualize as coordenadas pressionando "z" no teclado.
      NOTA: Esta ação não é necessária se o teclado (etapa do microscópio: A / D - eixo x, eixo W / S-y, eixo R / F-z; manipuladores: H / K - eixo x, U / O eixo J-Y, O / L - eixo z, número de 1/2 unidade) é usado para controlar o movimento porque as coordenadas serão atualizadas em tempo real.
   3. Clique no botão "Iniciar calibração" na interface gráfica do usuário principal (GUI) para a unidade correspondente na qual a pipeta está carregada ( Figura 2 ).
      NOTA: Uma janela pop-up aparecerá quando a calibração estiver concluída.
      NOTA: A calibração será realizada automaticamente, o que levará cerca de 3,5 min. Clicando no mesmo botão (comutado agora para "cancelar calibração" afCalibração iniciadora) abortará a tentativa de calibração.
   4. Salve a calibração clicando em "Salvar calibração" na parte inferior da GUI principal (economiza a calibração atual para ambos os manipuladores e pode ser carregada no futuro).
      NOTA: O campo de exibição sob ampliação baixa (4 ou 10X) e alta (40X) deve ser alinhado para que a calibração secundária funcione corretamente. Consulte o manual do usuário do sistema óptico em uso para os procedimentos de alinhamento.

2. Procedimento automático de grampeamento de patch

1. Prepare fatias cerebrais agudas, como descrito anteriormente ¹⁰ .
2. Prepare pipetas de vidro para o grampo de patch.
3. Coloque uma fatia de cérebro no centro da câmara de gravação. Estabilize a fatia com uma fatia de retenção ou "harpa".
4. Detectar a célula fluorescente.
   1. Encontre a área de interesse sob a lente 4X. Mova a fase do microscópio ativando o cliModo ck-to-move ("CTM") e clique no centro da área de interesse. Alternativamente, use o teclado para mover o estágio do microscópio (A / D - eixo dos x, eixo W / S-y, eixo R / F-z).
   2. Mude para a lente de alta ampliação e ajuste o foco movendo o microscópio no eixo z, usando R / F no teclado.
      NOTA: Recomenda-se ajustar o nível do banho de água para que o plano focal sob as lentes de alta e alta ampliação seja o mesmo ou similar no eixo z.
   3. Clique no botão "Detectar célula" na coluna GUI principal, "Unidade 0." Se o LED ou a fonte de luz laser da configuração não puderem ser controlados pelo sinal TTL, ligue manualmente o LED / laser; Uma janela pop-up aparecerá quando a detecção da célula estiver concluída.
      1. Desligue o LED / laser, se necessário; Uma lista de coordenadas de célula aparecerá na GUI de "posições de memória". Remova as células indesejadas da lista clicando no botão "X" ao lado das coordenadas.
      2. Alternativamente, se as células-alvo não estiverem rotuladas de forma fluorescente, clique em "Modo do mouse" na GUI principal. Clique na célula de interesse; Um ponto amarelo com um número aparecerá na célula, e as coordenadas da célula aparecerão na GUI das "posições de memória".
5. Calibre a pipeta secundária.
   1. Preencha 1/3 de uma pipeta de vidro com solução interna. Coloque a pipeta no suporte da pipeta anexada ao estágio da cabeça.
   2. Use a lente de baixa ampliação. Traga a pipeta para o campo visual e ajuste o foco usando o teclado (H / K - eixo x, eixo U / J - y, eixo O / L - Z). Use "1" e "2" para alternar entre a unidade 1 ea unidade 2.
