Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

Resumo

Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.

Resumo

Este vídeo irá guiá-lo através do processo de geração de culturas cortical neuronal de embriões tarde e cérebro de camundongos pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados ​​para uma variedade de aplicações, incluindo imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, imageamento de cálcio e sódio, proteína e / ou RNA isolamento. Estas culturas também fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética tarde embrionárias ou pós-natal letal. O procedimento é relativamente simples, requer alguma experiência na técnica de cultura de tecidos e não deve demorar mais do que 2-3 horas, se você estiver devidamente preparado. Uma separação cuidadosa da casca cortical do trato fibras tálamo-cortical vai reduzir o número de gravidezes indesejadas células não-neuronais. Para aumentar a produção de células neuronais triturar os pedaços do tecido cortical delicadamente após a etapa de incubação enzimática. Isto é imperativo, uma vez que evita lesões desnecessárias para as células e prematura morte celular neuronal. Uma vez que estas culturas são mantidos na ausência de células alimentadoras glia, eles também oferecem uma vantagem adicional de culturas em crescimento enriquecido em neurônios.

Protocolo

Preparações antes do dia da cultura:

• Preparar a solução de dissecação estéril (DS).
• Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal com suplementos B27).
• Autoclave DDH ₂ O e esterilizar coversilps vidro, se necessário.
• Brasão pratos de cultura de tecidos ou lamínulas de vidro com poli-D-lisina.

Poli-D-lisina Revestimento:

Prepare um dia antes de cultivo em condições estéreis.

• Alíquota de descongelar PDL 10X e colocar no gelo.
• Adicionar 9 ml de água ultra-filtrado estéril para 1 ml de PDL e misture bem (1X).
• Revestimento com superfícies 1X PDL durante a noite a temperatura ambiente da seguinte forma:
  • lamínulas de vidro (Bellco Cat Glass, Inc. # 1943-00012.): 75 mL / lamela
    OR
  • 24 placa de cultura bem: 300 l / poço
    OR
  • 35 milímetros placa de cultura: 1ml/dish
• Enxágüe com água estéril 5X (use pipetas Pasteur estéril para aspirar líquido).
• Remover a água até a superfície está completamente seca.

Procedimento de cultivo (feito em capela de fluxo laminar em condições estéreis)

1. Cortar bloco de agar e cola-lo para o bloco de apoio do Vibraslicer micrótomo (Campden Instruments Ltd.), utilizando cola super.
2. Ao usar fase embrionária tardia (E17-18) fetos de rato, barragem eutanásia, retirada do útero e livre fetos individuais de saco embrionário. Fetos colocar em placa de Petri estéril e continuar como descrito abaixo.
3. Decapitar feto de rato ou cachorro (siga as orientações aprovadas pelo seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso).
4. Retire a pele e crânio e do cérebro lugar em papel de filtro Whatman disco numa placa de Petri 60 milímetros cheio de DS frio.
5. Cortar o cerebelo usando uma lâmina estéril.
6. Pick up cérebro usando uma espátula e drenar o excesso de fluido em papel de filtro, em seguida, transferir cérebro para Vibraslicer bloco de apoio e cole no lugar do cérebro (lado caudal acima e parte ventral de frente para agar).
7. Encher a câmara com o DS frio. Seletor de velocidade para 8-9.
8. Corte 200-400 seções M, a partir do bulbo olfativo. Uma vez que a lâmina da Vibraslicer entra no córtex, começar a cortar 600μm cortes coronais. Um cérebro E17-18 do mouse normalmente produz 3-4 fatias utilizável, enquanto que um cérebro de camundongo P0 rendimentos 4-5 fatias utilizável.
9. Transferência de fatias do cérebro a 35 milímetros prato petri rotulados DS 2 com fim de reverter un-conectado 10 ml de vidro pipeta Pasteur.
10. Dissecar córtex e remover meninges utilizando agulhas de vidro retirado tubos capilares.
11. Cortar cascas cortical em pequenos pedaços, 0,5-1 mm de comprimento.
12. Filtro ES através de filtro de 0,2 mm acoplada a uma seringa cc 5 em uma placa de Petri 35 mm.
13. Transferir os pedaços de tecido cortical para placa de Petri contendo ES filtrada.
14. Incubar a 37 ° C por 30 min.

Nesse meio tempo:

1. Limpar Vibraslicer capô, e ferramentas de dissecação.
2. Adicionar 5 ml de NBM/B27 quente em uma placa de Petri 60 mm.

Depois de 30 min. de incubação:

1. Transferência de tecido para 10 ml DS. Vamos se contentar com 1 min.
2. Transferência de tecido para redemoinhos primeiro tubo Hi e deixar assentar por 2-3 min.
3. Transferência para Hi segundo. Repita como indicado acima.
4. Transferência para Li em primeiro lugar. Repita como indicado acima.
5. Li transferência para segundo. Repita como indicado acima.
6. Li transferência para terceiros. Repita como indicado acima.
7. Transferência de tecido para o prato com 60 milímetros de mídia.

Sob o microscópio de dissecção:

1. Restos de tecido limpo e triturar cada peça suavemente passa através de uma pipeta de vidro puxado (use a diminuir tamanhos de furo) para soltar o tecido.
2. Transferência de suspensão de células a 15 ml tubo cônico contendo o resto da NBM + B27 (Adicione um total de 13 ml para uma placa de 24 poços ou 11 ml por 5 - 35. Pratos milímetros Misture suavemente e espere grandes pedaços de tecido para resolver).
3. Suspensão de transferência de células (0,5 ml / poço de uma placa de 24 poços ou 2 ml / 35 placa de cultura mm).
4. Ao usar lamínulas de vidro, adicionar 80 mL de suspensão celular por lamínula e permitir uma hr em cultura de tecidos incubadora para as células a aderirem antes de inundar a câmara com mais NBM/B27 mídia.
5. Manter culturas a 37 ° C e 5% CO _2.

Dia Seguinte

24 placa assim: Alimente-se bem com 0,5 de células não-neuronais ml condicionado NBM/B27 médio (cNBM/B27; Protocolo para a preparação de cNBM/B27 médio aparece abaixo)

Pratos 35mm: Substitua 0,5 ml com cNBM/B27 médio.

Manter a cultura através da substituição de 0,5 ml de meio com cNBM/B27 novo a cada 2-3 dias.

Embora os meios de cultura não promove a proliferação de células glia, as culturas podem ser tratados com 5m FDU (5 Fluoro-2'-deoxiuridina, Sigma F0503) no dia 05/03 na cultura para reduzir ainda mais o número de células gliais, se necessário.

SET -SE para dissecção e Cultura

Esterilizar instrumentos de dissecação em EtOH 70% ou autoclave eles:

• Tesoura (empresas de médio e pequeno) Espátulas (empresas de médio e pequeno)
• Pinças lâmina de barbear (empresas de médio e pequeno)
• Lâmina para vibraslicer banho de tampão
• Cunha metálica para suporte de lâmina para o cérebro

Outros materiais:

• Placas de Petri (60 mm)
• Placas de Petri (35 mm)
• Papel-filtro
• Pipeta de vidro de 10 ml
• Pipetas estéreis descartáveis, 5,10 e 25 ml
• Seringa filtro, 0,2 m
• Seringa de 5 cc
• Tubos de centrífuga, 15 ml
• Estéril Pasteur de vidro pipetas
• PDL revestido placas de cultura ou de lamínulas de vidro

Rótulo seis tubos de centrífuga de 15 ml e siga preparação:

Tubo # 1: solução enzimática:

Adicionar 50 U de papaína (Worthington LS 03126) a 5 DS ml contendo:

• 100μl de L-cisteína (0,8 mg)
• 7 mL NaOH 0,1 N
• 50 APV mL (5mm)

Deixar solução em temperatura ambiente para limpar. Note-se que solução enzimática aparecerá "nublado" em primeiro lugar e precisa clara antes de usar.

Tubo # 2 e # 3: Hi inibidor da enzima:

3 ml + 300 ml DS BSA / Ti + 30 mL APV (5mm).

Misture com cuidado para evitar bolhas, em seguida, dividir em duas alíquotas de 1,5 ml.

Tubo # 4 - # 6: inibidor da enzima Low:

8 ml DS + 80 mL BSA / Ti + 80 mL APV (5mm).

Misture com cuidado para evitar bolhas, divida em três alíquotas de 2,6 ml.

Colocar os tubos numerados # 2 a # 6 em gelo. Deixe tubo # 1 (solução enzimática) em temperatura ambiente.

SOLUÇÕES e alíquotas

• Uma solução (Buffered Saline) Sigma Formula wt 500 ml [conc.]
• Cloreto de Sódio NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm
• Cloreto de potássio KCl P-4504 74,56 4,0 G 5.4mm
• Fosfato de sódio dibásico anidro Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0,24 g 0.17mm
• Potássio fosfato monobásico anidro KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0,3 g 0,22 mm

Pesar todos os ingredientes e misture até dissolver com 400 ml de água ultra-filtrada. Trazer um volume final de 500 ml. Coloque em uma garrafa limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C e etiqueta "Solução DS A".

• Solução B (Hepes) Sigma Formula wt 250 ml [conc.]
• Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm

Adicionar ultra-água filtrada até 200 ml. Misture até dissolver e trazer um volume final de 250 ml. Coloque em uma garrafa limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C e etiqueta "Solução DS B".

• Solução de trabalho 500 ml [conc.]
• Ultra água filtrada 400 ml
• A solução estoque de 25 ml
• Solução estoque B 14 ml
• D (+) glicose-Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
• Sacarose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM

Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N. Trazer um volume final de 500 ml com água filtrada ultra. Decantar dentro de uma garrafa de vidro limpa e autoclave. Armazenar a 4 ° C. "Solução Dissecando" rótulo.

Poli-D-lisina de preparação:

1. Preparar a solução estoque 10x de poli-D-lisina (PDL; Sigma P-7280), em H ₂ O estéril em 1mg/ml.
2. Faça alíquotas 1,0 ml. Esta solução pode ser armazenada a -20 ° C por até 3 meses.

MÍDIA

1. Adicionar 10ml de B-27 Suplemento (Gibco 17504-044) para frasco de 500 ml NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049).
2. Fazer 40 ml alíquotas e armazenar a 4 ° C.

APV

1. Adicionar 10 ml H ₂ O estéril para o frasco de 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic ácido, Sigma A-5282) e misture bem.
2. Prepare 180 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.

BSA / Ti

1. Dissolver 1 g BSA (albumina bovina. Sigma A-7030) e 1 g inibidor de tripsina (Sigma T-9253) em 10 ml DS.
2. Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1N.
3. Esterilizar por filtração através de filtro de seringa de 0,2 mM.
4. Dividem-se em 400 mL alíquotas e armazenar a -20 ° C.

L-cisteína

Em um tubo Eppendorf dissolver 0,6 mg L-Cisteína (Sigma C-7755) em 200 mL DS.

AGAR (4%)

1. Dissolver 4 g de Agar Bacto (Difco 0140-01) em 100 ml de água estéril. Manter a 4 ° C até ser necessário para a cultura.
2. Agar microondas para derreter e encher um 35 milímetros placa de Petri. Vamos sentar para esfriar e polimerizar.

Papaína (Worthington LS 03126)

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GARRAFA DE REVESTIMENTO DE CULTURA (4 garrafas Nunc)

1. Adicionar 9 ml de água estéril para cada um dos três tubos de PDL 10X fazer PDL 1X.
2. Transferência de 30 ml 1X PDL na primeira garrafa.
3. Mover-se ligeiramente até que todas as superfícies de crescimento são cobertos. Deixe descansar por 1 min.
4. Transferência 1x PDL a segunda garrafa. Deixe descansar por 1 min.
5. Repita com as garrafas de terceira e quarta.
6. Lave bem todas as quatro garrafas 2X com 150 ml estéril H ₂ O.

PREPARE solução enzimática (ES):

1. Em um tubo de 0,6 ml de peso centrífuga para fora 0,8 mg L-Cisteína (Sigma C7755), adicione 150ml DS e vortex até que os cristais são dissolvidos.
2. Transferir 5 ml DS a um tubo cônico de 15 ml, em seguida, adicione 150ml L-Cisteína.
3. Adicionar 50 unidades de papaína. (Worthington LS 03126)
4. Adicionar 7ml 0.1N NaOH.

PREPARE MEM (GIBCO # 11090-081)

1. Retire 65 ml da garrafa MEM 500 ml. Economize 10 ml para preparar glicose.
2. Adicionar 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
3. Adicionar 10 ml de glicose 1M (Sigma G-8270) (1,8 ml g / 10 MEM)
4. Adicionar 50 ml de soro fetal bovino (Gibco # 16140-071) ou bovina Calf Serum (Omega BC-04).
5. Misture bem alíquota, e armazenar a 4 ° C.

SUPLEMENTO MEDIUM/B-27 NEUROBASAL (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049); B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044)

1. Adicionar todo o conteúdo do frasco B-27 para a garrafa NBM e misturar.
2. Alíquotas e armazenar a 4 ° C.

DISSECTION do tecido cerebral

1. Seca dissecar ferramentas de EtOH 70% antes da dissecção.
2. Transfira 10 ml DS em cada um tubo de 15/03 ml.
3. Selecione filhotes mouse (P0 - P3), você precisará de três cérebros para 4 garrafas.
4. Adicionar DS fria a 35 milímetros prato de petri.
5. Decapitar rato filhote e dissecar o cérebro.
6. Cérebros colocar na placa de petri contendo DS frio.
7. Pique em pedaços de tecido, pequeno o suficiente para passar através de uma pipeta de vidro.

ENZIMA DISSOCIAÇÃO

1. Remover o DS tanto quanto possível, a partir do prato com uma pipeta Pasteur.
2. Filtro ES através de uma seringa 0,2 m de filtro e 5cc.
3. Lugar ES no prato com o tecido.
4. Incubar tecido a 37 ° C incubadora (CO ₂ livre) por 30 min.

LAVAGEM DE TECIDOS

1. Tecidos de transferência com pipeta de vidro para o tubo DS primeiro, certificando-se de obter o ES mínimo possível.
2. Centrifugar por 30 segundos a 1500 rpm.
3. Transferência de tecidos e repetir o procedimento mais duas vezes.

TRITURAÇÃO

1. Coloque 38 ml de MEM / FBS em um tubo de centrífuga de 50ml
2. Adicionar 3 ml de MEM / FBS a um prato de 35 mm e tecido transferir para esta placa de Petri.
3. Dissociar o tecido suavemente triturando-lo através de uma ponta de pipeta 1000μl eppendorf.
4. Transferência de suspensão de células para o tubo contendo 38ml de MEM / FBS e misture bem.

PLATING

1. Suportar a cultura garrafas em posição vertical para obter a mesma quantidade de suspensão de células e meios de comunicação em cada garrafa.
2. Coloque 90 ml de MEM / FBS em cada frasco de cultura.
3. Adicionar 10 ml de suspensão de células em cada garrafa.
4. Label: Non-Neuronal, iniciais e data. Incubar a 37 ° C e 5% CO _2.

ALIMENTAÇÃO

1. No dia 3 ou 4, as células de alimentação com MEM quente / FBS (decantar todos os meios de comunicação e substituí-la por 100 ml de MEM / FBS). Culturas pode levar 7-10 dias para se tornar confluentes.
2. No dia 10/07 alterar a mídia para NBM/B27.
3. No dia seguinte, recolher os meios de comunicação. Filtro com 0.22μm
4. Faça alíquotas de 40 ml e alimentar a cultura com MEM / FBS.
5. Próximos 2 ou 3 dias, a mudança de mídia para NBM/B27
6. No dia seguinte, coletar e repita o procedimento.
7. Mantenha coleta de mídia para aprox. Duas semanas.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!