Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

Resumo

Este protocolo fornece instruções para amostras de vírus de coloração negativa que podem ser facilmente usadas em laboratórios BSL-2, -3 ou -4. Inclui o uso de uma cápsula de processamento inovadora, que protege a grade de microscopia eletrônica de transmissão e fornece ao usuário um tratamento mais fácil nos ambientes mais turbulentos dentro da biocontainment.

Resumo

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é usada para observar a ultraestrutura de vírus e outros agentes patogênicos microbianos com resolução nanométrica. A maioria dos materiais biológicos não contém elementos densos capazes de espalhar elétrons para criar uma imagem; Portanto, uma mancha negativa, que coloca sais densos de metais pesados ​​em torno da amostra, é necessária. Para visualizar vírus em suspensão sob o TEM, eles devem ser aplicados em grades pequenas revestidas com uma superfície transparente apenas nanômetros de espessura. Devido ao seu pequeno tamanho e fragilidade, essas redes são difíceis de manusear e movimentadas facilmente pelas correntes de ar. A superfície fina é facilmente danificada, deixando a amostra difícil ou impossível de imagem. Os vírus infecciosos devem ser tratados em um gabinete de biossegurança (BSC) e alguns exigem um ambiente de laboratório de biocontainment. A coloração de vírus em níveis de biossegurança (BSL) -3 e -4 é especialmente desafiadora porque esses ambientes são mais turbulentos e técnicos são necessários tUsar equipamento de proteção pessoal (PPE), que diminui a destreza.

Neste estudo, avaliamos um novo dispositivo para auxiliar nos vírus de coloração negativos no biocontainment. O dispositivo é uma cápsula que funciona como uma ponta especializada de pipeta. Uma vez que as grelhas são carregadas na cápsula, o usuário simplesmente aspira reagentes na cápsula para entregar o vírus e manchas na grade encapsulada, eliminando assim o uso do usuário de grades. Embora esta técnica tenha sido projetada especificamente para uso em BSL-3 ou -4 biocontainment, ela pode facilitar a preparação da amostra em qualquer ambiente de laboratório, permitindo uma coloração negativa fácil de vírus. Este mesmo método também pode ser aplicado para preparar espécimes TEM corados negativamente de nanopartículas, macromoléculas e espécimes semelhantes.

Introdução

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é uma ferramenta eficaz para visualizar a morfologia e a ultraestrutura de espécimes biológicos que são muito pequenos para serem vistos com um microscópio de luz tradicional ^{1 , 2 , 3 , 4} . Os TEMs disparam elétrons através de um espécimen muito fino produzindo uma imagem de maior resolução, pois os elétrons têm um comprimento de onda muito menor do que a luz. As regiões da amostra que dobram ou bloqueiam elétrons aparecem escuras, enquanto as regiões que são elétron lucent aparecem brancas.

A falta de matéria densa por elétrons torna os vírus difíceis de visualizar sob um TEM porque eles não podem espalhar elétrons. A coloração negativa é o método mais comum usado para criar contraste e visualizar vírus com TEM. O primeiro procedimento de coloração negativa foi proposto por Brenner e Horne em 1959, com base em um experimento onde Hall (1955) e Huxley (1957) observaramO aparecimento de estruturas biológicas em contraste inverso quando imerso em uma substância densamente elétrica ⁵ . O processo de coloração negativa foi praticamente inalterado ao longo do último meio século. A coloração negativa envolve a aplicação sucinta de uma solução de sal de metal pesado a uma amostra em uma grade TEM na tentativa de cercar o vírus com material denso sem infiltrar o vírus ⁶ . Isso cria uma borda escura e revela a forma da partícula ⁵ . Este estudo utiliza dois reagentes para coloração negativa, acetato de uranilo (UA) e ácido fosfotendssico de potássio (PTA). Ambas as manchas são comumente usadas para manchar negativamente pequenas amostras biológicas, como vírus, complexos de proteínas e nanopartículas ^{7 , 8 , 9} .

A técnica de coloração negativa convencional é a tecnologia manual de coloração negativa de gotículasNique ⁷ . Este método requer manuseio preciso de grades TEM pequenas e frágeis com fórceps para aplicar pequenas quantidades de amostra de vírus, manchas e enxaguamentos. O protocolo de preparação típico envolve a aplicação de uma gota de suspensão de amostra na superfície de uma grade de TEM revestida por película ( Figura 1A ). Após a anexação da amostra à superfície do filme, a grade é enxaguada para remover vírus não aderentes e corada com UA ou PTA por alguns segundos a um minuto, dependendo do tipo de amostra. O excesso de líquido é perverso para fora da grade, tocando um pedaço de papel de filtro na borda da grade.

