Determinação de ácidos sialic em amostras de fígado e leite de tipo selvagem e<em&gt; CMAH</em&gt; Ratinhos de eliminação.

Resumo

Descrevemos um método baseado em HPLC para a determinação de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico em fígado e leite de rato.

Resumo

A CMAH (hidroxilase de ácido citidina monofosfato-N-acetilneuramínico) é responsável pela oxidação de ácidos citidina monofosfato-N-acetilneuraminico em mamíferos. No entanto, os seres humanos não podem oxidar o ácido monofosfato-N-acetilneuramínico da citidina para o ácido monofosfato-N-glicolneuraminico de citidina devido a uma deleção primária de exão do gene CMAH . Para entender os efeitos e as implicações da falta de atividade do CMAH com mais detalhes, um modelo de nocaute Cmah em camundongos é de grande interesse na pesquisa básica e aplicada. O método de análise para determinar o fenótipo deste modelo de rato é aqui descrito em detalhe e é baseado na detecção de ácido N-acetilneuraminico e ácido N-glicolilenuraminico no fígado e leite de camundongos de tipo selvagem e Cmah knock-out. Os ácidos sialicos endógenos são liberados e derivados com o-fenilenodiamina para gerar derivados fluorogénicos, os quais podem ser posteriormente analisados ​​por HPLC. O protocolo apresentado pode serTambém aplicou para a análise de amostras de leite e tecido de várias outras origens e pode ser útil para investigar os efeitos nutricionais e da saúde do ácido N-glicoliluramina.

Introdução

O ácido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e o ácido N-glicolneuraminico (Neu5Gc) são os ácidos sialicos mais comuns na maioria dos mamíferos ¹ . Embora capaz de sintetizar Neu5Ac de forma endógena, os seres humanos não são capazes de produzir Neu5Gc devido a uma deleção primária de exão no gene CMAH que codifica uma hidroxilase ^{2 , 3 de} CMP-Neu5Ac. No entanto, os produtos alimentares baseados em animais podem ser fontes dietéticas de Neu5Gc ^{4 , 5 , 6} , levando à produção de anticorpos anti-Neu5Gc e, portanto, desencadeiam uma resposta imune em direção a Neu5Gc ⁷ . Este efeito dietético de Neu5Gc é suspeito de contribuir para a inflamação crônica e várias outras doenças ^{8 , 9 , 10} . A fim de compreender de forma abrangente os efeitos de Neu5Gc em hUm modelo animal para o estudo sistemático dos efeitos de ácidos sialicos de origem alimentar é altamente desejável. Embora os protocolos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR) para a análise de camundongos nocaute estão bem estabelecidos e uma maneira conveniente para a avaliação genotípica, a análise funcional do fenótipo no nível metabólico requer métodos de análise mais específicos. O fenótipo de um modelo de rato knock-out Cmah pode ser avaliado isolando e analisando a composição de ácidos siálicos em amostras de fígado ou leite. Vários métodos para a detecção de ácidos siiálicos em tecidos animais foram relatados anteriormente: reagir ácidos siálicos com resorcinol ¹¹ ou ácido tiobarbitúrico ¹² resultam na formação de um produto cromóforo e podem ser simplesmente analisados ​​usando uma configuração baseada em platereader, mas apenas o sialico total O teor de ácido pode ser determinado. Alternativamente, a análise de ácidos siálicos também foi descrita utilizando cromatografia em fase gasosa¹³ , espectrometria de massa MALDI-ToF ¹⁴ ou métodos amperométricos ¹⁵ . No entanto, os métodos de análise de ácido siálico mais comummente aplicados são baseados em liberação hidrolítica, seguidos de derivação de fluorescência e subsequente cromatografia líquida de alto desempenho ^{16 , 17 , 18} .

Protocolo

Os procedimentos envolvendo assuntos de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Centro de Animal Experimental da Universidade Agrícola de Nanjing de acordo com as Diretrizes Nacionais para o Bem-estar Animal Experimental (Ministério da Ciência e Tecnologia, PR da China, 2006) com os animais alojados em um SPF Facilidade (ID de permissão: SYXK-J-2011-0037).

