Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

Resumo

Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.

Resumo

Ultra-sonografia de alta frequência (HFUS) é um método comum de forma não-invasiva, monitorar em tempo real desenvolvimento do feto humano no útero. O mouse é usado rotineiramente como um modelo in vivo para estudar a implantação do embrião e progressão da gravidez. Infelizmente, tais estudos murino exigem a interrupção da gravidez para permitir o acompanhamento análise fenotípica. Para resolver esse problema, usamos a reconstrução tridimensional (3D), de HFUS imagens, para a detecção precoce e caracterização de locais de implantação do embrião murino e sua progressão no desenvolvimento individual no utero. Combinando HFUS imagem com reconstrução 3D e modelagem, fomos capazes de precisão quantificar o número de local de implantação de embriões, bem como monitorar a progressão do desenvolvimento em ratos grávidas C57BL6J/129S de 5,5 dias pós coito (d.p.c) através de 9,5 d.p.c com o uso de um transdutor. Medições incluídas: número, localização e volume de locais de implantação, bem como espaçamento inter implantação local; viabilidade do embrião foi avaliada pelo monitoramento da atividade cardíaca. O período pós-implantação imediato (5,5 a 8,5 d.p.c), reconstrução 3D do útero gravid em malha e sobreposição sólida formato habilitado uma representação visual das gravidezes em desenvolvimento dentro de cada corno uterino. Como os ratos geneticamente modificados continuam a ser usados para caracterizar fenótipos reprodutivos femininos, derivados de disfunção uterina, este método oferece uma nova abordagem para detectar, quantificar e caracterizar mais cedo implantação eventos na vivo. Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. Aqui usamos um formato de vídeo e texto para descrever como executar com sucesso ultra-sonografias de gravidez precoce de murino para gerar dados confiáveis e reprodutíveis, com reconstrução da forma uterina em malha e imagens 3D sólidas.

Introdução

Perda de gravidez precoce recorrente é uma das complicações mais comuns após a concepção e afeta aproximadamente 1% dos casais que tentam engravidar^1,2. Os mecanismos subjacentes de perda de gravidez precoce são variados: de anormalidades embrionárias intrínsecas e comorbidades maternas para defeitos na receptividade endometrial^1,3,4. Por causa de sua rastreabilidade genética, modelos do rato têm sido amplamente utilizados para investigações de implantação do embrião precoce e gravidez. Além disso, o curto tempo gestacional de mouse e a capacidade de realizar estudos em grande escala têm garantido o utilitário crescente do rato em abordar questões-chave clínicos em medicina reprodutiva humana⁵. Dito isto, a grande maioria dos projetos experimentais murino exige ainda numerosas barragens para ser sacrificado em dias gestacional sequenciais para quantificar e analisar os padrões de espaçamento, número, tamanho e localização do local de implantação durante a gravidez^{6, 7,8}, impedindo, assim, estudos longitudinais do mesmo animal.

Na clínica, o ultra-som é uma ferramenta confiável e de valor inestimável para monitorar viabilidade fetal humana e desenvolvimento em uma forma não-invasiva^9,10,11. Mais recentemente, ultra-som de alta frequência (HFUS) começou a encontrar aplicações limitadas no mouse, como um método para monitoramento da viabilidade fetal e crescimento durante gravidez^12,13,14. Os recentes avanços tecnológicos em ultra-sonografia permitiram a aplicação de dados (3D) tridimensionais para reconstrução visual de órgãos animais e posterior acompanhamento de patologias^{15,16, 17}. Utilização desta tecnologia de imagem avançada melhorou acentuadamente o poder de detectar flutuações de menor volume, para reduzir a variabilidade de animal para animal e para monitorar a progressão de uma patologia ou a eficácia de uma intervenção terapêutica¹⁷. Enquanto o utilitário principal desta tecnologia tem sido monitorar a progressão da malignidade em oncomouse modelos^15,16, imagens 3D de HFUS só recentemente tem sido usada para quantificar e monitorar o crescimento ativo de implantação do embrião e desenvolvimento do feto no útero rato¹⁸.

