Biodosimetry de radiação acelerada por automatizado identificação Dicentric cromossomo (ADCI) e estimativa de Dose

Resumo

O ensaio de cromossomo dicentric citogenética (DC) quantifica a exposição a radiações ionizantes. O software automatizado Dicentric identificador de cromossomo e o estimador de Dose com precisão e rapidamente estima biológica dose de DCs em células em metafase. Ele distingue monocentric cromossomos e outros objetos de DCs e as estimativas de dose de radiação biológica da frequência de DCs.

Resumo

Dose de radiação biológica pode ser estimado de frequências dicentric cromossomo em células em metafase. Realizar estes ensaios citogenéticos dicentric cromossomo é tradicionalmente um processo manual, trabalhoso, não adequado para lidar com o volume de amostras que podem exigir o exame na sequência de um evento de massa baixa. Software automatizado Dicentric identificador de cromossomo e Dose estimador (ADCI) automatiza este processo examinando conjuntos de metafase imagens utilizando técnicas de processamento de imagem baseado em aprendizado de máquina. O seleciona software imagens apropriadas para análise removendo imagens impróprias, classifica cada objeto como um Centrómero contendo cromossomo ou não-cromossomo, mais distingue cromossomos como monocentric cromossomos (MCs) ou dicentric cromossomos (DCs), determina a frequência DC dentro de uma amostra e estima a dose de radiação biológico, comparando a frequência de DC de amostra com as curvas de calibração calculadas usando amostras de calibração. Este protocolo descreve o uso do software ADCI. Normalmente, ambos calibração (dose conhecida) e conjuntos de teste (dose desconhecida) de imagens de metáfase são importados para realizar a estimativa da dose exata. Imagens ideais para análise podem ser encontrados automaticamente usando filtros de imagem predefinidos ou também podem ser filtradas por meio de inspeção manual. O software processa imagens dentro de cada amostra e frequências de DC são calculadas em diferentes níveis de rigor para chamar DCs, usando uma abordagem de aprendizagem de máquina. As curvas de calibração linear-quadrática são geradas com base em frequências de DC em amostras de calibração expostas a doses físicos conhecidos. Estimam-se doses de amostras de teste, expostas a níveis de radiação incerto de suas frequências de DC usando estas curvas de calibração. Relatórios podem ser gerados mediante pedido e fornecem o resumo dos resultados de uma ou mais amostras, de uma ou mais curvas de calibração ou de estimativa de dose.

Introdução

Radiação biodosimetry usa marcadores biológicos, principalmente cromossômicas aberrações como dicentric cromossomos (DCs) e translocações cromossómicas para medir o que os indivíduos são expostos a doses de radiação. Uma dose biologicamente absorvida pode ser diferente da dose física medida por instrumentos devido à variabilidade entre indivíduos. Da mesma forma, a radiação de uma certa dose de física pode produzir diferentes exposições biológicas devido a condições subjacentes fisiológicas ou ambientais. Conhecimento da dose biológico é de particular importância para o diagnóstico e o tratamento.

O ensaio de DC é o padrão-ouro da Organização Mundial de saúde (OMS) e da Agência Internacional de energia atômica (AIEA) para avaliar a exposição de radiação biológica nas pessoas. Foi o primeiro ensaio recomendado pela AIEA e quem para avaliação de dose de radiação. Frequência de DC é relativamente estável por aproximadamente 4 semanas após a exposição de radiação¹ e sua correlação quantitativa com dose de radiação emitida é exata, que fazem DCs o biomarcador ideal. A relação entre a dose de radiação (referenciado em unidades de Gray [Gy]) e frequência DC (referida como número de DCs por célula) pode ser expressa como uma função linear-quadrática.

O ensaio de DC a citogenética tem sido o padrão da indústria para cerca de 55 anos². Isso foi realizado manualmente, exigindo 1-2 dias para analisar os dados do microscópio de uma amostra de sangue. Várias centenas a vários milhares de imagens são necessários para estimar com precisão a exposição à radiação, dependendo da dose³. Em doses superiores a 1 Gy, AIEA recomenda um mínimo de 100 DCs ser detectado. Análise de imagens de metafase 250-500 é uma prática comum em laboratórios de citogenética de biodosimetry. Para amostras com exposições < 1 Gy, 3.000-5.000 imagens são sugeridas devido as menores probabilidades de formação de DC. Em ambos os casos, é uma tarefa de trabalho intensivo.

Laboratórios de citogenética biodosimetry criar seus próprios in vitro as curvas de calibração de biodosimetry de radiação antes de avaliar doses biológicos em amostras do teste. Amostras de sangue de indivíduos normais, do controle são expostas à radiação e linfócitos são cultivados e preparados para análise de cromossomos metáfase. Usando estas amostras, biológicos doses recebidas são calibrados para as doses de físicas conhecidas emitidas por uma fonte de radiação padrão. Depois de imagens de célula metáfase são gravadas, especialistas examinar imagens, contam DCs e calcular as frequências de DC para cada amostra. Uma curva de calibração é construída por uma curva linear-quadrática para as frequências de DC se encaixam todas as doses. Em seguida, exposições em amostra de indivíduos podem ser inferidas pela correspondência entre as frequências de DC para as doses calibradas na curva, ou especificando-os na fórmula quadrática linear correspondente.

Nós automatizamos ambos a detecção de DCs e determinação para acelerar esse processo usando software de dose. Automatizado Dicentric identificador de cromossomo e Dose estimador (ADCI) usa imagem baseada em aprendizagem de máquina técnicas de processamento para detectar e discriminar dicentric cromossomos (DCs) de cromossomos monocentric (MCs) e outros objetos e automatiza a radiação estimativa de dose. O software visa significativamente reduzir ou eliminar a necessidade de verificação manual das contagens de DC e acelerar a estimativa da dose através da automação. Ele foi desenvolvido com a participação dos laboratórios de biodosimetry de referência em saúde Canadá (HC) e laboratórios nucleares canadenses (CNL). Seus comentários irão garantir que o desempenho continuará a cumprir critérios AIEA para este ensaio.

O software executa as seguintes funções: 1) filtragem DCs e selecionar imagens de célula ideal metáfase para análise, reconhecimento do cromossomo 2), detecção de DC e determinação de frequência de DC e 3) estimar a dose de radiação de dose calibrada, dados de citogenética de radiação. Este software processa grupos de imagens metáfase da mesma individuais (denominados uma amostra), conta o número de DCs em cada usando image técnicas de processamento e retorna a dose estimada de radiação recebida por cada amostra em unidades de Grays (Gy).

O software foi projetado para lidar com uma variedade de estruturas de cromossomo, contagens e densidades. No entanto, o algoritmo executa otimamente em imagens de metafase contendo um complemento completo perto de cromossomos bem separados, linear⁴. Imagens contendo altamente sobrepostos conjuntos de cromossomas, várias células, células em metafase incompleta, irmã separação de cromátides irmãs, núcleos, objetos não-cromossômicas e outros defeitos podem reduzir a precisão do algoritmo. Dedicado a modelos de seleção de imagem e outra segmentação objeto limiares podem filtrar a maioria das imagens sub-ótimas e DCs positivos falsos.

