Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

Resumo

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Resumo

Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é o potencial ao longo da vida da retina teleósteos para retina neurogênese e regeneração após danos graves. Investigar os caminhos de regeneração no zebrafish pode trazer novas perspectivas para desenvolver estratégias inovadoras para o tratamento de doenças degenerativas da retina em mamíferos. Neste documento, enfocamos a indução de uma lesão focal da retina exterior no zebrafish adulto por meio de um laser de díodo 532 nm. Uma lesão localizada permite investigar os processos biológicos que ocorrem durante a degeneração da retina e regeneração diretamente na área de danos. Usando a tomografia de coerência óptica não-invasiva (OCT), fomos capazes de definir a localização da regeneração subsequente danificada área e monitor in vivo. Com efeito, imagens OCT produz imagens de alta resolução, transversais da retina zebrafish, fornecendo informações que anteriormente só existiam disponíveis com análise histológica. A fim de confirmar os dados de outubro em tempo real, realizaram-se cortes histológicos e resposta regenerativa após a indução da lesão da retina foi investigada por imuno-histoquímica.

Introdução

Visão é, provavelmente, o sentido mais essencial do ser humano e sua deficiência tem um alto impacto sócio-económico. No mundo industrializado, doenças degenerativas da retina representam a maioria da perda de visão e cegueira entre a população adulta de¹. Retinite pigmentosa (RP) é a causa herdada mais comum de cegueira em pessoas entre as idades de 20 e 60, afetando aproximadamente 1,5 milhões de pessoas em todo o mundo^2,3. É uma família heterogénea de desordens hereditárias da retina, caracterizada por perda progressiva dos FOTORRECEPTORES (PRs) seguido de degeneração do epitélio pigmentar da retina e, posteriormente, gliose e remodelação de neurônios interna⁴. O curso da doença pode ser explicado pela perda incremental a dois tipos de células PR, geralmente começando com as hastes, que são responsáveis pela visão acromática na penumbra e os cones, que são essenciais para cor visão e acuidade visual⁵. Um defeito único gene é suficiente para causar a RP. Até agora mais de 130 mutações em mais de 45 genes têm sido associadas com a doença⁶. Isto leva a diferentes fenótipos de doença e é uma razão que a terapia genética é não-generalizáveis e, portanto, uma abordagem terapêutica intrincada. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver novas abordagens terapêuticas gerais para tratar os degenerations retinais em cegueira doenças.

Degeneração da retina, muitas vezes envolve a perda do PR; Portanto, a morte celular de PR é uma característica dos processos degenerativos na retina⁷. Já foi demonstrado que a morte de célula PR estimula Müller glia célula (MC) ativação e proliferação⁸. MCs, o tipo de célula glial principais na retina vertebrado, foram considerados uma vez como nada mais do que uma "cola" entre os neurônios da retina. Nos últimos anos, muitos estudos têm mostrado que os MCs agir como mais do que mera estrutural suportam⁹. Entre as diferentes funções, MCs também participem neurogênese e reparar¹⁰. Com efeito, em resposta a fatores diffusible da retina degeneração, MCs aumentam significativamente a expressão de proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Portanto, GFAP rotulagem pode ser usado como um marcador para ativação de MC como uma resposta secundária a lesão da retina e degeneração¹¹.

Recentemente, nós desenvolvemos uma adaptação do romance de lesões focais, usando um laser para induzir a degeneração da retina no peixe-zebra (Danio rerio). Lesão focal é vantajoso para o estudo de certos processos biológicos, como a migração de células no local da ferida e o momento exato de eventos que ocorrem durante a regeneração da retina¹². Além disso, o zebrafish tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças entre o seu sistema visual e o dos outros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de humanos e teleósteos retinae exibem algumas diferenças. Por conseguinte, humanos e zebrafish retinae contêm as mesmas classes de célula principais organizadas no mesmo padrão em camadas, onde sensor de luz fotorreceptores ocupam a camada mais externa, enquanto os neurônios de projeção da retina, as células ganglionares, residem nas intimidades camada neuronal, proximal à lente. Os interneurônios da retina, o amacrine, bipolar e células horizontais, localizar-se entre o fotoreceptor e gânglio célula camadas¹³. Além disso, a zebrafish retina é cone-dominado e, portanto, mais próximo da retina humana que, por exemplo, a retina de roedor intensivamente estudada. Uma fascinante diferença entre teleósteos e mamíferos é a neurogênese persistente na retina de peixe e regeneração da retina após danos. No zebrafish, MCs podem dedifferentiate e mediar a regeneração em retina lesada^14,15. Frango, MCs têm alguma capacidade também para re-introduzir o ciclo celular e dedifferentiate. Após lesão da retina em peixes adultos, MCs adoptarem certas características do progenitor e células-tronco, migram para o tecido danificado da retina e produzem novos neurônios¹⁶. Gene expressão perfilação de mamíferos MCs revelou inesperadas semelhanças com progenitores da retina, e evidência de potencial neurogênica intrínseca de MCs no frango, roedores e retina humana está crescendo¹⁷. No entanto, porque a resposta regenerativa em aves e mamíferos é menor comparada com a resposta robusta em peixes não é ainda compreendida. Portanto, compreender os mecanismos de reparação endógena no zebrafish pode sugerir estratégias para estimular regeneração da retina em mamíferos e seres humanos. Empregar o mecanismo de reparação endógena de MCs como uma ferramenta terapêutica para o tratamento de pacientes com degeneração da retina teria um impacto notável para a nossa sociedade.

Neste documento, nós fornecemos as etapas necessárias para empregar o modelo de degeneração/regeneração em pesquisa oftálmica. Primeiro enfocamos induzindo focal danos na retina marcante, em seguida, sobre as imagens dos eventos, desenvolvendo-se no local da lesão e finalmente revelador envolvimento dos MCs adjacentes. O protocolo geral é relativamente fácil de executar e abre uma grande variedade de possibilidades para avaliar a retina depois.

Protocolo

todos os experimentos aderiu à instrução para o uso de animais em oftalmologia e visão pesquisas da Associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) e respeitar os regulamentos relacionados das autoridades governamentais.

1. animais

1. TgBAC manter (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 estirpe de (AB) com idade entre 6-9 meses em condições normais na água com uma temperatura de 26,5 ° C e um ciclo claro/escuro de 14/10 h ¹⁸.
2. Seguir as orientações de cuidados com animais das instituições envolvidas para as experiências em animais após aprovação pelas autoridades governamentais.

2. Anestesia sistêmica reversível

1. Prepare a solução-mãe de sal de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato etílico (tricaina) dissolvendo-se 400 mg de pó tricaina em 97,9 mL de água do aquário e 2,1 mL de 1 M de Tris tampão salino (TBS). Ajustar o pH 7.0 com 1 M Tris (pH 9) e loja a 4 ° C, no escura acima de um mês.
   Nota: Tricaina deve ser preparada em água como as condições de vida natural do animal, de preferência água de tanque original deve ser usada.
2. Diluir a solução-mãe 01:25 na água do tanque e use imediatamente.
3. Colocar o zebrafish em uma placa de Petri contendo 50 mL de solução de anestesia, até que eles ficam imobilizados e não respondem aos estímulos externos (aproximadamente 2-5 min, dependendo do peso e idade) de 10 cm.
4. Transferir cada peixe com a mão a um titular de pin de silicone feito sob medida para o tratamento a laser ( figura 1A).
   CUIDADO! Os peixes podem permanecer anestesiados fora do tanque para até 10 min só.
5. Para reverter anestesia após o tratamento e/ou imagem, coloque o peixe-zebra no recipiente contendo água de tanque.
6. Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.

3. Lesão Focal na Retina a laser

Nota: A 532 nm laser diode é usado para criar danos focais de luz na retina do zebrafish. A montagem experimental do laser permite o estabelecimento de uma lesão da retina focal pode ser reproduzido no zebrafish adulto.

1. Configurar a potência de saída do laser: 70 mW; diâmetro de antena: 50 µm; a duração do pulso: 100 ms.
   cuidado! O uso do laser requer proteção pessoal apropriada e rotulagem da área de.
2. Aplicar 1-2 gotas de hidroxipropilmetilcelulose 2% topicamente no olho antes do tratamento e usar uma lente de laser do fundo de 2,0 mm para concentrar o feixe do laser-com o objetivo na retina.
   CUIDADO! gotas de hidroxipropilmetilcelulose são viscosas e pode causar problemas em respirar se continua as brânquias.
3. Pontos de laser lugar quatro em torno do nervo óptico à esquerda do olho e usar o olho direito, tratado como controle interno.