Aqui, vamos demonstrar como executar HFUS imagem para produzir dados 2D e 3D para gerar reconstruções do útero rato grávida cedo. Vamos demonstrar a utilidade desse romance método para detectar esses eventos de implantação embrionária precoce sem a necessidade de cessação da gravidez, permitindo que os pesquisadores coletar dados de forma não-invasiva.

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Protocolo

estes estudos foram conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório publicado pela National Institutes of Health e animais protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Baylor College of Medicine, sob o protocolo número AN-4203.

1. preparação do Mouse grávida para ultra-som

1. Timed acasalamento
   1. lugar a represa com um macho fértil comprovada início da noite de rato depois de 1700. Separe dam e macho por 07: 00 horas (h), independentemente se plug vaginal está presente, para garantir a exata datação da gravidez.
      Nota: Na manhã seguinte acasalamento é considerado 0,5 dia post coitum (d.p.c).
2. Preparação para ecografia
   1. Coloque o mouse grávido num recipiente selado anestesia indução.
   2. Sedar com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min) até que o animal perde o braço endireitante reflex (aproximadamente 1-2 minutos dependendo do tamanho do mouse) e movimentos espontâneos não são observados (além de respiração).
   3. Lugar sedado o mouse na posição supina no cone de nariz com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min). Aplicar a pomada oftálmica ao animal ' olhos de s.
   4. Com um cotonete, aplicar o creme depilatório todo abdômen, esterno à vagina e lateral para os flancos.
   5. Permitir creme permanecer por um período máximo de 3 min e então remover o creme e o cabelo com tecido. Garantir a remoção de todo o cabelo, como qualquer cabelo restante irá diminuir a qualidade de imagem.

2. Preparação da fase ultra-som

1. transformar no transdutor.
2. Anexar 3D motor motor fase para o transdutor.
   1. Plug em 3D motor conectando o cabo do motor 3D ao conector do motor 3D no painel traseiro. Conecte o sistema motor 3D para o sistema de montagem usando o post de liberação rápida na parte superior para se conectar à estação de imagem e a liberação rápida montagem na parte inferior para fixar o grampo do transdutor.
3. Anexar a sonda para o grampo do transdutor.

3. Begin Imaging o Mouse grávida

1. rato de lugar supino na plataforma de monitoramento. O rato recebe continuamente isoflurano anestésico (entre 1,5-2,5%) e oxigênio (1 L/min) através do cone de nariz. Fita com cuidado todas as patas para almofadas na plataforma de controlo do ritmo cardíaco.
   1. Aplique 1 a 2 mL de gel de transmissão do ultra-som no abdômen.
2. Usando o estágio motor manual, posicionar a sonda de ultra-som na parte inferior do abdome.
   1. Localizar a bexiga, que deve aparecer como um círculo escuro cheio de líquido apenas cefálica à abertura vaginal.
   2. , Uma vez que a bexiga está localizada, a sonda bem lentamente cefálica para visualizar o útero gestante, que deve aparecer como uma forma cilíndrica com áreas redondas em sites de gravidez. Isto pode ser descrito como parecendo pérolas em uma cadeia de.
   3. Uma vez que o útero gestante foi identificado, começar a imagem 2-D.

4. A ecografia 2D (Figura 1)

1. uma vez que o útero gestante foi identificado, começa no site da gravidez mais próximo à bexiga e lentamente e sequencialmente mover cefálica para determinar o número e localização dos sítios de gravidez.
2. Se o rim, baço ou fígado é visualizado, reposicionar a sonda mais caudal (mais perto da bexiga) como o usuário já foi demasiado longe cefálica.
3. o corno uterino contralateral da imagem da mesma maneira.
4. Congelar a imagem quando o quadro de ultra-som está no centro do site implantação/gravidez para salvar para posterior análise e medições.
   Nota: Demora menos de um segundo para a imagem a ser congelado e salvos para posterior análise.
Distância de implantação de
5. medida usando a reação de decidualization hiperecoico como um marcador manualmente clicando sobre o " medida " ferramenta primeiro e em seguida, clicando sobre a localização de um local de implantação. Em seguida, arraste o cursor para o próximo local de implantação e clique para desenhar uma linha que o computador automaticamente irá relatar a sua distância. O software então irá relatar o que é a medição manual. Esta etapa não é informatizada, mas depende do usuário para marcar a distância entre os locais decidualized desenhando uma linha entre os sites decidualized, que o programa irá fornecer uma medida for
6. Medir o tamanho do implante, tamanho do saco gestacional e tamanho do polo fetal.

5. Ritmo cardíaco fetal

Nota: no d.p.c 9.5, o batimento cardíaco fetal deve ser claramente visualizado.

1. , Mantendo a sonda muito ainda, girar sobre a onda de pulso Doppler e coloque-o sobre o visível heartbeat.
2. Registro cardíaco o coração bater pulsações.
   Nota: Para além do coração, este procedimento também pode gravar pulsações no cordão umbilical.

6. aquisição de ultra-som 3D

1. depois que o útero gestante tem sido visualizado na imagem 2-D, posicionar a sonda em uma área que está no ponto médio aproximado a imagem desejada em 3D. Por exemplo, se uma foram de imagem de uma maçã em 3-d, a sonda deve inicialmente ser colocada onde o caroço da maçã está previsto ser localizado (ou seja, meio do objeto).
2. Com a sonda em uma posição no meio a imagem desejada, obter uma aquisição em 3D. Fase 3-d motor viajará esta distância através do útero em uma série de passos ou quadros, com a intenção de capturar na totalidade o que o investigador deseja.
3. Confirma que o pretendido estruturas completamente são capturadas na digitalização em 3D antes de completar a parte de ultra-som em tempo real. Salve essas informações em 3D para pós-processamento em um momento posterior. O tempo total para a aquisição de 2-D e 3-d ultrasom é aproximadamente 10-20 minutos quando executada por um usuário experiente.

7. reconstituição 3D pós-processamento (Figura 2)

1. carregar os dados desejados para o processamento de imagem 3-d.
2. Escolher " paralelos e rotacionais métodos ", que irá carregar todos os quadros de imagem 3D em um 3-d " caixa " que o usuário irá então traçar o objeto desejado em, quadro por quadro. Escolha o passo tamanho 0,08 mL. Começa em uma extremidade do bloco de imagem e percorrer para se familiarizar com as imagens que foram capturadas dentro espaço.
   1. Start em uma extremidade da imagem e manualmente trace o contorno do objeto.
   2. Rolar a próxima fatia de imagem 2-D ou " quadro " e manualmente, trace o contorno do objeto.
   3. Continue esse processo até que todos os quadros foram manualmente anotado/traçada pelo usuário.
   4. Clique " terminar " para obter a imagem em 3D e cálculos de volume total.
3. Escolher entre malha e sobreposição de sólido, que é uma seta no canto superior esquerdo.
4. Escolher manter ou remover as informações de imagem de ultra-som circundante de clareza. Cada reconstrução 3D pode demorar entre 10 e 20 min.

8. Cuidados pós-procedimento

1. quando o ultra-som for concluído, desligue o gás de anestesia, remover o mouse da plataforma e Limpe suavemente e lavar qualquer gel de ultra-som do animal.
2. Coloque o mouse volta na gaiola em posição em uma área acolchoada. Monitorar até que o animal está acordado e em movimento espontaneamente.

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Resultados

Conforme demonstrado na Figura 1, o ultra-som de alta frequência pode detectar a implantação local desenvolvimento começando tão cedo quanto o ponto de tempo 5.5 d.p.c. Usando o isqueiro hiperecoico decidualized endométrio como um marcador de locais de implantação no d.p.c 6.5 permite que o número de locais de implantação e o espaçamento desses sites para ser quantificada. Como a gravidez progride para 7,5 d.p.c, um saco gestacional de mais escuro...

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Discussão

Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. No entanto deve notar-se que métodos histológicos ainda seria considerados mais ideais quando caracterização em um nível mais ampliada e mais cel...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine	VisualSonics, inc.	VS-11945
Vevo Imaging Station	VisualSonics, inc.	SA-11982
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel	Parker	#SKU PLI 01-08
Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle	Henry Shein	#29404
PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment	Dechra	#12920060