1. Cmah Knock-out Mouse Model

1. Use ratinhos C57Bl / 6 de tipo selvagem do Centro de Medicina Comparada da Universidade de Yangzhou (China).
   NOTA: Os ratos Cmah knock-out foram gerados com base na informação fornecida pelos estudos anteriores ^{17 , 19} da Cmah e obtidos comercialmente usando uma estratégia CRISPR / Cas9 ²⁰ , removendo 92 pares de bases do exão 6 do gene Cmah , o que também é Eliminado no gene CMAH humano ¹⁹ . Positivo F _{0 <}/ Sub> -mice (2 indivíduos) foram cruzados com camundongos de tipo selvagem para obter ratazana F ₁ heterozigótica. Depois de atravessar _um heterozigoto F -mice (5 pessoas), homozigica CMAH knock-out F ₂ -mice poderia ser obtida com sucesso (3 indivíduos).
2. Execute genotipagem de camundongos usando DNA genômico de acordo com o método demonstrado por Zangala ²¹ usando um kit comercial de purificação de DNA.
   1. Amplificar um fragmento de DNA correspondente do gene Cmah usando DNA polimerase comercial e o par de iniciadores 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'e 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Execute a amplificação do gene utilizando 34 ciclos de PCR consistindo em desnaturação a 94 ° C durante 40 s, recozimento a 63 ° C durante 40 s e alongamento a 72 ° C durante 1 min.
   2. Visualize produtos de PCR em um gel de agarose a 1%. Deve observar uma única banda (0,5 kb) para o indivíduo de tipo selvagem, uma banda dupla (0,4 e 0,5 kb) para aIndivíduo knock-out heterocigótico, e uma única banda (0.4 kb) para o indivíduo homozigoto knock-out.

2. Coleção de Amostras

1. Coletar leite de rato usando o protocolo descrito por Willingham et al. ²² .
2. Coletar o tecido hepático do mouse usando o protocolo descrito por Gonçalves et al. ²³ e armazene amostras a -80 ° C.

3. Isolamento de ácidos sialic do leite

1. Prepare 100 mL de uma solução de ácido acético 2 M adicionando 12 mL de ácido acético glacial em 88 mL de H _{2 O} destilado.
2. Transfira 50 μL de leite para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e adicione 1,2 ml da solução aquosa preparada de ácido acético.
3. Incubar a suspensão durante 4 h a 80 ° C e centrifugar a amostra a 14 000 xg durante 10 min.
4. Transfira os 1.000 μL superiores do sobrenadante para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL e remO solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente para completar a secura (dependendo da bomba de vácuo anexada, isso levará de 4 a 20 h). Re-dissolver a amostra em 500 μL de H _{2 O} destilado.
5. Prepare uma coluna de troca de anião-anião. Este passo irá enriquecer especificamente compostos aniônicos e remover compostos catiônicos e neutros das amostras de leite e fígado e, portanto, aumenta a seletividade do agente de rotulagem OPD fluorogênico para a derivação do ácido siálico.
   1. Transferir para cada amostra 200 mg da resina de permuta aniónica (Dowex 1X8) em tubos de coluna de 3 mL vazios com uma torneira de ligação anexada.
   2. Adicionar 2 mL da solução aquosa de ácido acético preparada no passo 3.1 para substituir os iões cloreto na resina com íons acetato. Feche a torneira assim que o solvente atingir o topo da resina.
   3. Adicione gentilmente 2 mL de H ₂ O destilado, abra a torneira e pare o fluxo assim que a maior parte do solvente atingirO topo da resina. Certifique-se de que a resina esteja sempre coberta com solvente.
   4. Lave a coluna de resina duas vezes mais com 2 mL de H ₂ O destilado para remover o excesso de acetato.
6. Transfira os 500 μL resultantes de solvente da amostra a partir do passo 3.4. Na coluna de resina e descarte o fluxo. Com cuidado, lavar a resina com 2 ml de _H2O destilada Eluir os aniões de amostra a partir da resina utilizando 1 mL de uma solução de acetato de amónio 50 mM (386 mg de acetato de amónio dissolvido em 100 mL de _H2O destilada) em um 1,5 mL Tubo de centrífuga. Remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente até à secura.
   NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a 4-6 ° C por até 12 meses.