Detecção de dicentric cromossomo é executada quando uma imagem é processada. O algoritmo tenta determinar quais objetos em uma imagem são cromossomos e em seguida, localiza as duas regiões mais prováveis de serem centrómeros em cada cromossoma. Em seguida, uma série de diferentes suporte Vector Machine (SVM) modelos de aprendizagem distinguir cromossomas como DCs ou normal, monocentric cromossomos. Os modelos SVM diferem em sensibilidade e especificidade da deteção de DC (ver passo 3.1.4 abaixo), que pode afetar as frequências de DC que são determinadas em uma amostra.

ADCI processos conjuntos de Giemsa (ou DAPI) manchadas de imagens digitais da metáfase (em formato TIFF ou JPG) para uma ou mais amostras. O software analisa DCs em amostras de calibração e amostras de teste. As doses de físicas (em Gy) de amostras de calibração são conhecidas e são usadas na geração de uma curva de calibração. As doses de físicas e biológicas de indivíduos com riscos desconhecidos são inferidas pelo software a partir da curva de calibração gerado pelo computador. Embora os laboratórios utilizem técnicas comparáveis, as curvas de calibração de laboratórios diferentes muitas vezes variam³. Ambas as amostras de teste e a curva de calibração do mesmo laboratório devem ser processadas para a estimativa da dose exata em amostras do teste.

Este software oferece velocidade, precisão e escalabilidade que endereços a produtividade necessária para manipular um evento em que muitos indivíduos simultaneamente devem ser testados. Ele foi desenvolvido a partir de 2008-2017^{4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13}. Uso de hardware de computador recentes, nesta área de trabalhoSoftware de PC pode processar e estimativa de dose de radiação em uma amostra de 500 equivalentes de genoma metáfase em 10-20 min ⁴do paciente. O código é baseado em um conjunto de segmentação de imagem proprietária e máquina de aprendizagem de algoritmos para análise de cromossomos. Especialista em análise de cada cromossomo 3 Gy radiação deu ADCI exatidões comparáveis. Em um conjunto de 6 amostras de exposições desconhecidas (anteriormente utilizadas em um exercício de proficiência internacional), o software calcula-se doses dentro de 0,5 Gy dos valores obtidos pela revisão manual dos mesmos dados pelo HC e CNL, satisfazendo as exigências da AIEA para triagem biodosimetry. Além disso, a padronização interlaboratorial e, finalmente, a reprodutibilidade da dose estima benefício de ter um DC comum, automatizado, marcando o algoritmo. No entanto, o software permite personalização de imagem critérios de filtragem e seleção, permitindo diferenças nos métodos de preparação de cromossomo e fontes de calibração de radiação a ser tidos em conta.

Este software é uma interface de usuário gráfica (GUI) - sistema que analisa conjuntos de imagens de cromossomo contendo Giemsa (ou DAPI) - manchado células em metafase para anormalidades que resultar da exposição a radiações ionizantes. Os conjuntos de imagens são fotografados digitalmente com um sistema de microscópio de luz (ou epifluorescente) e cada conjunto corresponde a uma amostra diferente. O software utiliza técnicas para detectar e discriminar DCs de MCs e outros objetos de processamento de imagem. Filtros de segmentação empiricamente derivados então automaticamente eliminam falsos positivos DCs sem afetar a verdadeiras DCs. Finalmente, o software automaticamente filtra imagens indesejáveis com base em várias propriedades de imagem encontradas imagens de má qualidade metáfase com modelos de seleção de imagem pré-computadas (ou especificado pelo usuário). Estas imagens incluem aqueles que contêm excessiva ou insuficiente número de objetos "barulhentos", vários cromossomos sobrepostos, imagens faltando cromossomas da metafase, um número excessivo de irmã cromátides irmãs⁴. Os dados de imagem automaticamente curadoria são usados para gerar a curva de calibração da dose de amostras de dose de radiação conhecida e são usados para estimar as exposições das amostras de teste expostas a doses desconhecidas.

Saída do software pode ser vista e salvo como: saída 1) baseado em texto exibida no console, 2) parcelas que podem ser salvos como imagens e 3) relatórios em formato HTML. Muitos aspectos do software são personalizáveis para atender às necessidades específicas de diferentes laboratórios. Laboratórios individuais geralmente fornecem tanto calibração e teste de amostras preparadas e coletados baseiam no protocolo citogenética validado em laboratório. Isto mantém a uniformidade da preparação da amostra e permite que as curvas de calibração geradas a partir de amostras de calibração a ser significativamente aplicada para testar amostras derivadas usando o mesmo protocolo. As curvas de calibração também podem ser criadas a partir de coeficientes da curva ou frequências de DC em doses definidas. As estimativas de dose mais precisas são obtidas por filtragem de imagens de qualidade inferiores e falsos positivos DCs (FPs). Seleção de subconjuntos de imagem ideal dentro de cada amostra é realizada usando 'Modelos de seleção de imagem' que eliminam subpar imagens que tendem a apresentar FPs. Uma série de modelos previamente validados são incluídos com o software, no entanto adicionais modelos com limiares personalizados e filtros podem ser criados e salvos, pelo usuário.

Uma vez que o software é carregado com êxito, é apresentada a interface principal de usuário gráfica (GUI) (ver Figura 1). A partir desta interface, amostras, cada um composto por uma pasta de arquivos de imagem de célula em metáfase, podem ser selecionados e processados para identificar DCs, curvas de calibração podem ser criadas e comparadas e dose de exposição de radiação de amostras pode ser determinada.

Figura 1: Os principais setores do usuário Interface gráfica incluir: uma lista de amostras (1), uma lista de calibração de curvas (2), o processo da fila (3), que monitora o status da detecção de DC em cada conjunto de imagens de cada amostra, uma trama Exiba (4), que resume as estatísticas ou outras propriedades quantitativas de um conjunto de imagens em um console (5) que contém o texto descritivo como saídas de cada operação executada pelo programa ou as curvas de calibração e amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. importação e amostras de processo

1. clique ' amostras ' na barra de menu e selecione ' nova amostra '. Navegar para um diretório apropriado contendo um grupo de imagens de metafase e clique ' Selecionar pasta '.
2. Digite uma identificação exclusiva para a amostra dentro do ' especificar uma identificação exclusiva para a nova amostra ' campo de texto. Este ID identificará a amostra na área de trabalho. IDs de amostra devem conter alfanumérico, ' _ ', ou '-' caracteres apenas. Inclusão do laboratório de origem e físico dose (para amostras de calibração) o ID de amostra é conhecido.
3. (Opcional) fornece uma descrição da amostra se desejado dentro do ' descrição da amostra (opcional) ' área de texto.
4. Clique ' Okey ' para adicionar a nova amostra para o espaço de trabalho.
Repita os passos 1.1 através de 1.4 para adicionar amostras adicionais de
5. . Criar um mínimo de 3 amostras de calibração (sete ou mais são recomendados ³ de exposições diferentes) e pelo menos um teste amostra para realizar a estimativa de dose.
6. Destacar todas as amostras criadas em passos 1.1 através de 1,5 no ' amostras ' lista e clique em ' amostra adicionar à fila de processo ' () ícone de.
7. Clique ' processar todas as amostras na fila ' () ícone para processar todas as amostras sequencialmente na fila - uma ' ADCI processamento ' caixa de diálogo será exibida contendo todas as amostras na fila junto com uma barra de progresso
Clique em
8. quando todas as amostras têm concluído o processamento, o . Salvar amostras agora ou clique em ' guardar uma amostra processada para um arquivo de exemplo ADCI ' () ícone para salvar uma amostra processada posteriormente.

