Simples eliminação da fluorescência de fundo no tecido do cérebro humano fixada em formol para microscopia de imunofluorescência

Resumo

Fundo autofluorescência de amostras biológicas muitas vezes complica a técnicas de imagem baseada em fluorescência, especialmente em tecidos postmitotic humanos envelhecidos. Este protocolo descreve como autofluorescência destas amostras pode ser efetivamente removida usando uma luz disponível comercialmente, emitindo luz de diodo fonte para photobleach a amostra antes da imunocoloração.

Resumo

Imunofluorescência é um método comum usado para visualizar os compartimentos subcelulares e determinar a localização de proteínas específicas dentro de uma amostra de tecido. Um grande obstáculo para a aquisição de imagens de alta qualidade imunofluorescência é endógena autofluorescência do tecido causada por pigmentos de envelhecimento como lipofuscina ou por processos de preparação de amostra comum tais como fixação de aldeído. Este protocolo descreve como fluorescência de fundo pode ser grandemente reduzida com fotobranqueamento usando fósforo branco luz emitindo matrizes de diodo (LED) antes do tratamento com sondas fluorescentes. A amplo espectro emissão de fósforo branco LEDs permitem clareamento de fluorophores em toda uma gama de picos de emissão. O aparelho de fotobranqueamento pode ser construído a partir de componentes prontos para uso, a um custo muito baixo e oferece uma alternativa acessível para quenchers químicas disponíveis comercialmente. Um fotobranqueamento pré-tratamento do tecido seguido de mancha da imunofluorescência convencional gera imagens livre de autofluorescência de fundo. Em comparação estabelecida quenchers químicas que reduziu a sonda, bem como plano de fundo sinaliza, fotobranqueamento tratamento não teve efeito na intensidade de fluorescência da sonda enquanto efetivamente reduziu fundo e lipofuscina fluorescência. Embora fotobranqueamento requer mais tempo para pré-tratamento, matrizes de LED de intensidade mais elevadas podem ser usados para reduzir o tempo de fotobranqueamento. Potencialmente, este método simples pode ser aplicado a uma variedade de tecidos, tecidos particularmente postmitotic que acumulam lipofuscina, tais como o cérebro e músculos cardíacos ou esqueléticos.

Introdução

Microscopia de fluorescência usando anticorpos, proteínas específicas de direcionamento é rotineiramente usada para visualizar as proteínas de interesse em cultura de células e tecidos. Uma grande complicação para a aquisição de imagens claras e definitivas em imunofluorescência é autofluorescência, que pode ser causada endogenamente em tecidos de mamíferos pela idade do pigmento lipofuscina e por proteínas como a elastina e colágeno^{1, 2}. Outras fontes de autofluorescência podem ser introduzidos através de etapas de preparação de amostra como aldeído fixação³. Grânulos de lipofuscina, compostos principalmente de proteína oxidativamente modificada e resíduos de degradação de lipídios, acumulam-se nas células de vida longa, com aumento de idade². Isto provoca dificuldades em imagens postmitotic tecidos como o cérebro e os músculos cardíacos ou esqueléticos, como o espectro de emissão de fluorescência de lipofuscina é amplo e variável, muitas vezes coincidindo com o comprimento de onda de emissão de fluorophores comum usado para rotulagem de⁴. Esses fatores tornam a imagem do tecido do cérebro humano de casos de doenças neurodegenerativas de início tardio, como degeneração lobar frontotemporal (FTLD) especialmente desafiador.

Para reduzir a autofluorescência, criámos uma técnica na qual podemos irradiar as secções de tecido slide-montado com uma luz branca, emitindo a matriz de diodo (LED) usando uma lâmpada de mesa domésticos⁵. Esta técnica simples fornece uma alternativa às técnicas que usam químicas quenchers como CuSO₄ em acetato de amónio, ou comercialmente disponível extinguer corantes como Sudão negro B e preto de eriocromo T⁶. Também tem significativa economia de custo sobre multiespectral técnicas de fotobranqueamento lâmpada de LED e evita complicações e artefatos gerados a partir de métodos de remoção de autofluorescência digital como espectral un-mistura^7,8. Fósforo branco LEDs têm um amplo espectro de emissão, a alta luminosidade e a fabricação de baixo custo, tornando-os ideais como um componente de prateleira para fotobranqueamento uma variedade de cromóforos^5,9.

Neste protocolo, demonstramos a construção de um aparelho de fotobranqueamento usando componentes acessíveis e aplicar fotobranqueamento para um caso de tecido FTLD contendo inclusões tau-positivo (FTLD-T), usando um anticorpo específico para tau fosforilada. Vamos demonstrar o efeito de fotobranqueamento na imagem fluorescente etiquetado anticorpos empregando dois cromóforos comumente usados: Alexa 488 e Texas Red. O efeito de fotobranqueamento contra seções não tratadas ou aqueles tratados com um quencher químico comercial são quantificados e comparados. Este pré-tratamento fotobranqueamento pode ser incorporado em qualquer protocolo de coloração padrão de imunofluorescência para remover autofluorescência em uma amostra biológica.

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Protocolo

Nota: O trabalho apresentado foi realizado em conformidade com as normas internacionais reconhecidas, incluindo a conferência internacional sobre harmonização (ICH), o Conselho para internacional organizações de Medical Sciences (CIOMS) e os princípios da declaração de Helsinque. Utilização de tecido humano foi com a aprovação do Conselho de ética de pesquisa rede Universidade saúde. As amostras de cérebro humano foram coletadas como parte do banco de tecido cerebral marítima. No momento da coleta, foi obtido o consentimento de todos os pacientes.

1. construção de fotobranqueamento aparelhos e soluções

1. preparar Soluções conservadas em estoque.
   1. Preparar 1 L de 1 x solução de estoque salino Tris (1 x TBS) (150 mM NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 7,4) dissolvendo 8,77 g de NaCl e 6,06 g de Tris base em 800 mL de DDQ ₂ O e ajustar o pH para 7,4 usando HCl. Bring o volume de 1 L e autoclave. < / Li >
   2. preparar a azida de sódio 10% (estoque de x 200) pela dissolução de 1 g de azida de sódio em 10 mL de DDQ ₂ O (10%, estoque x 200).
2. Para 1-3 slides de tamanho padrão, use um prato de petri de simples 100 x 100 mm transparente, quadrado como uma câmara de slide. Para a câmara de um único slide, adicione 0,25 mL de 200 ações de azida de sódio x a 50 mL de 1 x TBS para fazer uma solução de azida-TBS de 0,05%. Pilha de 2-3 câmaras de slide verticalmente para processar slides adicionais. Preparar um adicional 50 mL de solução de azida-TBS para cada câmara.
3. Criar um andaime para elevar o slide chamber(s) tal que uma cabeça de lâmpada pode caber debaixo.
   1. Para um 100 mm x 100 mm slide câmara, cortar aberturas na parte inferior e os lados de uma 100 x 100 mm x 30 mm plástico prato de Papa e inverter o recipiente. Certifique-se de aberturas laterais são grandes o suficiente para caber uma fonte de luz LED e assegurar a abertura inferior é suficientemente grande tal que a luz da fonte de luz atinge a câmara de amostra sem impedimento.
   2. Aplicar fita isolante o andaime para aumentar a aderência entre o cadafalso e a câmara de amostra/bancada. Usar quaisquer materiais alternativos para construir o andaime enquanto ele firmemente eleva a câmara slide sem impedir a luz de atingir a amostra.
4. Remover qualquer difusores ou plástico opaco da lâmpada de mesa que pode impedir o diodo emissor de luz atinjam diretamente a amostra (se possível) e orientar a matriz de LED para cima. Coloque o andaime e slide chamber(s) acima da matriz de LED. Usar uma lâmpada com um pescoço flexível para fácil manipulação.
5. Construir uma cúpula reflexiva cobre para o aparelho, alinhando o interior de uma caixa grande o suficiente para cobrir a câmara de slide e o andaime com folha de alumínio. Use uma caixa de ponta de pipeta de 1 mL para uma única câmara ou uma 150 x 150 mm x 150 mm de papelão caixa para múltiplo, verticalmente empilhados câmaras.

2. Fotobranqueamento pré-tratamento de seções do tecido

Nota: preparação de secção do tecido pode variar dependendo da fonte de tecido e a fixação e a incorporação de métodos utilizados. Aqui, o tecido cerebral (orbitofrontal corticais) de um caso de FTLD-T foi fixado para ~ 2 dias em formalina, executado através de um gradiente de sacarose, incorporado na OCT e cortar a 10 µm de espessura seções usando um criostato.

1. Frio de º c em 4 um quarto, armário de frio ou frigorífico, orientar a lâmpada sob o andaime e coloque a câmara de amostra no cadafalso. Despeje a câmara de amostra 50 mL de solução de azida-TBS.
2. Submergir histologicos montagem em padrão de vidro corrediças do microscópio para a câmara de slide contendo azida-TBS usando pinça limpa. Para vários slides, certifique-se de que os slides são colocados na câmara em uma única camada.
3. Cobrir o aparelho com a cúpula reflexiva, acenda a lâmpada LED e incubar durante 48 h a 4 ° c.

3. Imunofluorescência

1. para manchar o tecido para tau fosforilada usando corante de contraste DAPI e Alexa 488 - e anticorpos secundarios conjugados a Texas Red, primeiro preparar soluções para a recuperação do antígeno, permeabilização, bloqueando e primária ligação de anticorpo.
   1. Preparar 500 mL de recuperação do antígeno do tampão (10 mM, ácido cítrico, 2mm ácido etilenodiaminotetracético, 0,05% Tween 20; pH 6.2) dissolvendo 0,92 g de ácido cítrico e 0,37 g de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em 500 mL de DDQ ₂ O. ajustar o pH 6.2 com NaOH e adicionar 0,25 mL de Tween 20.
   2. Preparar 500 mL de 0.025% Triton X-100 em solução TBS (TBS-Triton) adicionando 0,125 mL de Triton X-100 500 mL 1 x TBS
   3. Prepare uma solução de 1% albumina de soro bovino (BSA) em TBS (tampão de BSA-TBS) dissolvendo-se 0,1 g de BSA em 10 mL de TBS.
   4. Preparar uma solução de bloqueio pela adição de 0,2 mL de soro de cabra normal a 1,8 mL de 1% BSA/TBS
   5. Para cada slide, prepare 150 µ l de solução de anticorpo primário (diluição de 1: 100), pipetagem 1,5 μL de antifosfo-PHF-tau pSer202 + Thr205 (AT8) Anticorpo em 148,5 µ l de 1% de BSA-TBS buffer e deixar no gelo
2. Para executar a recuperação do antígeno, mergulhe os slides de foto verticalmente em um coletor de slide contendo 25 mL de tampão de recuperação de antígeno. Secure coletor com fita e/ou sequências de tal forma que o coletor não cair o banho de água. Aquecer o coletor em um banho de água a 90 ° c por 30 min e permitir que o coletor de arrefecer à temperatura ambiente por 30 min antes de remover os slides. Fazer não remove os slides imediatamente, pois isso fará com que as seções de dessecar.
3. Transferir as lâminas do coletor de recuperação de antígeno em um frasco de coloração preenchido com 30 mL de TBS-Triton e lavar as seções por 5 min em um agitador orbital com agitação suave. Repeti a lavagem uma vez com TBS-Triton fresco. Pavio fora buffer em excesso com um pano livre de fiapos e contorne o tecido com uma caneta hidrofóbica. Tome cuidado para não deixar os slides seque.
   1. Para cada slide, bloqueie o tecido por pipetagem 200 µ l de solução sobre o tecido de bloqueio e colocar o slide em uma câmara umidificada. Construa a câmara, colocando um porta-lâminas dentro de uma caixa de ponta de pipeta contendo uma toalha de papel molhada. Incube a temperatura ambiente por 2 h sobre uma superfície plana. Certifique-se de que a solução bloqueio cobre totalmente o tecido.
4. Remover a solução de bloqueio por aspiração e pipetar 100-150 µ l de solução de anticorpo primário sobre o tecido. Certifique-se de um volume suficiente de anticorpo está presente e que a seção é sobre uma superfície plana para evitar acúmulo de solução anticorpo para um lado. Incubar a 4 ° c durante a noite em uma câmara umidificada.
5. Preparar a mistura de anticorpo secundário e o corante de contraste nuclear DAPI.
   1. Para cada slide, preparar 150 µ l de mistura de anticorpo secundário (diluições de 1: 100) pela adição de 1,5 µ l de anti-rato de cabra Alexa 488 e 1,5 µ l de anti-rato cabra Vermelho Texas a µ l 147 de BSA-TBS e deixar no Ice.
   2. Preparar 0,1 µ g/mL DAPI counterstain por diluição serial. Homogeneizar a solução e diluir a 1 µ l de estoque 5 mg/mL DAPI em 999 de TBS tornar-se 1 mL de solução de 5 µ g/mL. Para cada slide, diluir 3 µL de 5 µ g/mL de solução com 147 µ l de TBS para uma concentração final de 0,1 µ g/mL.
      Cuidado: DAPI é um conhecido agente mutagénico e devem ser manuseado com cuidado.
6. Remover o anticorpo primário por aspiração. Mergulhe os slides em um vidro frasco contendo 30 mL de TBS-Triton e lavagem por 5 min com a mistura suave em um agitador orbital de coloração. Repita a etapa de lavagem com TBS-Triton fresco. Pavio fora excesso TBS-Triton e pipetar 100 a 150 µ l de mistura de anticorpo secundário para cada slide.
   1. Certifique-se o tecido é inteiramente coberta com a mistura de anticorpo. Incubar durante 2 h à temperatura na câmara umidificada no escuro.
7. Retire a mistura do anticorpo secundário por aspiração e transferir o slide em um vidro de coloração frasco contendo 30 mL de TBS (sem Triton). Lavagem por 5 min com a mistura suave em um agitador orbital. Repetir a etapa de lavagem com TBS fresca aplicar 100 a 150 µ l de 0,1 µ g/mL DAPI corante de contraste para cada slide e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.
8. Transferir os slides para um vidro de coloração jar contendo TBS e lavar 3 vezes com a mistura suave por 5 min cada, usando TBS fresco para cada lavagem. Embora buffer excesso de pavio.
9. Aplicar 3 gotas de meio de montagem aquoso para o tecido. Usando fórceps, baixe suavemente uma lamela de vidro limpo para o tecido, começando com uma borda e abaixando lentamente a outra borda para evitar armadilhas de bolhas de ar. Tome cuidado para não deslocar a lamela se imagem imediatamente. Caso contrário, permitir que o meio de montagem secar antes de guardar a 4 ° c no escuro.

4. Microscopia de fluorescência

1. vez a lâmpada da fluorescência, o microscópio e o computador e permitir que a lâmpada aquecer durante 15 min. lugar o tecido manchado desliza na fase de microscópio de fluorescência. Usar a imagem de campo claro para localizar o tecido na ampliação de 10x.
2. Aplique uma gota de DDQ ₂ O na superfície de lamela e usar uma lente de objetiva de imersão de água 20 x (at = 1.0). Selecione o exame 4-linha média avião configuração. Defina o tamanho do pinhole 1 unidade arejados que dá uma fatia óptica de ~ 3 mícrons. Selecione os laser da excitação e emissão de comprimentos de onda para cada fluoróforo em faixas separadas, para melhor sinal.
   Nota: Alexa 488: λ _ex = 488 nm (laser de argônio) λ _em = 493-570 nm; Texas Red: λ _ex = 561 nm (laser de DPSS 561 nm), λ _em = 601-635 nm; DAPI: λ _ex = 405 nm (laser de diodo 405), λ _em = 507-410 nm.
   1. Ajustar a potência do laser e configurações para otimizar a intensidade de sinal para cada faixa de ganho. Recolher a imagem composta e salvar. Usar as mesmas configurações do laser para comparar as intensidades de fluorescência em um slide diferente.
3. Para visualização da intensidade de fluorescência em cada canal, instalar a macro de ferramentas de perfil RGB para ImageJ ¹⁰. Salve a macro da página da Web como um arquivo de texto (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt). No menu do ImageJ, selecione Plugins - > Macros - > instalar; Selecione o arquivo de texto para instalar a ferramenta de perfis RGB.
   1. Abrir o arquivo de imagem confocal no ImageJ e converter as imagens compostas de 3 pilhas para RGB, executando o seguinte: imagem - > cor - > ferramenta de canal. Selecione " composto " do menu dropdown e cheque todos os três canais. Em seguida, selecione imagem - > tipo - > da cor do RGB.
   2. Selecione o ícone de ferramentas de perfil RGB e desenhe uma linha em toda a seção da imagem a ser perfilado. Salve os dados de intensidade como uma planilha para plotagem.

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Resultados

A etapa de pré-tratamento de fotobranqueamento pode ser adicionada a um protocolo padrão de imunofluorescência imediatamente antes da recuperação do antígeno e imunocoloração (figura 1A). A montagem do aparelho fotobranqueamento também pode ser realizada usando vários, componentes baratos, prontos para uso (figura 1B). O espectro de emissão de fósforo branco LEDs abrange uma ampla gama de comprimentos de onda que os t...

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Discussão

O fotobranqueamento pré-tratamento dos tecidos descrito neste manuscrito permite a eliminação eficaz de autofluorescência usando componentes prontos para uso. O protocolo descreve a imagem latente de imunofluorescência de agregados de tau fosforilada no tecido do cérebro humano fixada em formol usando anticorpos secundarios conjugados a Alexa 488 e vermelho Texas, com DAPI como um corante de contraste nuclear. Para aplicar o método para outros tecidos, recomendamos realizar um tratamento prévio de fotobranqueamen...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T6066
Sodium Choloride	Sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric Acid	Caledon Laboratory Chemicals	1506656
Sodium Azide	BioShop Canada	SAZ001
100 mm x 100 mm x 20 mm Pitri dish	Sarstedt	82.9923.422	All components of photobleacher can be substituted based on availability
6 W LED Dimmable Desk Lamp	DBPower	DS501	All components of photobleacher can be substituted based on availability
Citric Acid	Sigma-Aldrich	C-2404
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	BioShop Canada	EDT001
Tween 20	Sigma-Aldrich	P-7949
Sodium Hydroxide	BioShop Canada	SHY700.1
Water bath	Haake Fisons	K15
Slide collector	FisherScientific	12-587-17B
Staining Jar	FisherScientific	E94
Orbital Shaker	Bellco Glass	7744-08115
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T7878
Bovine Serum Albumin	FisherScientific	BP1600-1
Normal Goat Serum	Aurion	905.002
Hydrophobic pen	Sigma-Aldrich	Z672548-1EA
Phospho-Tau (Ser202, Thr205) Monoclonal Antibody (AT8)	ThermoFisher	MN1020
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Texas Red-X	ThermoFisher	T862
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-11029
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Mounting medium	ThermoScientific	28-600-42
Glass soverslip
Confocal Microscope	Zeiss	LSM710
Imaging software ZEN 2012 Black Edition 11.0	Zeiss	LSM710	Software accompanies the Confocal Microscope
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
RGB Profile Tools macro	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt
Commercial chemical quencher	Biotum	23007