O método de gota manual exige que cada grade seja feita individualmente. Se não for manuseado com cuidado, as grades de TEM revestidas são facilmente perfuradas, dobradas ou contaminadas. O processamento de múltiplas amostras pode levar a dificuldades no rastreamento das redes e na garantia de coloração consistente para cada amostra. Este procedimento de coloração manual é muito maisÉ difícil quando conduzido nos laboratórios de biocombustível (BSL) -3 e -4 biocontainment, devido ao equipamento de proteção pessoal (PPE) necessário para esses ambientes. O PPE é pesado e o ambiente de biocontainment é muito mais turbulento em comparação com um laboratório regular. O pessoal que trabalha nos laboratórios de biocontainment da BSL-3 é obrigado a usar 2 pares de luvas e trabalhar em um gabinete de biossegurança (BSC). Esta dupla camada de luvas reduz a sensibilidade tátil e restringe os movimentos finos do motor. O fluxo de ar do BSC que protege o usuário e ajuda a prevenir a contaminação da amostra pode fazer com que as amostras e as manchas secam muito rapidamente, afetando assim a qualidade da mancha. O forte fluxo de ar turbulento no BSC também pode destruir rapidamente uma grade que não está bem protegida. Nos laboratórios BSL-4 biocontainment, existem requisitos de segurança adicionais. O pessoal é obrigado a usar um traje de pressão positiva, o que restringe os movimentos físicos e a capacidade de ver e manipular claramenteGrades ulate. O técnico que trabalha no BSL-4 também usa pelo menos 2 pares de luvas, sendo o par externo uma luva grossa que reduz consideravelmente a destreza e a sensação tátil. Finalmente, as pinças usadas para lidar com grades TEM são afiadas, representando um risco para o técnico devido à sua capacidade de perfurar luvas. Com cápsulas contendo grades, fórceps não são necessárias, proporcionando assim uma alternativa segura e sem pinça para manipular grades em biocontainment. Finalmente, as cápsulas também fornecem uma maneira eficaz de armazenar grades durante o processamento, descontaminação de vapor de osmium e durante o armazenamento; Mantendo as redes organizadas e protegidas contra danos.

Neste relatório, apresentamos um novo método para grades TEM de coloração negativa em laboratórios de biocontainment que utilizam cápsulas mPrep / g, um dispositivo baseado em cápsulas para manuseio e coloração de grade ^{10 , 11 , 12} . O acompanhamento da cápsulaModifica duas redes TEM, minimiza o manejo direto e reduz o potencial de danos na grade. A cápsula se liga diretamente a uma pipeta de um ou vários canais da mesma maneira que uma ponta de pipeta, permitindo a aplicação de vários líquidos a grades contidas. Isso permite a preparação simultânea de múltiplas amostras com grades duplicadas ( Figura 1B ). Para a mancha negativa com cápsulas, a amostra de vírus é aspirada na cápsula e mantida durante 10 min para permitir que os vírus se adsorvem nas superfícies da grade. As redes com vírus adsorvido são subsequentemente lavadas com água desionizada (dI) e coradas com UA ou PTA durante alguns segundos a 1 min. Este processo usa os mesmos passos do protocolo e reagentes como o método manual de gotículas; A diferença é que todo o trabalho ocorre dentro da cápsula sem manipulação física das grades. ( Figuras 1C , 1D ).

O objetivo deste estudo foi avaliar as cápsulas comoUm novo método para coloração negativa de amostras de vírus em ambientes de biocontainment. Este estudo também examinou a qualidade das imagens TEM produzidas a partir de dois procedimentos de inativação de vírus diferentes: 1) inativação rápida, com 1% de vapor de tetróxido de ósmio e 2) inativação de 24 h com 2% de glutaraldeído. Ambos foram conduzidos usando as cápsulas. Finalmente, avaliamos duas manchas negativas de uso comum, UA e PTA, para uso na cápsula. ¹³

Protocolo

1. Preparação da experiência em um ambiente BSL-2 antes de trabalhar com as amostras de vírus

1. Prepare ou compre Formvar e placas de cobre TEM revestidas de carbono, geralmente 200-400 mesh.
2. Insira as grades TEM revestidas em cápsulas.
   1. Use uma lente ampliada para tornar este processo fácil de executar. Uma ou duas grades podem ser inseridas em cada cápsula. As cápsulas pré-carregadas podem ser compradas para eliminar este passo, se desejado.
3. Transfira as cápsulas com grades revestidas de TEM inseridas, juntamente com outros suprimentos e reagentes, para o armazenamento biocontenho onde os vírus serão manchados negativamente.

2. O método da cápsula para coloração negativa em Biocontainment usando Glutaraldeído aquoso e 1% de inibição de vapor de tetraxido de ósmio