2. visualização e seleção de imagens (opcional, passo recomendado)

Nota: esta etapa descreve o uso do Visualizador de imagem a metafase e criação de um modelo de seleção de imagem. Alguns modelos de seleção de imagem validadas são incluídos com o software que pode ser usado na geração de curva de calibração e estimativa de dose. Assim, esta etapa não é necessária, no entanto, ele pode ser usado como um guia descreve as etapas necessárias para fazê-lo se desejar.

1. Destacar uma amostra dentro do ' amostras ' lista, clique ' amostras ' no menu bar e selecione ' imagem vista ' para abrir o ' metáfase Image Viewer ' .
2. Navegar entre imagens
   1. Selecione uma imagem da caixa de lista suspensa para exibir uma imagem específica. Clique nos ícones de setas esquerda e direita para percorrer as imagens.
   2. Selecione um valor de Sigma SVM caixa suspensa para ver os resultados de deteção de DC em que valor de Sigma. Selecione " Unprocessed " da caixa de lista suspensa para visualizar imagens raw sem contornos de cromossomo.
   3. Verificar a ' inverter ' caixa de seleção inverter os valores de cor e brilho de cada pixel na imagem.
3. Verificar o ' imagem na lista de observação ' caixa de seleção Adicionar a imagem visível para um ' lista '. Clique ' salvar a lista em um arquivo de texto ' () ícone para salvar os nomes de todas as imagens na lista para um arquivo de texto.
4. Modelos de seleção de imagem
   1. clique ' ver todas as imagens ' (a seleção padrão) para incluir todas as imagens na caixa de lista suspensa seleção de imagem. Observar o texto adjacente ao ' imagens incluídas ' para descobrir a fração de imagens selecionadas pelo modelo de seleção de imagem atualmente aplicada.
   2. Clique ' vista incluído imagens ' para incluir apenas estas imagens que não tenham sido excluídas pelo modelo de seleção de imagem na caixa dropdown.
   3. Clique ' vista excluir imagens ' para incluir imagens que tenham sido excluídas pelo modelo de seleção de imagem aplicada na caixa dropdown.
   4. Verificar a ' excluir ' caixa de seleção excluir manualmente uma única imagem.
      Nota: Imagens manualmente excluídas são restauradas para a imagem selecionada, definir se um modelo de seleção de imagem é aplicado posteriormente.
   5. Salvar uma seleção de imagens clicando o ' salvar seleção ' botão. Digite um nome de arquivo para a seleção salva quando solicitado. Clique ' carregar seleção ' aplicar uma seleção anteriormente salva.
   6. Clique ' aplicar filtros de imagem ' para abrir o ' modelo de seleção de imagem baseado em aplicar filtro a amostra atual ' caixa de diálogo, que cria, salva, ou aplica os critérios de selecção de imagens de metáfase numa amostra.
   7. Selecione um modelo de seleção de imagem na lista pré-preenchido. Clique ' Okey ' para aplicar o modelo atual.
   8. Digite uma descrição para um novo modelo desejado, definir ' filtros de exclusão de imagem ', define ' imagem Ranking e inclusão ' e clique em ' salvar seleção modelo ' para criar uma imagem Seleção modelo.
      Nota: As definições de ' imagem Ranking e inclusão ' métodos e cada um ' filtro de exclusão de imagem ' podem ser encontrados na documentação on-line de software ¹⁴.

3. Curva de geração

1. (Recommended optional step) curva de calibração assistente
   1. certifique-se de um mínimo de três amostras de calibração estão presentes na área de trabalho antes de prosseguir. Clique ' assistentes ' na barra de menu e selecione ' curva de calibração ' para abrir o assistente de calibração curva.
      Nota: Embora somente três amostras são matematicamente necessárias para caber e computar uma curva de calibração, sete ou mais amostras, abrangendo uma gama de exposições entre 0 e 5 Gy são recomendadas. As amostras adicionais são necessárias para ajustar a curva de calibração para uma resposta linear-quadrática dose, no entanto os valores de Sigma ideais podem ser inferiores a fim de obter curvas que são utilizáveis para a estimativa de baixa dose (< 1 Gy); os valores de Sigma ideais para doses acima desse limite são diferentes (consulte a etapa 3.1.4).
   2. Prosseguir através do assistente de introdução de tela e coloque uma marca de seleção ao lado de cada amostra de calibragem desejada. Para cada amostra de calibração selecionada desta forma, especifique a dose física (em Gy) a amostra foi exposta para dentro de seu campo de texto adjacente. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
   3. Selecione um modelo de seleção de imagem se desejado na lista de modelos que contém modelos de seleção de imagem predefinida junto com o software, além de quaisquer modelos criados manualmente. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
   4. Selecione um valor de SVM Sigma da caixa suspensa. Continuar para o próximo ecrã do assistente .
      Nota: Um valor SVM Sigma 1.4 ou 1.5 é recomendado para as estimativas de dose > 1 Gy e um valor de 1.0 para estimativas abaixo 1 Gy ( Figura 2).
   5. Revisão anteriores seleções na tela de resumo e clique ' terminar ' para concluir o assistente, causando uma prepopulatEd ' criar uma curva ' caixa de diálogo aparecer.

Figura 2: visualização dos efeitos da alteração do valor de Sigma SVM do algoritmo no verdadeiro positivo (TP) e contagens de DC de falso positivo (FP), a declaração de preditiva positiva (PPV) e positivo verdadeiro taxa (TPR). clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. criar uma caixa de diálogo curva.
   1. (Pule esta etapa se assistente foi usado) clique em ' curvas ' na barra de menu e selecione ' nova curva '. Escolha ' curva de ajuste de dados de Dose-resposta ' da caixa suspensa apresentou dentro da caixa de diálogo e clique ' Okey '.
   2. Especificar uma identidade exclusiva para a curva na ' especificar uma identidade exclusiva para a nova curva ' caixa de texto dentro do ' criar uma curva ' caixa de diálogo.
   3. (Opcional) digite uma descrição para a nova curva dentro do ' adicionar uma breve descrição para a curva a ser criado ' caixa de texto.
   4. (Skip as seguintes etapas se o assistente de curva foi usado para criar uma curva de calibração) definir valores curva.
      Nota: O assistente de curva de calibração descrito no passo 3.1 predefine campos no ' criar uma curva ' caixa de diálogo. As etapas a seguir descrevem como preencher manualmente esses campos. Se o assistente foi usado, alguns passos abaixo ainda podem ser seguidos se desejado, adicionar ou remover dados adicionais.
      1. Selecione um valor de Sigma SVM opções no ' SVM ' caixa dropdown - é altamente recomendável que o valor de Sigma escolhido aqui corresponde ao valor de Sigma escolhido ao usar esta curva para realizar estimativa de dose.
      2. (Opcional) especifique um modelo de seleção de imagem clicando o ' especificar o arquivo de ' botão.
      3. Clique ' entrada ' para adicionar uma nova entrada em branco para a lista de dose-resposta, sob o título ' resposta-Dose de entrada de dados para criar uma curva de '.
      4. Digite a dose de uma amostra de calibração na Gy, sob o título ' Dose '.
      5. Enter ' resposta (DC/Cell) ' retirados saída de exemplo dentro do console, quando uma amostra é realçada. Localize o valor apropriado de DC/célula para o valor de Sigma SVM anteriormente selecionado dentro do console ou do correspondente relatório de amostra (etapa 5.1, se disponível) e inseri-lo neste campo.
      6. Repita os três passos anteriores até que todas as amostras de calibração foram adicionadas.
   5. Imprensa ' validar dados ' para garantir que o conteúdo da Dose-resposta lista é formatada corretamente – Verifique se todos os campos na lista de Dose-resposta são destaque verde indicando dados válidos.
   6. Imprensa ' Okey ' para finalizar a criação da curva. Para salvar a nova curva na ' curva salvar? ' caixa de diálogo que aparece após prensagem ' Okey '. Ou clique em ' salvar curva para um arquivo de curva ADCI ' () ícone destacado dentro do ' curvas ' lista mais tarde.