4. Isolamento de ácidos sialic a partir de tecido de fígado

1. Descongelar suavemente 20 - 50 mg de fígado de rato e transferi-lo para um moedor de tecido Dounce (1 mL ou 2 mL de volume). Adicionar 1,2 ml da solução aquosa de ácido acéticoPreparado no passo 3.1 e homogeneizar o tecido por um corte suave durante 10 s. Transfira a suspensão resultante para um tubo de centrifugação de 1,5 mL.
2. Siga as etapas 3.3. Para 3.6.
   NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a 4-6 ° C por até 12 meses.

5. Preparação de um padrão de ácido siálico misto

1. Pesar entre 5 e 8 mg de ácido N-acetilneuramínico em um balanço analítico em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Observe o peso exato e adicione 164 μL de H ₂ O destilado por cada mg ( ou seja, se o peso de Neu5Ac for 7.2 mg, então adicione 7.2 x 164 = 1, 181 μL de H ₂ O destilado). Isso resulta em uma solução de estoque Neu5Ac 20 mM que pode ser armazenada a -20 ° C por até 12 meses.
2. Obter ácido N-glicolneuraminico em quantidades menores a um preço moderado, tal como em alíquotas de 1 mg. Adicionar 154 μL de H ₂ O destilado diretamente ao composto para obter uma solução de reserva de Neu5Gc ~ 20 mM. Transfira oSolução em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Esta solução pode ser armazenada a -20 ° C por até 12 meses.
3. Combine 5 μL de cada solução de base do passo 5.1 e 5.2 em um tubo de centrífuga fresco de 1,5 mL e remova o solvente por evaporação centrífuga à temperatura ambiente até à secura.
   NOTA: O padrão de ácido sialico misto pode ser armazenado a 4 - 6 ° C por até 12 meses.

6. Fluorescência Derivação de Ácidos Sialicos

1. Prepare 10 mL de solução de OPD, consistindo em 100 mg de o-fenilenodiamina e 208 mg de hidrogeno sulfito de sódio em 10 mL de H _{2 O} destilada.
2. Adicione 20 μL de solução de OPD às amostras de ácido siálico derivadas de leite de rato (passo 3), fígado de rato (passo 4) ou padrão de ácido sialico misto (passo 5). Vortex vigorosamente por 30 s e incubar as amostras durante 4 h a 80 ° C no escuro ( ou seja, envolva os microtubos na folha de alumínio).
3. Deixe as amostras esfriarem por 5 min, adicione 80 μ; L de H ₂ O destilada e centrifugar os tubos a 14 000 xg durante 1 min.
4. Transferir 80 μL do sobrenadante para um frasco de HPLC de alta recuperação de 300 μL. As amostras de ácido siálico derivadas podem ser armazenadas a 4 - 6 ° C por até uma semana.

7. Análise HPLC de Derivados de Ácido Sialico

1. Analise as amostras usando um sistema HPLC padrão conectado a um detector de fluorescência online.
2. Use uma coluna de fase C18 com as dimensões padrão de 250 mm de comprimento e 4,6 mm de diâmetro para a análise.
3. Prepare o solvente A diluindo 200 mL de solução de reserva com 800 mL de água com LCMS (LCMS - cromatografia líquida em massa de espectrometria). A própria solução-mãe pode ser preparada da seguinte forma:
   1. Adicionar 46 g de ácido fórmico a 800 mL de LCMS-classe de H ₂ O.
   2. Ajustar o pH a 4,5, adicionando gota a gota solução de hidróxido de amônio (pur. Pa).
   3. Transfira o solvente para umCilindro de medição e preencha até 1.000 mL com H _{2 O de} grau LCMS. Esta solução pode ser armazenada entre 4 e 6 ° C por até 3 meses.
4. Para o solvente B, use acetonitrilo de grau LCMS.
5. Separar os derivados de ácidos siálicos a uma taxa de fluxo de 1 mL / min com a seguinte eluição gradiente:
   1. Comece adicionando 10% do solvente B misturado ao solvente A.
   2. De 0 min a 15 min, aumenta gradualmente a proporção de solvente B com um gradiente linear para 60%.
   3. De 15 min a 16 min, aumenta rapidamente a proporção de solvente B com um gradiente linear de 60% a 90%. Isso inicia a lavagem da coluna HPLC.
   4. Para lavar ainda mais a coluna de HPLC, mantenha o nível de solvente B a 90% entre 16 min e 18 min antes de reduzir gradualmente o nível de solvente B novamente para 10% entre 18 min e 19 min.
   5. Reequilibre a coluna HPLC nas condições iniciais de 10% B entre 19 e 24 min.
6. DentroControle 50 μL de amostra para o sistema HPLC.
7. Monitorar eluentes usando os comprimentos de onda de excitação / emissão do detector de fluorescência de 373/448 nm, e os ácidos sialic derivatizados podem ser esperados nos tempos de retenção aproximados de 9 min (para Neu5Gc-OPD) e 10 min (para Neu5Ac-OPD).
8. Calcule a quantidade relativa de Neu5Gc (F _Neu5Gc ) das áreas de pico de fluorescência do Neu5Ac (A _Neu5Ac ) e Neu5Gc (A _Neu5Gc ) da seguinte maneira: F _Neu5Gc [%] = 100 × A _Neu5Gc / (A _Neu5Ac + A _Neu5Gc ). No caso das amostras de leite e fígado do mouse knock-out de Cmah homozigoto, F _Neu5Gc deve ser 0%, enquanto que os valores para F _Neu5Gc de camundongos heterozigóticos e de tipo selvagem podem variar amplamente dependendo da idade do mouse e do tipo de tecido (entre 2% E> 90%) com margens de erro esperadas de ± 12%.

Resultados

Uma visão geral esquemática do método de análise descrito é mostrada na Figura 1 e inclui o isolamento de ácidos sialicos a partir de amostras de leite e fígado de camundongos mutantes de tipo selvagem e Cmah knock-out, e a derivação de fluorescência e a análise por HPLC desses componentes. A Figura 2 e a Figura 3 mostram cromatogramas de HPLC representativos de ácidos ...

Discussão

O protocolo aqui apresentado permite a avaliação fenotípica de camundongos knock-out Cmah homozigotos, analisando e quantificando as quantidades relativas de Neu5Gc de amostras de leite e fígado. A análise foi realizada usando uma configuração padrão de HPLC com detecção de fluorescência. O passo mais crítico deste procedimento é a preparação das colunas de troca de aniões e a realização da cromatografia de troca de aniões; Para resolver adequadamente a resina e para coletar as frações corr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
N-acetylneuraminic acid	Sigma	A0812
N-glycolylneuraminic acid	Sigma	50644	1 mg aliquot should be sufficient
o-Phenylenediamine	Sigma	694975
Sodium hydrogen sulfite	J&K Scientific Ltd	75234
Tools/Materials:
3 mL SPE tubes	Supelco	Sigma 57024	empty solid phase extraction columns
Luer stopcock	Sigma	S7396	to stop the flow of the SPE tube
Dowex 1X8	Dow Chemicals	Sigma 44340	200 - 400 mesh
Dounce tissue grinder	Sigma	D8938	tight fit
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial	Agilent Technologies	#5188-2788
HPLC System	Shimadzu	Nexera
Fluorescence Detector for HPLC	Shimadzu	RF-20Axs
HPLC Column	Phenomenex	Hyperclone ODS	250 x 4.6 mm
LCMS-grade H2O	Merck Millipore	#WX00011
LCMS-grade Acetonitrile	Merck Millipore	#100029	Hypergrade
Ammonium hydroxide solution	Fluka	#44273	puriss. P.a.