   3. Carregue a calibração primária clicando em "Carregar calibração". Clique no botão "Calibração secundária" na GUI principal sob a unidade que está em uso. Por exemplo, se a unidade 2 estiver em uso, clique no botão "Calibração secundária" no "Unidade 2" coLumn. Siga as instruções da janela pop-up para alternar para a lente de alta ampliação.
6. Remova uma célula alvo.
   1. Verifique se o software "MultiClamp" ( ou seja, amplificador) está sendo executado. Clique no botão "Patch Control" para abrir a GUI "Patch Control"; Pode demorar até alguns minutos para abrir esta GUI.
   2. Use a lente de ampliação 40X, verificando "40X" na coluna GUI principal "Unidade 0". Clique no botão "ir para" ao lado da célula de interesse na lista de coordenadas na GUI da "posição de memória"; O microscópio se moverá para a célula.
   3. Clique no botão CTM da unidade em uso na GUI principal para ativar o movimento após o clique do mouse. Clique na célula de interesse; A ponta da pipeta vai se mover para a célula.
   4. Clique no botão "Patch" na GUI "Patch Control".
      NOTA: Parágrafo automático começará, e a pressão e a resistência podem ser monitoradasA GUI "Patch Control".
      1. Use o botão "Unidade 1 selecionada" para alternar o sinal de entrada entre as duas unidades.
         NOTA: O sistema abordará a célula alvo, aplicará pressão negativa, combinará o potencial da membrana celular e detectará a formação de gigasea com base em uma série de limiares e lógica de pressão e resistência.
      2. Manipule o processo automático em qualquer ponto clicando nos respectivos botões na GUI "Patch Control". Por exemplo, clique no botão "Patch" novamente para cancelar o teste do patch e clique em "Próxima etapa" para avançar o processo de correção para o próximo passo, independentemente do limite.
         NOTA: Uma janela pop-up notificará o usuário quando um gigaseal se formou, e a opção de aplicar zap juntamente com grande pressão negativa será apresentada.
   5. Selecione "Sim" para entrar com zap combinado e sucção. Alternativamente, selecione "Não" para entrar apenas com sucção.
      NOTA: Quando um patch completo de células inteiras for concluído, uma janela pop-up lembrará o usuário de salvar o log de patch da experiência.
   6. Salve o log de patch do experimento.
      NOTA: se um teste de patches não for bem sucedido, uma janela pop-up notificará o usuário e o processo de patch será reiniciado.
   7. Volte para a etapa 2.4 e repita as etapas com uma célula diferente.
7. Refinar os limites de patches (opcional).
   NOTA: Limiares para a faixa inicial de resistência à pipeta, pressão positiva e negativa, resistência gigaseal, etc. Pode ser modificado a partir de um arquivo de configuração.
   1. Abra o arquivo "PatchControlConfiguration.csv" na pasta "Configuração" no destino onde o sistema está instalado. Altere os números correspondentes a cada valor de limiar. Não altere os nomes dos valores; Isso resultará em entradas irreconhecíveis no sistema.
   2. Implementar os novos valores de limiar imediatamente pressionando "CtRl + L "sem reiniciar o programa; o reinício do programa implementará o valor de limiar mais recente do arquivo.