4. Estimativa de dose

1. (Recommended optional step) assistente de estimativa de Dose
   1. clique ' assistentes ' na barra de menu e selecione ' estimativa de Dose '.
   2. Prosseguir através do ecrã do assistente introdutório e selecionar uma curva de calibração criada anteriormente na caixa dropdown - suas propriedades aparecerá abaixo. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
   3. Colocar uma marca de seleção ao lado de amostras de teste de exposição desconhecida para incluí-los na estimativa da dose. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
   4. Observar a descrição e propriedades do modelo de seleção de imagem aplicada durante a geração da curva de calibração. Observe que o mesmo modelo de seleção de imagem é aplicado para as amostras de teste selecionado. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
      Nota: Abaixo a descrição do modelo de seleção de imagem, o mesmo modelo é previamente preenchido e será aplicado para as amostras de teste de seleção. Aplicar o mesmo modelo de seleção de imagem para calibração e amostras de teste. Embora seja possível aplicar modelos de seleção de imagem diferente, selecionando um modelo diferente na lista suspensa, isso não é recomendado.
   5. Selecione um valor de Sigma SVM na lista suspensa. Continuar para o próximo ecrã do assistente.
      Nota: O valor de Sigma SVM usado durante a geração da curva de calibração é preenchido. É recomendável que este valor permanece inalterada.
   6. Revise as seleções anteriores na tela de resumo e clique em ' terminar ' para concluir o assistente - um pré-preenchido ' Dose calculadora ' caixa de diálogo aparecerá.
2. Dose calculadora
   1. (pule esta etapa se assistente foi usado) destacar uma curva de calibração da lista de curvas na rubrica ' curvas ', clique ' curvas ' no menu bar e selecione ' Calcular a Dose ' para abrir o ' Dose calculadora ' caixa de diálogo.
   2. (Ignorar estas etapas se assistente foi usado) definir valores para a estimativa da dose.
      Nota: O assistente de estimativa de Dose descrito na etapa 4.1 predefine campos no ' Dose calculadora ' caixa de diálogo. As etapas a seguir descrevem como preencher manualmente esses campos. Se o assistente foi usado, alguns passos abaixo ainda podem ser seguidos se desejado, adicionar ou remover dados adicionais.
      1. Clique ' Amostra de uso no espaço de trabalho para preencher as frequências DC ' () ícone e destaque testar amostras dentro do ' amostras processadas em ADCI Espaço de trabalho ' lista para adicionar as amostras selecionadas para o ' DC frequências para estimativa da Dose ' lista.
      2. Selecione um modelo Sigma SVM valor e imagem seleção para estas amostras das caixas dropdown.
         Nota: Um valor de Sigma SVM, correspondendo ao valor de Sigma usado na geração da curva de calibração é necessário para a estimativa da dose exata. O valor de Sigma associado com a curva de calibração é listado na parte inferior da ' calculadora de Dose ' diálogo.
      3. (opcionais) amostras de teste adicionais adicionar, repita as duas etapas anteriores. Como alternativa, adicione várias amostras simultaneamente, destacando-se várias amostras no ' amostras processadas no espaço de trabalho ' lista.
      4. (opcional) clique o ' um valor de frequência DC de entrada ' () ícone para inserir manualmente um DC frequência não associada com qualquer amostra se desejado – a nova frequência DC será adicionada para o ' DC aberrações para estimativa da Dose ' lista.
      5. (opcional) clique duas vezes o ' nome ' campo de uma frequência DC inserida manualmente para modificar o seu nome.
      6. (opcionais) amostras adequadas de destaque e clique ' frequência DC remover ' () ícone para remover amostras que foram adicionadas para o ' DC As aberrações para estimativa da Dose ' lista em erro.
   3. Clique ' Okey ' para fechar o ' Dose calculadora ' e realizar estimativa de dose - resultados são a saída para o console.
   4. Como resultados de estimativa de dose são exibidos no console em formato tabular para cada amostra, observar ' frequência DC ', ' SVM ', ' Dose estimada ' (contém o estimado dose biológica da amostra em Gy), e ' modelo de seleção de imagem aplicada ' campos.

5. Relatórios

Nota: O método usado para nomear um relatório e selecione um diretório dentro do qual ele é salvo é comum a todos os tipos de relatório. A ' nome do relatório ' deve ser fornecido. Quando um relatório é gerado, será criado um diretório contendo arquivos de relatório usando esse nome automaticamente. Este diretório será colocado dentro é o ' pasta de relatório '. Por padrão, o ' pasta de relatório ' é um diretório chamado ' relatórios ' encontrado no diretório de dados especificado durante a instalação.

1. Relatório de exemplo
   1. clique ' relatório ' na barra de menu e selecione ' relatório de exemplo ' para abrir o ' gerar o relatório de exemplo ' caixa de diálogo.
   2. Digite um nome para o relatório no ' nome do relatório ' campo de texto. Clique ' procurar ' para modificar o ' pasta de relatório ' se desejado.
   3. Selecione pelo menos uma amostra processada para incluir no relatório, colocando uma marca de seleção ao lado de amostras adequadas no ' seleccionar amostras ' lista.
   4. Especificar um valores de intervalo de SVM Sigma para o qual deseja gerar parcelas de distribuição DC selecionando os valores em ' Min ' e ' Max ' suspensa caixas dentro do ' distribuição de DCs na amostra ' área. Excluir parcelas de distribuição DC o relatório se desejado, desmarcando o ' incluem ' caixa de seleção o ' distribuição de DCs na amostra ' área.
   5. Especificar quais parcelas contendo estatísticas de filtragem para incluir no relatório, colocando marcas de seleção ao lado de parcelas adequadas no ' selecione parcelas ' área. Clique ' Okey ' para gerar o relatório.
2. Relatório de curva
   1. clique ' relatório ' na barra de menu e selecione ' relatório de curva ' para abrir o ' gerar relatório de curva ' caixa de diálogo.
   2. Digite um nome para o relatório no ' nome do relatório ' campo de texto. Clique ' procure ' para modificar o ' pasta de relatório ' se desejado.
   3. Selecione pelo menos uma curva para incluir no relatório, colocando uma marca de seleção ao lado de curvas apropriadas no ' selecione curvas a serem incluídos no relatório ' lista. Clique ' Okey ' para gerar o relatório.
3. Relatório de estimativa de dose
   1. Executar etapas de estimativa de dose descritas na seção 4.
      Nota: Relatórios de estimativa de Dose são gerados a partir dos resultados indicados nas áreas de plotagem e console. Assim, uma parcela de estimativa de dose deve estar presente na área de plotagem no momento é gerado um relatório.
   2. Clique ' relatório ' na barra de menu e selecione ' relatório de estimativa de Dose ' para abrir o ' gerar relatório de estimativa de dose ' caixa de diálogo.
   3. Digite um nome para o relatório no ' nome do relatório ' campo de texto. Clique ' procure ' para modificar o ' pasta de relatório ' se desejado.
   4. Clique ' Okey ' para gerar o relatório.

6. Capacidades de auditoria

Nota: O software grava todas as operações efectuadas durante uma sessão em um arquivo de log. O programa fornece um aplicativo de software acessório que permite que os arquivos de log ser visto, pesquisado, usado para avaliar a integridade de uma análise e em alguns casos, recuperar dados de amostra de incompleta ou prematuramente encerrada sessões.

1. Clique ' ajudá-' na barra de menu e selecione ' exibir Logs de ' para abrir o Visualizador de arquivo log suplementar software.
2. Certifique-se de arquivos de log estão listados na barra lateral no lado esquerdo da janela. Se não há arquivos são visíveis, clique em ' arquivo ', escolher ' diretório de arquivo de log Select ' e navegar para um diretório contendo arquivos de log.
3. Dê um duplo clique sobre o nome de um arquivo de log na barra lateral para visualizar o conteúdo do arquivo de log no ' Viewer ' Tab
4. Selecione o ' pesquisa ' guia e entrada termos para pesquisar um ou mais arquivos de log de pesquisa. Parâmetros de pesquisa
   1. entrada se desejado no ' de ', ' para ', ' usuário ', ' licença ', ' operação ', e ' Parâmetros ' campos.
   2. Use o controle deslizante para selecionar o ' resultados da busca de Max para cada arquivo '.
      Nota: Alguns parâmetros de busca, como username, irão retornar muitos resultados em cada arquivo de log correspondente. Este parâmetro limita o número de resultados da pesquisa exibidos em cada arquivo de log.
   3. Coloque uma marca de seleção na ' pesquisa destacada somente arquivos ' arquivos de log de checkbox (log de todos os arquivos são pesquisados por padrão) e destaque na barra lateral para pesquisar apenas um subconjunto dos arquivos de log.
   4. Verificar a ' executar a verificação de integridade ' checkbox (ativado por padrão) para examinar cada arquivo de log elegível a serem pesquisados para erros relacionados a um encerramento inesperado software.
   5. Clique ' pesquisa ' para procurar arquivos de log e observar busca resultados no lado direito da janela.
   6. Clique o ' o arquivo de log View ' botão adjacente para um resultado de pesquisa para destacar e visualizar a linha indicada na ' visualizador ' Tab
5. Problemas de integridade de arquivo de log
   1. clique o ' integridade ' tab para ver os erros detectados durante a verificação de integridade (se o cheque foi solicitado).
      Nota: Deve ser feita uma pesquisa para examinar arquivos de log para as questões de integridade. Para executar uma verificação de integridade, sem procurar arquivos de log para umy de termos de pesquisa, simplesmente deixe todos os campos de parâmetro de pesquisa preto na ' pesquisa ' guia, certifique-se do ' executar verificação de integridade ' está marcada e clique em ' pesquisa '. Se forem encontrados problemas de integridade, o ' integridade ' cor de fundo da guia se tornará vermelho
   2. Integridade de resolver problemas (saída é agrupada por arquivo de log) sempre que possível.
      Nota: Para obter mais informações sobre as etapas para resolver problemas de integridade, consulte a documentação on-line ¹⁴.

7. Curva e opções de estatísticas de estimativa de Dose

1. clique ' configurações ' na barra de menu e selecione ' as opções de estatísticas ' para abrir o ' as opções de estatísticas ' caixa de diálogo.
2. Selecione um método (mínimos quadrados ou máxima probabilidade) da caixa de lista suspensa de encaixe de curva de calibração.
3. Coloque uma marca de seleção ao lado ' exibir a curva de calibração 95% CI, se for o caso ' para exibir os intervalos de confiança de 95% ao plotar uma curva de calibração.
4. Coloque uma marca de seleção ao lado ' estimativa de Dose calcula 95% CI devido Poisson ' para calcular limites de confiança de 95% na dose de estimativas baseadas na natureza Poisson de rendimento de DC.
5. Coloque uma marca de seleção ao lado ' estimativa de Dose calcula 95% CI devido a curva, se for o caso ' para calcular limites de confiança de 95% nas estimativas de dose com base na incerteza relacionada com a curva de calibração.

Resultados

Testes do software foi realizado com dados de imagem de cromossomo metáfase obtidos de HC e CNL. Amostras de sangue foram irradiadas por uma unidade XRAD-320 (250 kV radiografias, 12,5 mA, 2mm Al filtração, taxa de dose: 0,92 ou 1,7 Gy/min) calibrado com uma câmara de íon no HC e processadas em ambos os laboratórios. Amostras de linfócitos do sangue periférico foram cultivadas, fixo e manchadas em cada estabelecimento de acordo com protocolos estabelecidos^3,15. Imagens de metáfase de corrediças manchadas de Giemsa foram capturadas independentemente por cada laboratório usando um sistema de microscopia automatizada. Especialistas em cada laboratório marcou DCs em várias destas amostras manualmente, construído suas próprias curvas de calibração e estima-se doses de amostras de teste de riscos desconhecidos. Uma descrição detalhada, esses conjuntos de dados é fornecida na tabela 1.

Dose de física	Finalidade	Preparação de HC		Preparação do CNL
		Nome do referido	n º de imagens	Nome do referido	n º de imagens
0 Gy	Calibração	HC0Gy	731	CNL0Gy	798
0.1 Gy	Calibração	HC01Gy	2162	AT	AT
0,25 Gy	Calibração	HC025Gy	1826	AT	AT
0,5 Gy	Calibração	HC05Gy	1054	CNL05Gy	1532
Gy 0,75	Calibração	HC075Gy	1233	AT	AT
1 Gy	Calibração	HC1Gy	1566	CNL1Gy	841
2 Gy	Calibração	HC2Gy	1147	CNL2Gy	996
3 Gy	Calibração	HC3Gy	1212	CNL3Gy	1188
4 Gy	Calibração	HC4Gy	909	CNL4Gy	1635
5 Gy	Calibração	HC5Gy	1019	AT	AT
3.1 Gy	Teste	HCS01	540	CNLS01	500
2.3 Gy	Teste	HCS08	637	CNLS08	500
1.4 Gy	Teste	HCS10	708	AT	AT
1.8 Gy	Teste	HCS04	600	CNLS04	957
2.8-Gy	Teste	HCS05	1136	CNLS05	1527
3.4 Gy	Teste	HCS07	477	CNLS07	735

Tabela 1: Fontes de dados de imagem fornecidos pelo HC e CNL da avaliação do Software.
Nota de rodapé: Modificado da tabela 1 em Rogan et al, 2016⁴. Únicas imagens manualmente pré-selecionadas anteriormente estavam disponíveis para nós do CNL. Não filtradas imagens tornaram-se disponíveis e contagens de imagem são actualizadas em conformidade. Além disso, recentemente adquiriu amostras HC (0.25Gy, 0.75Gy e 5Gy) são apresentados aqui.