1. Dentro do BSC de biocontainment, aspirar 40 μL de suspensão de vírus na cápsula anexada a uma pipeta.
   NOTA: A pipeta permanece em anexoE cápsula até que o processo seja concluído. A preparação de vírus está de acordo com nossa publicação anterior ¹⁴ .
2. Coloque a pipeta no seu lado por 10 min com grelhas orientadas horizontalmente. Isto é para promover uma distribuição uniforme de partículas de vírus nas grades revestidas.
3. Inactive o vírus dentro da cápsula dentro do BSC biocontainment.
   1. Pegue a pipeta e pressione o êmbolo para distribuir a solução de vírus em um recipiente de lixo.
   2. Aspirar 40 μL de fixador de glutaraldeído a 2% nas cápsulas.
      Cuidado: O glutaraldeído é um produto químico perigoso e requer proteção adequada. O glutaraldeído pode ser usado por breves períodos em um BSC normal, mas o reagente aberto prolongado requer trabalhar em um BSC canalizado ou exaustor químico.
   3. Coloque a pipeta no seu lado por 20 min. Isto é para garantir que as amostras estejam bem corrigidas.
   4. Expulsar o fixador e aspirar 40 μL de água dI nas cápsulas para wArrumar o fixador. Repita este passo de lavagem para um total de 3 ciclos de enxágue.
4. Aspirar 40 μL de 1% de acetato de uranil (UA) ou 1% de ácido fosforumosssêmico de potássio (PTA) nas cápsulas e permitir que se sente durante 30 s.
   NOTA: O tempo de coloração pode variar de 10 s para 1 min com base na amostra de vírus.
   Cuidado: UA é um emissor alfa e uma toxina cumulativa. Controle-o com a proteção apropriada.
5. Remova a cápsula da pipeta e remova as grelhas tocando um pedaço de papel de filtro na borda das grades enquanto as grades permanecem dentro da cápsula.
6. Procedimento de inactivação de vapor de tetróxido de osmio.
   1. Coloque a cápsula, com a tampa aberta, em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo papel de filtro embebido em uma solução de tetróxido de ósmio a 1%.
      Cuidado: o tetróxido de ósmio é extremamente tóxico com baixa pressão de vapor. Ele deve ser usado em um BSC canalizado ou exaustor químico. Controle-o com a proteção apropriada. Post warningInformações na área de trabalho.
   2. Selar o tubo de centrífuga de 50 mL por 1 h para permitir a permeação completa do vapor de tetróxido de ósmio. Em seguida, subsequentemente, descontaminar e transferir o tubo para fora da conexão de bioconstrução para a instalação de BSL-2 EM.
7. Remova as grades EM da cápsula.
   1. Na instalação BSL-2 EM, retire a cápsula do tubo de centrífuga e coloque-a sobre uma pipeta.
   2. Aspirar 40 μL de água dI na cápsula e distribuir a água em um recipiente de lixo três vezes.
   3. Remova a cápsula da pipeta e remova as grades usando papel de filtro para tocar a borda das grades.
   4. Após a secagem ao ar, armazene as grelhas para imagens subseqüentes TEM.

3. O Método da Cápsula para Inativação em Biocontainment com 2% de Glutaraldeído, Seguido por Coloração Negativa em um Laboratório BSL-2

1. Procedimento de inativação de vírus.
   1. Dentro do BSC de Biocontainment, misture bem a suspensão de vírus com o mesmo volume de 4% de glutaraldeído para atingir uma concentração final de 2% de glutaraldeído.
      Cuidado: O glutaraldeído é um produto químico perigoso e requer proteção adequada. O glutaraldeído pode ser usado por breves períodos em um BSC normal, mas o reagente aberto prolongado requer trabalhar em um BSC canalizado ou exaustor químico.
   2. Inactive vírus com fixador durante um mínimo de 24 h antes da embalagem, descontaminação e transfira-o para a instalação BSL-2 EM.
2. Na instalação de BSL-2 EM, aspirar o vírus e a mistura fixadora na cápsula, contendo duas grades de TEM, anexadas a uma pipeta.
3. Coloque a pipeta horizontalmente durante 10 min com as grades orientadas horizontalmente.
   NOTA: Isto é para promover uma distribuição uniforme de partículas de vírus nas grades TEM.
4. Pegue a pipeta e pressione o êmbolo para expulsar o vírus para um recipiente de lixo. Aspirar 40 μL de dIÁgua nas cápsulas e expulse-o para o recipiente de lixo para 3 ciclos de enxágue.
5. Aspirar 40 μL de 1% de UA ou 1% de PTA nas cápsulas por 30 s.
   NOTA: O tempo de coloração variou de 10 s a 1 min com base na amostra de vírus.
   Cuidado: UA é um emissor alfa e uma toxina cumulativa. Controle-o com a proteção apropriada.
6. Remova a cápsula da pipeta e remova as grelhas tocando na borda das grades em um pedaço de papel de filtro. Ar secar as grades e armazená-las para imagens subseqüentes TEM.

Resultados

O método da cápsula produz uma coloração negativa de boa qualidade para imagens TEM:

Primeiro, avaliamos a qualidade das imagens geradas usando tanto o método manual da gota e os métodos da cápsula para coloração negativa do ebolavírus do Zaire. Os ebolavírus são membros da família Filoviridae , juntamente com o vírus Marburg. O ebolavírus é tipicamente de 80 a 100 nm de diâmetro e pode ter mais de 1000 ...

Discussão

A coloração negativa é uma técnica TEM valiosa para avaliação e dimensionamento de vírus, complexos de proteínas e nanopartículas. A preparação de gotículas destes espécimes por movimentação manual de grades de reagente a manchas negativas tem sido o protocolo clássico há mais de meio século. É um processo simples, mas requer experiência adquirida através do treinamento para conclusão bem-sucedida. A excelente coloração negativa ainda é considerada um conjunto de habilidades state-of-the-art e a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM