Reversíveis induzida pelo resfriamento desativações para estudar Cortical contribuições para a memória do obstáculo o gato ambulante

Resumo

Complexa locomoção em ambientes naturalísticos que exigem coordenação cuidadosa dos membros envolve regiões do córtex parietal. O seguinte protocolo descreve o uso de desativação reversível induzida pelo resfriamento, para demonstrar o papel da área parietal 5 a evitar o obstáculo memória guiadas no gato ambulante.

Resumo

No terreno complexo, naturalista, informações sensoriais sobre um obstáculo ambiental podem ser usadas para ajustar rapidamente movimentos locomotoras por evasão. Por exemplo, o gato, informação visual sobre um obstáculo iminente pode modular pisando para vacância. De adaptação de locomoção também pode ocorrer independente da visão, como entradas tátil repentinas na perna por um obstáculo esperado podem modificar a revisão de todas as quatro pernas para vacância. Essa coordenação motora complexa envolve estruturas supra-espinhais, tais como o córtex parietal. Este protocolo descreve o uso de desativação cortical reversível, induzida pelo resfriamento para avaliar as contribuições do córtex parietal para locomoção orientada por memória obstáculo no gato. Pequenas loops de resfriamento, conhecidos como cryoloops, são o formato especial para desactivar discretas regiões de interesse para avaliar suas contribuições para um comportamento evidente. Tais métodos têm sido utilizados para elucidar o papel da área parietal 5 a evitar o obstáculo memória guiadas no gato.

Introdução

Em terreno irregular, naturalista, informações sensoriais sobre um obstáculo, que pode ser adquirido através de visão ou toque, rapidamente podem modificar a locomoção para vacância. Esta coordenação cuidadosa dos movimentos passo a passo envolve várias regiões corticais^1,2. Por exemplo, áreas do córtex motor^3,4 e córtex parietal^5,6,7 têm sido implicadas durante tarefas complexas de locomoção, como evitar obstáculos. Nos animais quadrúpedes, modulações de passo necessárias para evitar obstáculos devem estender com ambas as patas dianteiras e patas traseiras. Se avançar locomoção é adiada entre o afastamento de obstáculo foreleg e hindleg (que pode surgir como um animal Pisa cuidadosamente através de uma rapina stalking ambiente complexo e naturalista), informações sobre o obstáculo mantido na memória são usadas para guiar o hindleg pisando sobre o obstáculo caminhando uma vez currículos.

Técnicas experimentais vistas desativar áreas corticais discretas podem ser usadas para estudar corticais contribuições para locomoção orientada para a memória do obstáculo. Desativação cortical induzida pelo resfriamento fornece um reversível, confiáveis e reprodutíveis método avaliando corticais contribuições para um comportamento overt⁸. Cryoloops feitos de tubos de aço inoxidável são em forma de específica à área cortical de interesse, assegurando altamente seletiva e discreta desativação dos loci. Uma vez implantado, metanol refrigerado, bombeada através do lúmen de um cryoloop resfria a região do córtex diretamente abaixo do loop para < 20 ° C. Abaixo desta temperatura crítica, a transmissão sináptica é inibido na região do córtex diretamente abaixo do loop. Essa desativação pode ser revertida simplesmente por cessar o fluxo de metanol. Este método tem sido usado para estudar corticais contribuições para processamento sensorial e comportamentos^{9,10,11,12,13,14,15 , 16 , 17}, bem como o controle motor de movimentos sacádicos olho¹⁸ e guiada por memória obstáculo locomoção¹⁹.

O propósito do presente protocolo é usar reversíveis induzida pelo resfriamento desativações para avaliar o envolvimento das áreas corticais parietais para coordenação motora no gato. Especificamente, locomoção orientada por memória obstáculo foi examinada com ou sem o córtex parietal ativo. Utilizaram-se esses métodos com sucesso demonstrar o papel da área parietal 5 a evitar o obstáculo memória guiadas a pé gato¹⁹.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia do Conselho Nacional de pesquisa para o cuidado e o uso de animais de laboratório (oitava edição; 2011) e o Conselho canadense no cuidado Animal do guia para o cuidado e o uso de animais experimentais (1993) e foram aprovado pela Universidade de Western Ontario Animal uso subcomitê do Conselho Universitário no cuidado Animal.

O procedimento a seguir pode ser aplicado a experimentos estudando corticais contribuições para locomoção controle o gato ambulante.

1. os aparelhos

1. Construa o aparelho utilizado para avaliar a memória do obstáculo.
   Nota: O aparelho consiste em uma 2,43 m comprimento, 29 cm ampla passarela cercada por paredes de acrílico transparente elevado de 18 cm (Figura 1). Um entalhe estreito no meio do aparelho permite um obstáculo grosso 25,8 cm largura x 3mm ser Erguido para ou retirado da passarela usando uma alavanca montada debaixo da superfície ambulante.
2. Para garantir que a atenção do animal é mantida em comer, evite usar a mão para levantar ou abaixar o obstáculo. Em vez disso, o obstáculo pode ser levantado ou abaixada usando a perna do experimentador para mover a alavanca embaixo da passarela, permitindo que o experimentador continuar alimentando o animal.
3. Manter adequadamente o sistema de alavanca para assegurar que o obstáculo pode ser levantado ou abaixado silenciosamente.
4. Usar uma plataforma elevada pequena (23 cm comprimento x 23cm largura x 16 cm de altura) em cima de qual comida macia é colocada, para orientar os movimentos do animal.
5. Grave todas as experimentações usando uma câmera de ethernet (54 quadros/s) montada sobre um tripé de 1,85 m longe da linha mediana da passarela.

2. formação procedimentos

Nota: Para aquisição de dados bem-sucedida, um período de formação anterior teste comportamental assegura que cada animal é adequadamente aclimatado para sala de testes e o aparelho. Exposição repetida a um ambiente de romance auxiliará na redução surpreendentes ou outros comportamentos estressantes.  Aclimatação pode variar entre animais e pode exigir 1-2 meses de treinamento. Sessões de aclimatação inicial podem ser até 5 min. de comprimento, dependendo do foco e a motivação do animal para comer. Sessões subsequentes devem procurar aumentar a duração de tempo que o animal está motivado para trabalhar (tipicamente em torno de 20-25 min).

1. Adquirir maduro (> 6 meses de idade) gatos domésticos cabelo curto de um criador de laboratório comercial de qualquer peso ou sexo.
   Nota: Motivação para trabalhar por comida e uma disposição cooperativa abrangem os critérios de seleção, ao considerar que os animais devem ser incluídos no estudo.
2. Aclimate cada animal a usar um cinto de segurança ao qual está anexada a uma trela de 1m. Ancore a trela para uma prateleira acima da passarela sobre o ponto médio do passeio.
   Nota: Isto permite que o animal a andar ao longo da porção central do aparelho sem qualquer tensão, encorajando assim o animal a permanecer dentro esta parte do aparelho. Estabelecer tais limites é útil para trabalhar com um assunto de teste em movimento.
3. Coloque o animal para a passarela, permitindo-lhe comer da plataforma sobre a qual comida macia é colocada.
   Nota: Um dos objectivos deste treinamento inicial é garantir que o animal segue prontamente a plataforma de comida quando mudou-se para a frente e pode caminhar confortavelmente com o arnês e a trela. O uso de alimentos macios como reforço positivo estimula o animal a ficar concentrado ao longo de cada sessão de treinamento ou teste e promove um ambiente de trabalho confortável.
4. Verifique se o animal está confortável com a manipulação, incluindo as instâncias onde o animal deve ser movido para a área de início da passarela.

3. comportamentais de treinamento e teste de protocolo

Nota: A memória do obstáculo é avaliada em dois paradigmas: uma tarefa de memória de obstáculo visualmente-dependente e uma tarefa de memória tátil-dependente do obstáculo. Ambos os paradigmas devem ser utilizadas durante a formação inicial e testes subsequentes.

1. Memória de obstáculo visual
   1. Para avaliar a memória do obstáculo visual, elevar o obstáculo para a passagem (Figura 2A). Coloque a plataforma do outro lado do obstáculo. Coloque o animal na área de início da passarela.
   2. Permitir que o animal se aproximar da comida, pisando sobre o obstáculo com apenas suas patas dianteiras para comer da plataforma.
   3. Como o animal continua a comer, reduzir o obstáculo tal que torna-se nivelado com a passarela para evitar quaisquer entradas mais visuais ou tátil.
   4. Após um período de atraso variável, mover a comida para a frente novamente para incentivar o animal para retomar a andar; Este atraso pode ser menor que 1 s a mais de 2 min.
   5. Importante, realize ensaios onde o obstáculo está ausente para evitar habituação ao obstáculo e o desenvolvimento de uma resposta de evitação aprendeu. Em tais visuais obstáculo-ausência de ensaios, certifique-se de que o obstáculo não é gerado para a passarela antes de colocar o animal na área de início da passarela.
   6. Observe hindleg pisando em obstáculo-presente e na ausência de obstáculo ensaios para verificar comportamentos típicos de locomoção e memória intacta obstáculo visual antes da refrigeração. Certifique-se que o animal pode limpar o obstáculo sem contato, e essa coisa de passos de todas as quatro pernas é significativamente elevada em ensaios de obstáculo-presente.
      Nota: Assistir vídeos de ensaios de formação pode ser úteis para essa verificação.
2. Memória tátil obstáculo
   1. Para avaliar a memória tátil obstáculo, certifique-se de que o obstáculo não é gerado para a passarela antes de colocar o animal na área de início da passarela (Figura 2B).
   2. Permitir que o animal vá até a plataforma de alimentos colocada no lado distante do slot obstáculo.
   3. Como o animal come, elevar o obstáculo para a passarela sob o prato de comida, impedindo qualquer entrada visual do obstáculo.
   4. Como o alimento é movido para a frente, observe o animal deverá contactar o obstáculo com suas patas dianteiras antes de pisar sobre ele.
   5. Permitir que o animal a continuar comendo enquanto escarranchando o obstáculo entre a sua frente - e patas traseiras. Durante este tempo, diminuir o obstáculo para que torna-se nivelado com a passarela para evitar quaisquer entradas mais visuais ou tátil.
   6. Após um período de atraso variável, mova a comida para a frente mais uma vez, para incentivar o animal para continuar andando.
   7. Importante, realizar ensaios onde o obstáculo está ausente e sem contato foreleg ocorre para evitar habituação ao obstáculo e o desenvolvimento de uma resposta de evitação aprendeu.
      1. Nestes tátil obstáculo-ausência de ensaios, tem a abordagem de animais e comer da plataforma de alimentos, conforme descrito na etapa 3.2.1. No entanto, levantar e abaixar o obstáculo (passo 3.2.2) antes de mover a comida para a frente na etapa 3.2.3. Certifique-se que um período de atraso semelhante, onde o animal é permitido continuar comendo (etapa 3.2.4) precede a continuação final de locomoção (passo 3.2.5).
   8. Observe o hindleg pisando nos julgamentos de obstáculo-presente e na ausência de obstáculo para verificar a memória intacta obstáculo visual antes da refrigeração e comportamentos de locomoção normais.

4. vídeo análises

Nota: Para avaliar a memória do obstáculo, análises durante a formação inicial e testes subsequentes após a implantação do circuito de refrigeração envolvem quantificar a altura passo, passo de afastamento e a distância horizontal entre o dedão e obstáculo no pico de cada etapa para visuais e tátil paradigmas (Figura 2).

1. Analise os vídeos usando a escrita de scripts personalizados.
2. Para todas as pistas de julgamento, cada pé, marcando a posição dos dedos do pé mais próximo da câmera ao longo de cada etapa.
3. Medir a altura de passo de pico como a distância perpendicular entre o dedo e a superfície da passarela ao ponto mais alto em cada trajetória de passo (Figura 2).
4. Nos julgamentos de obstáculo-presente, medir a folga passo como a altura de passo diretamente acima do obstáculo slot subtraído pela altura do obstáculo.
5. Além disso, medir a distância horizontal entre o dedão e o obstáculo no pico de cada etapa nos julgamentos de obstáculo-presente.
6. Confirme que os recursos de memória do obstáculo estão intactos antes da implantação de circuito refrigerando, verificando-se que a altura de passo do pico é elevada em julgamentos em comparação com pisando nos julgamentos de obstáculo-ausência de obstáculo-presente.

5. Loop (Cryoloop) implantação de arrefecimento

1. Implante cryoloops bilateralmente sobre áreas 5 e 7, de acordo com procedimentos cirúrgicos anteriormente relatados⁸ (Figura 3).
2. Em resumo, para cada hemisfério, execute uma craniotomia e durotomy de Horsley-Clarke coordenadas²⁰ A15 A25 para expor a junção dos sulcos ansate e laterais.
3. Posição individual de arrefecimento loops em forma de calibre 23 inox tubos hipodérmicas com o laço em contato direto com a superfície cortical da área parietal, 5 ou 7.
4. Fixe a base de cada cryoloop no crânio com acrílico dental ancorado para os parafusos de aço inoxidável.
5. Fechar as craniotomias com acrílico dentário adicional; elaborar as margens de pele até as bordas de acrílico e sutura juntos.

6. cortical protocolo de refrigeração

1. Instalação experimental
   Nota: Antes de trazer o animal para a sala de testes, o circuito de refrigeração é preparado e testado. O circuito de refrigeração é composto por um reservatório de metanol com um tubo de admissão (3,2 Diâmetro mm, 1,6 mm ID), uma bomba de pistão reciprocating e banho de gelo seco, conectado via tubulação de politetrafluoroetileno (1,6 diâmetro mm, 0.5 mm-carteira de identidade; A Figura 4). Além disso, um termômetro digital é necessário.
   1. Adicione 500 cc gelo para 200 mL de metanol no banho de gelo. Extremidades do tubo ajuste confortavelmente sobre a entrada e saída de um manequim cryoloop para completar o circuito de refrigeração.
   2. Anexe a ficha de termopar para um termômetro digital para temperatura contínua de monitoramento usando um cabo composto de dois conectores termopar masculino e um fio termopar. Certifique-se de que o comprimento deste cabo é suficiente para atingir a cabeça do animal, quando uma extremidade é plugada o termômetro.
   3. Ligue a bomba de pistão usando o interruptor.
      Nota: Metanol deve ser elaborada no reservatório de, passado através da bomba para o banho de gelo seco, onde o metanol fluxo na tubulação será refrigerado para-75 º C. O metanol refrigerado então sair do banho de gelo e atravessam o cryoloop anexado antes de retornar para o reservatório de metanol.
   4. Certifique-se de que a configuração da bomba, comprimento da tubagem dentro do banho de gelo e comprimento do tubo do banho de gelo para o manequim loops são ideais, tal que a temperatura de manequim cryoloop pode chegar a um estado estacionário de-5,00 ° C.
      Nota: A tais temperaturas alcançadas durante esta configuração inicial geralmente são suficientes para alcançar temperaturas de teste de 3,0 ± 1,0 ° C, quando o mesmo sistema é usado para refrigerar uma cryoloop implantado. Dificuldade em alcançar o resfriamento suficiente pode ser resolvida ajustando a velocidade da bomba, aumentar o comprimento de tubulação submersa dentro do banho de gelo, e/ou minimizar o comprimento do tubo do banho de gelo para o cryoloop.
   5. Se necessário, alongar uma seção de tubulação rosqueando a extremidade do tubo através de um encaixe de extremidade do tubo e flange da extremidade do tubo com uma ferramenta para moldar flanges. Anexe tubos de comprimento desejado com uma extremidade flangeada da mesma forma, usando um conector.
   6. Verifique se todas as conexões são confortáveis e sem vazamentos estão presentes. Uma vez satisfeito com a configuração inicial, desligue a bomba e remover o manequim cryoloop; o circuito está agora preparado para um animal de teste.
2. Testes comportamentais
   1. Coloque o animal em cima da aparelho de teste. Deslize o arnês sobre a cabeça e prenda a cinta snuggly em torno do animal. Anexe a trela.
   2. Retire a tampa protetora do cryoloop implantado para expor os tubos de entrada e saída. Ajuste de extremidades de tubos confortavelmente sobre os tubos de entrada e saída da cryoloop. Conecte o plugue de termopar para o termómetro digital.
   3. Iniciar a sessão de testes com um visual (passo 3.1) ou tátil (passo 3.2) obstáculo memória experimental. Siga com ensaios adicionais de todos os quatro tipos (visual obstáculo-presente, visual obstáculo-ausente, tátil obstáculo-presente, tátil obstáculo-ausente) de uma forma aleatória.
      Nota: Uma sessão de teste típica consiste em um bloco 'quente' de ensaios, onde evitar obstáculos orientada por memória é observada na ausência de refrigeração para estabelecer medidas de linha de base.
   4. Ligar a bomba de pistão e esperar que o cryoloop chegar a uma temperatura de 3,0 ± 1,0 ° C (1-2 min). Em seguida, execute um bloco de 'cool' de ensaios após a bomba de pistão foi ligada. Durante esse bloco de ensaios, se necessário, avalie as contribuições da área de refrigeração para memória-guiado. Certifique-se de que a temperatura da cryoloop é mantida em 3,0 ± 1,0 ° C ao longo de todo o bloco.
      Nota: Todos os quatro tipos de julgamento devem ser intercalados aleatoriamente em todo o bloco.
   5. Executar um bloco de 'Reaqueça' final dos ensaios, após ter sido desligada a bomba de pistão, e o cryoloop está de volta à sua temperatura original.
      Nota: Comportamento de piso da linha de base é restabelecido durante este bloco. Novamente, todos os quatro tipos de julgamento devem ser intercalados aleatoriamente em todo o bloco.
3. Limpar
   1. Quando concluíram-se a testes comportamentais, remova o tubo de tubos de entrada e saída. Ser consciente de metanol residual que pode pingar as extremidades do tubo e pode irritar o animal.
   2. Certifique-se de que a tampa de protecção é substituída. Remova a coleira e chicote de fios antes de devolver o animal para a colônia. Apare as pontas de tubo (3-4 mm) usando um cortador de tubos para evitar conexões com vazamento no dia seguinte teste.

7. verificar o grau de resfriamento

1. No final dos testes comportamentais, confirme que a extensão da desativação é restrita à região do córtex diretamente abaixo de cada cryoloop usando técnicas relatado anteriormente⁸.
   Nota: Isso pode ser verificado com mapeamento de termoclina¹² ou com uma térmica de imagens câmera^13,14,19.

Resultados

Este protocolo com êxito serviu para analisar as contribuições do córtex parietal para a memória obstáculo o pé gato¹⁹. Neste estudo, cryoloops foram implantados bilateralmente sobre parietais áreas 5 e 7 em três adultos (> 6 meses de idade) mulheres gatas (Figura 5A). Os animais foram avaliados no paradigma da memória tátil obstáculo, na ausência de refrigeração (morna, condição de controle), ou quando a área 5 ou 7 ...

Discussão

O paradigma descrito emprega desativações induzida pelo resfriamento das áreas corticais discretas usando o cryoloop para estudar a locomoção orientada por memória obstáculo no gato. Os paradigmas de memória visual e tátil obstáculo são bastante simples para animais executar como eles exploram naturalistas locomotoras comportamentos que ocorrem com o mínimo esforço, quando um animal está motivado a seguir a uma fonte de alimento em movimento. Assim, a maioria do período de formação é dedicada para aclim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	IDS Imaging Development Systems GmbH	Model: UI-5240CP-C-HQ
Intake tubing	Restek	25306	Unflanged end is submerged in the methanol reservoir while the flanged end is connected to the pump
Pump	Fluid Metering, Inc.	Model: QG 150
Nalgene Dewar vacuum flask	Sigma-Aldrich	F9401
Teflon tubing	Ezkem	A051754
Microprobe thermometer	Physitemp	Model: BAT-12
Flanged tube end fittings	Valco Instruments Co. Inc.	CF-1BK	Assorted colours available for colour coding. Packages include the same number of washers as fittings
Washers	Valco Instruments Co. Inc.	CF-W1	Extra washers
Flanging kit	Pro Liquid GmbH	201553
Tubing connector	Restek	25323
Tubing cutter	Restek	25069
Male thermocouple connector	Omega	SMPW-T-M	Used to make cable connection to thermometer
Thermocouple wire	Omega	PP-T-24S	Used to make cable connection to thermometer
MATLAB	MathWorks	n/a