Seleção automática de imagens em amostras

Qualidade da imagem é fundamental a correcta detecção de DC em análise de DC. Seleção de imagem por especialistas citogenéticas é geralmente realizada manualmente em análise convencional de DC. ADCI utiliza critérios quantitativos imagem automaticamente selecionar imagens antes de cálculo de frequência DC¹⁶. Os usuários podem filtrar as imagens com base em morfologias cromossomo específico e/ou tipo de células de acordo com as proporções relativas dos comprimentos dos objetos de acordo com comprimentos conhecidos de citogenética-definidos grupos de cromossomos em um cariótipo humano normal (denominado a método de grupo-bin distance). Os filtros morfológicos disponíveis usam escala invariável limiares para rejeitar imagens de células com cromossomo incompleto de moda ou com várias células em metafase, com cromossomos prometafase, com irmã proeminente dissociação de cromátides irmãs, com altamente curvado e torcido cromossomos, com objetos que têm contornos suaves característicos dos núcleos intactos e aqueles em que os objetos menos são reconhecidos como cromossomos. Figura 3 (a) e (b) mostram exemplos de imagens selecionadas, Considerando que a Figura 3 (c) e (d) são exemplos de imagens que são filtrados pelo software. Essas imagens são derivadas de amostra HCS05 (descrito na tabela 1) e são selecionadas pelo modelo de seleção de imagem predefinidos que classifica todas as imagens por distância de bin do grupo e, em seguida, seleciona as melhores 250 imagens. Cromossomos em Figura 3 (A), (b) são bem separados e apresentam morfologia satisfatória. Figura 3 (c) contém números excessivos de clusters de cromossomo sobreposta. Figura 3 (d) mostra severa irmã separação de cromátides irmãs. Cromátides irmãs irmã são completamente separados pelo menos 8 dos cromossomos e as constrições centromérica são ambíguas na maioria dos outros cromossomos.

Figura 3: exemplos de imagens de metafase na amostra HCS05 (ampliação: 63 X), tanto Unselected e selecionado pelo modelo 'Grupo Bin distância, Top 250 imagens'. (A) e (B) são imagens selecionadas. (C) e (D) são imagens que foram eliminadas pelo modelo. (C) foi excluído porque continha muitos cromossomos sobrepostos e (D) tinha um número excessivo de irmã separado cromatídeos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os efeitos da aplicação destes modelos de seleção de imagem é evidente, examinando o nível de confiança de detecção de DC em uma amostra. As ocorrências de DCs em uma população de células de uma amostra irradiada seguem uma distribuição de Poisson. O teste de bondade de ajuste qui-quadrado compara a distribuição de frequência DC observada para o esperado ajuste para a distribuição de Poisson. Modelos que corretamente dados de amostra do filtro apresentam frequências de DC não é significativamente diferentes de Poisson a esperada derivada de valores (normalmente o nível de significância > 0,01). Figura 4 mostra as ocorrências de DC e o correspondente se encaixa à distribuição de Poisson para a amostra de HC4Gy de todas as imagens vs apenas imagens selecionadas pelo modelo "grupo bin distância, top 250 imagens". Figura 4 (b) mostra um melhor ajuste para a distribuição de Poisson. O p-valor (0,36) do conjunto filtrado de imagens significativamente exceder o da distribuição DC não filtrada na Figura 4 (a). Em níveis de significância de 1% ou 5%, a amostra não filtrada na Figura 4 (a) é menos confiável, porque contém dados de DC de qualidade inferiores, como a hipótese nula de uma distribuição de Poisson de DCs é rejeitada.

Figura 4: Screenshots de frequências proporcionadas DC apto para Poisson Dstributions de HC4Gy de amostra no Software. (A) todas as imagens são incluídos, (B) apenas imagens selecionadas pelo modelo (grupo bin distância, imagens de top 250) são incluídas. A lenda (superior direito) indica as estatísticas do ajuste para a distribuição de Poisson (índice de dispersão, teste de Mu e Lambda) e a bondade de qui-quadrado de teste de ajuste (p-valor) clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Deteção de cromossoma dicentric (DC)

Detecção de DC precisa é a exigência de pré-requisito crítica de ADCI. Corretamente detectado DCs e aqueles perdeu pelo software são definidos respectivamente como verdadeiros positivos (TPs) e falsos negativos (FNs). Objetos que não são DCs, mas detectado incorretamente como DCs, são referidos como falsos positivos (FPs). FPs incluem monocentric cromossomos, fragmentos do cromossomo, irmã separada cromatídeos, clusters de cromossomo sobreposta e objetos não-cromossômicas. A Figura 5 mostra os resultados da deteção de DC em duas imagens de metáfase. Os objetos 1 e 3 são TPs, enquanto objeto 4 é um FP constituído por dois cromossomos distintos monocentric em conjunto ao longo de seus braços curtos. Na Figura 5 (a), objeto 2 foi originalmente um FP, mas posteriormente corrigido por filtros FP no software. Objeto de 5 e 6 de objeto na Figura 5 (b) são exemplos de prováveis do FNs.

Figura 5: Screenshots indicar metáfase cromossomo classificação de potencial DCs. (A) Uma imagem de amostra CNL1Gy (ampliação: 63 X) mostrando 1 TP, objeto "1"; e 1 corrigido FP, objeto "2". (B) uma imagem de amostra CNL4Gy (ampliação: 63 X) mostrando 1 TP, objeto "3"; 1 FP, objeto "4"; e 2 potenciais FNs, objetos "5" e "6". TPs, FPs corrigida, monocentric normal e não classificados cromossomos alinham-se respectivamente com contornos de vermelhos, amarelos, verdes e azuis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estimativa de dose de amostras para ensaio

O resultado final das análises ADCI são estima que a dose de amostras inferidas a partir de curvas de calibração. Estimativas de dose feitas pelo software para as amostras de teste na tabela 1 estão indicadas nas tabelas 2 e 3. Para comparação, a dose de radiação física emitido e as doses marcou manuais por especialistas em HC para amostras HCS01, HCS08 e HCS10 são indicadas. Da mesma forma, o físico e o manual marcado doses por peritos CNL são mostrados para CNLS04, CNLS05 e CNLS07.

A Figura 6 demonstra as curvas de calibração com as estimativas de dose de radiação para amostras de laboratório de biodosimetry de saúde do Canadá HCS01, HCS08, HCS10, HCS04, HCS05 e HCS07. A curva de calibração é gerada utilizando amostras HC0Gy, HC1Gy, HC2Gy, HC3Gy e HC4Gy. O modelo de seleção de imagem contendo 3 filtros baseados em escore-Z + "grupo bin distância, imagens de top 250" é aplicado a todas as amostras. As estimativas de dose juntamente com análises estatísticas associadas são mostradas na tabela 2.

Figura 6: Screenshot de estimativa de Dose de amostras para ensaio HC. Quadrados pretos representam amostras de calibração. Imagens em amostras de teste e amostras de calibração são selecionadas pelo modelo (3 filtros FP + grupo bin distância, top 250 imagens). Espessura de linhas pontilhadas representam o mapeamento da DCs/metafase através da curva de calibração para dose estimada. Finas linhas pontilhadas denotam superior e inferior limites de confiança de 95% da DCs/metafase. Códigos de teste amostras de cor: vermelho brilhante, HC S01 (dose física: 3.1Gy, dose HC inferido: 3.4Gy, ADCI: 3Gy); verde escuro, HC S04 (dose física: 1.8Gy, ADCI: 1.85Gy); azul brilhante, HC S05 (dose física: 2.8Gy, ADCI: 2.95Gy); azul escuro, HC S07 (dose física: 3.4Gy, ADCI: 2.35Gy); vermelho escuro, HC S08 (dose física: 2.3Gy, dose HC inferido: 2.5Gy, ADCI: 2Gy); verde brilhante, HC S10 (dose física: 1.4Gy, dose HC inferido: 1.4Gy, ADCI: 0.95Gy). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostras	Dose de física	HC inferido Dose	ADCI estimado Dose	Dose estimada LCL	Dose estimada UCL	P-valor *
HCS01	3.1	3.4	3	2.3	3.8	0.117
HCS08	2.3	2.5	2	1.4	2.7	0.815
HCS10	1.4	1.4	0,95	0,5	1,55	0.211
HCS04	1.8	AT	1.85	1.25	2.55	0.0293
HCS05	2.8	AT	2.95	2.25	3.75	0.00354
HCS07	3.4	AT	2,35	1.7	3.1	0,0002

Tabela 2: Dose estimativa de resultados de amostras de teste HC.
Nota de rodapé: Modificado da tabela 3 em Rogan et al, 2016⁴. As estimativas de dose ADCI relatadas anteriormente foram baseadas em imagens não filtradas e encaixe de curva foi executada usando o método de mínimos quadrados. Aqui, a curva de calibração foi ajuste usando o método de probabilidade máxima e um modelo de seleção de imagem contendo 3 filtros FP + "grupo bin distância, imagens de top 250" foi aplicado antes de estimativa de dose. Dose estimada UCLe LCL se refere a dose estimativa superior e inferior de limites de confiança de 95% com base na natureza do rendimento DC Poisson. * Bondade de quadrados chi de ajuste para a distribuição de Poisson teórica; AT: Resultados de dose manualmente inferido não foram fornecidos.

Estimativas de dose de radiação para amostras de CNLS04 de laboratórios nucleares canadenses, CNLS05, CNLS07, CNLS01 e CNLS08 são mostrados na Figura 7. A curva de calibração é gerada utilizando amostras CNL0Gy, CNL0.5Gy, CNL1Gy, CNL2Gy, CNL3Gy e CNL4Gy. Foi aplicado um modelo de seleção de imagem consistindo de 6 filtros FP para todas as amostras. Os resultados com análises estatísticas são mostrados na tabela 3.

Figura 7: Screenshot de estimativa de Dose de amostras para ensaio CNL. Quadrados pretos representam amostras de calibração. Imagens em amostras de teste e amostras de calibração são selecionadas usando 6 filtros FP. Espessura de linhas pontilhadas representam o mapeamento da DCs/metafase através da curva de calibração para dose estimada. Finas linhas pontilhadas denotam superior e inferior limites de confiança de 95% da DCs/metafase. Códigos de teste amostras de cor: vermelho brilhante, CNL S04 (dose física: 1.8Gy, dose CNL inferido: 1.7Gy, ADCI: 1.95Gy); vermelho escuro, S05 CNL (dose física: 2.8Gy, dose CNL inferido: 2.7Gy, ADCI: 3.05Gy); verde brilhante, S07 CNL (dose física: 3.4Gy, dose CNL inferido: 3.1Gy, ADCI: 3.4Gy); verde escuro, CNL S01 (dose física: 3.1Gy, ADCI: 3.75Gy); azul, S08 CNL (dose física: 2.3Gy, ADCI: 2.8Gy). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostras	Dose de física	CNL inferido Dose	ADCI estimado Dose	Dose estimada LCL	Dose estimada UCL	P-valor *
CNLS04	1.8	1.7	1.95	1.25	2.45	0.0545
CNLS05	2.8	2.7	3.05	2.75	3.35	0,325
CNLS07	3.4	3.1	3.4	3	3.75	0.473
CNLS01	3.1	AT	3.75	3.35	> 4	7.63E-11
CNLS08	2.3	AT	2.8	2.25	3.3	0.777

Tabela 3: Amostras de teste de resultados de estimativa de dose de CNL.
Nota de rodapé: Modificado da tabela 3, Rogan et al., 2016⁴. As estimativas de dose ADCI relatadas anteriormente foram baseadas em não filtrada (HC) ou selecionado manualmente imagens (CNL) e encaixe de curva foi executada usando o método de mínimos quadrados. Aqui, a curva de calibração foi ajuste usando o método de probabilidade máxima e um modelo de seleção de imagem contendo 3 filtros FP + "grupo bin distância, imagens de top 250" foi aplicado antes de estimativa de dose. Dose estimada UCL e LCL, respectivamente, referem-se a dose estimada superior e abaixar limites de confiança de 95% com base na natureza do rendimento DC Poisson.
* Bondade de quadrados chi de ajuste para a distribuição de Poisson teórica; AT: Resultados de dose manualmente inferido não estavam disponíveis.

Cálculo da dose de radiação dentro da escala linear da curva de calibração (< 1 Gy) podem ser executadas com o software, no entanto, um valor de 1.0 é recomendado de Sigma é para reduzir ainda mais a frequência de DCs erroneamente (Figura 8).

Figura 8: Screenshots de duas curvas de calibração derivado de amostras de calibração HC no Sigma diferentes valores. (A) amostras de calibração de HC: 0Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy e 5Gy na Sigma = 1,5. (B) amostras de calibração de HC: 0Gy, 0.25Gy, 0.5Gy, 0.75Gy, 1Gy, 2Gy, 3Gy, 4Gy, e 5Gy usando SVM Sigma = 1.0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Essas análises indicam que há pequena, mas aceitáveis diferenças entre física e biologicamente inferido dose interpretados por especialistas e pelo software. A diferença entre manual ou software de estimativa de dose a físico é referida como o "erro". O erro em doses inferidos das amostras manualmente marcadas por HC e CNL é ≤ 0.3 Gy. Processamento automatizado pelo software é menos preciso do que especialistas, mas geralmente dentro dos limites de triagem da AIEA-especificado de ± 0,5 Gy³. Para a maioria das amostras de teste nas tabelas 2 e 3, o software produzido resultados corretos dentro deste limite. No entanto, HCS07 e CNLS01 apresentam um pobre bondade de ajuste para a distribuição de Poisson, sugerindo que havia problemas potenciais em imagem e qualidade DC nestas amostras que não foram resolvidos pela aplicação dos modelos de seleção de FP e imagem. O limiar de significância p valor parece ser excessivamente rigorosas no caso de HCS05, onde o software determinado com precisão a dose correta.

Discussão

Capacidades e limitações do software

O protocolo descrito neste documento introduz o procedimento passo a passo típico usado em ADCI para importar e processar imagens de citogenética metáfase, criar radiação as curvas de calibração e estimar a dose biológico em indivíduos ou amostras expostas ao desconhecido níveis de radiação. No entanto, não é necessário efectuar estas instruções sequencialmente. Por exemplo, muitas amostras de teste de dose desconhecido podem ser processadas e analisaram usando a mesma curva de calibração pré-computadas. Além disso, uma vez que a transformação está completa, a seleção de imagem e DC modelos de filtragem podem ser iterada pelo usuário. Aplicação de um modelo de seleção de imagem adequado depende das características e qualidade dos dados da imagem de metáfase, que por sua vez, baseia-se tanto sobre o protocolo de laboratório usado para preparar as células e os critérios de rigor usados para selecionar células com automatizado sistemas de captura de metáfase. Morfologias cromossomo diferirão entre laboratórios de citogenéticos e biodosimetry, e assim, os modelos de seleção de imagem devem ser avaliados pelo usuário para determinar se os modelos de seleção de imagem predefinidos fornecidos com o software serão adequados para produzir estimativas de dose exata, ou se personalizado modelos com usuário-definido os limites precisam ser criados. Baseado em nossa experiência, a eficácia dos modelos de seleção de imagem é influenciada pela origem e qualidade das imagens celular. Os usuários podem projetar seus próprios critérios de seleção de imagem usando diferentes combinações de filtros para eliminar falsos positivos DCs e modelos de seleção de imagem e os correspondentes valores de limiar para selecionar as imagens desejadas. Há flexibilidade na entrada de curvas de calibração e estimativa de dose, como coeficientes da curva linear-quadrática e frequências de DC podem ser modificados ou introduzidos manualmente.

Embora o software é totalmente automatizado, imagens podem ser revistas e selecionadas manualmente. Esse recurso está disponível para incluir ou remover imagens individualmente processadas através da função de visualizador de microscópio na GUI do principal. No entanto, devido à automação, o software é significativamente mais eficiente em comparação com o manual de Pontuação de imagens metafase e contando DCs. Uma amostra composta de 1000 imagens pode ser processada em (tiff) de 20 a 40 min (jpg) em uma estação de trabalho de desempenho de vários núcleos. Este software será particularmente útil em situações críticas de tempo ou trabalho intensivos, como eventos em que vários indivíduos foram expostos ou eram suspeitos de ter sido exposto à radiação, ou onde o tempo-sensíveis diagnostica e tratamento as decisões são críticas.

Deteção de precisos e exatos alto throughput da DCs, bem como a estimativa de dose são necessários para a avaliação de radiação autônoma. Outras alternativas disponíveis para o software não cumprir os dois desses requisitos. Uma análise citogenética assistida por usuário, com base em imagem (DCScore, Metasystems¹⁷) sistema requer verificação manual de candidato DCs, devido a um erro de alto taxa atribuível a não corrigida sobreposições entre cromossomos e o sistema não determina dose de radiação. DCScore não seria tão eficaz como ADCI em um evento de radiação que envolvem um grande número de indivíduos potencialmente expostos. Sistemas de microscópio de grande abertura podem coletar imagens de várias células de metafase¹⁸, no entanto, eles não analisá-los. Software de²⁰ "Estimativa de Dose" e "CABAS"¹⁹ podem gerar calibração curvas e estimativa de dose, mas não marcam DCs. Outros ensaios de biodosimetry que não são baseados na análise de DC incluem H2AX de fluorescência, sondas de hibridação in situ da fluorescência com DNA alvo para específicos cromossomos, expressão gênica, ensaio de micronúcleo e urina e biomarcadores respiratórias. Esses métodos são menos específica e menos sensível para radiação ionizante, podem ser mais caros, em alguns casos, são mais demorados e geralmente não têm sido padronizados através de vários laboratórios de referência. A maioria destas técnicas não detectam radiação estável respostas, então não podem ser utilizados para a avaliação de longo prazo (> pós-exposição de 7 dias) da dose de radiação. Por outro lado, isto pode avaliar os indivíduos acima de pós-exposição de 90 dias e pode processar dados de qualquer microscópio do laboratório de citogenética sistema de imagem. No entanto, se uma amostra é desenhada > 4 semanas pós-exposição, sensibilidade é reduzida devido a decadência de aberrações dicentric^1,2,3 e o software atualmente não corrigir frequências de DC para atrasos na amostragem indivíduos expostos.

Este software tem algumas limitações. Modelos de seleção de imagem existente selecione imagens de metafase aceitável na maior parte, mas em alguns casos, não conseguem eliminar imagens insatisfatórias, o que podem reduzir a precisão da detecção de DC. É ainda uma pergunta aberta como projetar um modelo de seleção de imagem satisfatória que elimina todas as células em metafase inadequados. O software fornece estimativas precisas para amostras expostas a doses mais elevadas de radiação (≥ 2 Gy). Apesar do considerável progresso na redução do número de falsos positivos de DCs¹⁶, esses objetos não foram eliminados. Reduzir as células de metafase qualidade em baixa dose de radiação (especialmente < 1 Gy) são mais propensas a falsos positivos na detecção DC. Portanto, amostras de baixa dose não foram incluídas ao gerar a curva de calibração utilizada para estimativa da dose de amostras de teste HC. No entanto, se uma curva contendo amostras de baixa dose é desejada, um valor mais baixo de SVM Sigma reduz falsas acusações positivas em amostras de baixa dose mas pode resultar em menor rendimento de DC em amostras de alta dose. Figura 8 compara a curva HC usada para estimativa da dose (Sigma = 1,5) com uma curva de calibração ajuste com amostras de dose adicional de baixo valor de sigma inferior SVM (1.0). Em amostras com um número insuficiente de células em metafase e/ou imagens de metáfase de má qualidade, pode não ser possível estimar com precisão os riscos biológicos em dose baixa, potencialmente resultando em desvios da física dose superior a 0,5 Gy.

O software com precisão não pode avaliar tipos de radiação se suas curvas dose-resposta melhores se ajustar a um modelo linear ou quase linear. Até então, ele foi testado somente com amostras expostas a - X e raios gama. Se outra fonte de radiação é examinada, os usuários devem assegurar amostras de teste e de calibração são expostas ao mesmo tipo de radiação. O software usa a máxima verossimilhança ou mínimos quadrados de encaixe para construir uma curva de dose-resposta, usando um modelo linear-quadrática. Atualmente, não há nenhuma opção para impor uma estrita curva linear caber, apropriado para exposições de partículas de alta energia, no entanto essa funcionalidade estará disponível no futuro.

Desenvolvimento futuro

Nossos esforços estão focados em melhorar os modelos de seleção de imagem e dose exata medida, em particular das amostras expostos a doses de radiação de baixa. As versões subsequentes do software fornecerá medições de erro padrão em estimativas de dose e intervalos de confiança sobre as curvas de calibração. Além disso, uma versão de alto-desempenho-computação do software para o supercomputador Blue Gene (BG/Q, IBM) está em desenvolvimento para uma avaliação atempada de indivíduos expostos em um evento de massa-baixa radiação. Alguns componentes do software já foram testados e implantados nesta plataformaLass = "xref" > 11.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automated Dicentric Chromosome Identifier and Dose Estimator (ADCI)	CytoGnomix	NA	ADCI software is released in a binary installation package file for Microsoft Windows 7, 8, 8.1 and 10; 235 Mb of disk storage are required for a typical installation. The software has been tested with Intel or AMD x86-64 processors; at least 1 Gb RAM is recommended. Analyses have been benchmarked on a computer configured with an Intel I7 processor and 16 Gb RAM. Operation of ADCI requires an active license and a USB-based hardware dongle, which must remain plugged in while the software is executing. The dongle encodes the software expiry date. Each time the software is started, this date is read. The software will allow access to the program if the current date and time precedes the expiration time-date stamp. Extending an expired software license can be accomplished by obtaining a new dongle or by renewing the license with an updated key at startup.
Digital images of metaphase cell nuclei	Examples: Metasystems, Leica Microsystems	M-Search (Metasystems), Cytovision (Leica) software	High resolution TIFF format; typically >250 digital images generated with a microscope imaging capture system (minimum 63X magnification objective, 10X magnification ocular).
MSI Leopard Pro (recommended, optional)	Micro-Star International	MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro	Multi-core performance workstation.