3. Realizar gravações

NOTA: O modo no amplificador de microeletrodos controlado pelo computador será ajustado automaticamente para a Clamp atual ("IC") pelo software autopatcher uma vez que um patch bem-sucedido tenha sido alcançado. As gravações de grampos de patch de células inteiras podem ser feitas usando o software de gravação de eleição (este sistema não inclui uma função de gravação). Se várias células alvo foram identificadas, depois de terminar uma gravação, volte para o passo 2.4 e tente outra célula.

1. Execute experimentos de aplicação de medicamentos locais automáticos usando um picospritzer (opcional).
   NOTA: Aqui, um experimento de aplicação de medicamento local é usado como um exemplo para descrever como usar a função adicional de "seqüência de comando" para controlar hardware externo através de sinais TTL.
   1. Conecte a porta A chaNnel 0 e o chão na placa DAQ secundária para a entrada de disparo inicial no digitalizador usando um cabo BNC despojado (conforme descrito no passo 1.2.3). Conecte um canal de saída digital no digitalizador ao gatilho externo no picospritzer.
   2. Prepare o picospritzer de acordo com o manual do usuário. Conecte a saída de ar de picospritzer ao suporte de pipeta de droga-puff anexado a um micromanipulador.
   3. Carregue uma pipeta preenchida com uma droga de escolha. Anexe-o ao titular da pipeta. Calibre a pipeta, conforme descrito no passo 1.7.
   4. Depois de corrigir uma célula conforme descrito no passo 2.6, selecione um local desejado para entrega de drogas clicando com o mouse na GUI de visualização da câmera em "modo mouse" (comutação da GUI principal). Alternativamente, use a GUI "Grid" para projetar uma grade, com cada pixel na grade como um dos locais alvo.
      NOTA: A grade pode ser manipulada na GUI de visualização da câmera arrastando com o mouse.
   5. No comando "SequGUI, selecione a unidade de manipulação em que a pipeta do medicamento está montada. Clique em "carregar pontos do mouse" ou "carregar pontos da grade" para importar todas as coordenadas para a entrega do medicamento.
      1. Clique em cada entrada de coordenadas para editar o sinal TTL do comando específico na coluna da direita. Na primeira entrada do comando, clique no dígito mais à direita para ativá-lo de "0" a "1", enviando um sinal TTL de + 5-V. Defina o tempo (T) para a duração desejada do sinal TTL, em ms.
      2. Na segunda entrada de comando, ajuste todos os dígitos para "0" e ajuste T para a duração do tempo de gravação do teste. Edite comandos para todas as entradas de coordenadas. Adicione entradas de comando clicando em "+" se forem necessários vários sinais TTL.
         NOTA: Os bits de 8 dígitos representam os canais da porta A 0-7 no DAQ secundário (as portas 1 a 3 são ocupadas pela bomba e duas válvulas) podem ser comutadas, se necessário.
   6. Crie um protocolo de gravação no módulo de aquisição de dados paraQue o início de uma varredura é desencadeado pelo gatilho de início externo. Edite o protocolo para entregar o medicamento no horário desejado.
   7. Na GUI do "Sequência de Comando", clique em "Executar" à esquerda para executar todas as coordenadas. Alternativamente, clique em "Executar" à direita para executar apenas a seqüência selecionada.
      NOTA: A pipeta se moverá para cada coordenada e executará o sinal TTL conforme definido para iniciar a varredura de gravação.

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Resultados

Nosso sistema foi testado em sua capacidade de remendar células em fatias agudas do cérebro, células tumorais pluripotentes induzidas por mouse (iPSCs) diferenciadas em neurônios e células HEK 293 que expressam artificialmente canais de interesse. A Figura 3 mostra uma experiência utilizando ratinhos transgênicos Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) visando os neurônios piramidais da camada 5 marcados fluorescentemente no cór...

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Discussão

Aqui, descrevemos um método para gravações automáticas de grampos de patch guiados por imagem in vitro . Os passos principais neste processo estão resumidos da seguinte forma. Primeiro, a visão computacional é usada para reconhecer automaticamente a ponta da pipeta usando uma série de imagens adquiridas através de um microscópio. Esta informação é então utilizada para calcular a função de transformação de coordenadas entre o microscópio e os sistemas de coordenadas do manipulador. A visão co...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCD Camera	QImaging	Rolera Bolt
Electrophysiology rig	Scientifica	SliceScope Pro 2000	Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is “Linlab2”.
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	computer-controlled microelectrode amplifier
Digitizer	Molecular Devices	Axon Digidata 1550
LED light source	Cool LED	pE-100	488 nm wavelength
Data acquisition board	Measurement Computing	USB1208-FS	Secondary DAQ. See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Solenoid valves	The Lee Co.	LHDA0531115H
Air pump	Virtual industry	VMP1625MX-12-90-CH
Air pressure sensor	Freescale semiconductor	MPXV7025G
Slice hold-down	Warner instruments	64-1415 (SHD-40/2)	Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm
Python	Anaconda	version 2.7 (32-bit for windows)	https://www.continuum.io/downloads
Screw Terminals	Sparkfun	PRT - 08084	Screw Terminals 3.5 mm Pitch (2-Pin)
(2-Pin)
N-Channel MOSFET 60 V 30 A	Sparkfun	COM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin	Sparkfun	PRT-07937
LED - Basic Red 5 mm	Sparkfun	COM-09590
LED - Basic Green 5mm	Sparkfun	COM-09592
DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)	Sparkfun	PRT-12748
Wall Adapter Power Supply - 12 V DC 600 mA	Sparkfun	TOL-09442
Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)	Sparkfun	PRT-11367
Locking Male x Female x Female Stopcock	ARK-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings	Fisher scientific	14-171-129	Outer Diameter: 1/8 in. Inner Diameter: 1/16 in.
BNC male to BNC male coaxial cable	Belkin Components	F3K101-06-E
560 Ohm Resistor (5% tolerance)	Radioshack	2711116
Picospritzer	General Valve	Picospritzer II