4. Na vivo Imagem latente da morfologia retiniana

1. no dia 0, Visualizar a retina zebrafish diretamente após a indução do laser sem revivê-los da anestesia. Em todos os outros pontos de tempo, empregar a anestesia geral (ver secção 2: anestesia sistêmica reversível). Coloque o zebrafish imobilizado em um suporte de pino de silicone feito sob medida ( Figura 1 B, b. 1).
2. Para obter imagens ideais, cortar uma lente de contato do hydrogel comercialmente disponíveis para caber o olho de peixe-zebra (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, espessura de centro = 0,4 mm) por meio de um furador. Preencha a superfície côncava da lente com metilcelulose e coloque sobre a córnea.
3. Equipar o sistema OCT com uma lente de lâmpada de fenda sem contato 78D.
4. Foco imagem infravermelha (IR) no IR + modo OCT ( Figura 2A) para visualizar o fundo do olho e levar o IR fotos clicando o " adquirir " botão ( Figura 2B) para localizar o manchas na retina usando o sistema de laser ' software s.
Modo de
5. Visualize uma seção tridimensional das camadas da retina no OCT + IR e tirar as fotos, clicando o " adquirir " botão ( Figura 2B). Observar a gravidade da lesão na camada nuclear externa (ONL) (ver secção 3: lesão focal na retina a Laser) nestas imagens.
6. Reverter anestesia, após o tratamento e/ou imagem de lugar o zebrafish em um recipiente contendo água de tanque.
7. Para apoiar a recuperação, criar um fluxo de água do tanque fresco sobre as brânquias, movendo o zebrafish e para trás na água.
8. Executar semelhante na vivo imagens da morfologia da retina no dia 1, 3, 7, 14 e semana 6.

5. Hematoxilina & eosina (H & E) coloração

1. eutanásia zebrafish por submersão em frio (4 ° C) solução de anestesia no gelo pelo menos 10 min e enucleate os olhos imediatamente, por meio de pequenas pinças curvas.
2. Corrigir os olhos todo em paraformaldeído 4% (PFA) em solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C para 20 h e desidrata-se em seguida as amostras em uma série gradual do álcool (xileno 100% por 5 min duas vezes, etanol 100% por 5 min duas vezes, etanol 96% por 3 min duas vezes e etanol 70% 3 mi n uma vez).
   CUIDADO! PFA pode ser irritante para os olhos, nariz e faixa respiratória superior. PFA é um conhecido carcinógeno humano e um risco reprodutivo suspeito.
3. Incorporar as amostras em parafina, corte 5 µm seções ao nível da cabeça do nervo óptico e montá-los em lâminas de vidro.
4. Mancha as seções deparaffinized com solução de hematoxilina ácida 0,1% por 5 min e mergulhe os slides duas vezes em água destilada depois mergulhar as lâminas em uma mistura de ácido clorídrico (2 mL 25% HCl em 250 mL água destilada água) e amoníaco (amônia 25% 2 mL em 250 mL de mistura água destilada). Manchar as seções com eosina G solução aquosa 0,5% por 3 min após o desenvolvimento da coloração por água da torneira durante pelo menos 10 min. a hematoxilina
5. Montar as lâminas desidratadas em meio de montagem de resina acrílica e observar as lâminas ao microscópio de luz.

6. Imuno-histoquímica para a ativação de MC

1. aqueça as seções deparaffinized no buffer de recuperação de antígeno (Tris-EDTA + 0,05% de detergente não-iônico, pH 9.0) para 3 min em um navio apropriado ou um microondas por 10-15 min e lavar três vezes com TBS para 5 min cada.
2. Círculo, as seções com um silicone pen e adicionar 100 µ l obstrui a solução (TBS + soro normal de cabra 10% + 1% albumina de soro bovino, pH 7,6) em temperatura ambiente por 1 h.
3. Mancha com anticorpo policlonal de coelho de proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) e com antiglutamina sintetase (GS) anticorpo monoclonal de rato, ambos em uma diluição de 1: 200 (40 µ l por amostra). Incube o slide em uma câmara umidificado a 4 ° C durante a noite. Lavar três vezes com TBS + 0.1% Tween 20 por 5 min cada.
4. Visualização de acabamento com o apropriado anticorpos secundários. Este protocolo utilizado uma cabra de anti-coelho IgG H & anticorpo secundário L verde para GFAP e um anti-rato de cabra IgG H & vermelho brilhante L para GS, ambos em uma diluição de 1: 500 em temperatura ambiente por 1 h.
5. Montar as lâminas com meio de montagem contendo DAPI e observar os slides sob o microscópio de fluorescência.

Resultados

OCT em tempo real: a fim de analisar o papel dos MCs na reparação da retina, usamos um modelo de lesão laser induzindo uma zona bem delineada de danos na retina zebrafish. O site do dano foi fotografado por meio da OCT na vivo pela primeira vez (dia 0) dentro de 60 minutos após a lesão (Figura 3). Para compensar o sistema ótico do olho de peixe, uma lente de contato feito por foi colocada sobre a córnea. Imediatamente após o ...

Discussão

Regeneração/degeneração da retina no zebrafish foi investigada por abordagens diferentes, como de morte celular mediada por cytotoxin²², lesão mecânica²³e lesões térmicas²⁴. Utilizamos um laser de díodo 532 nm para danificar a retina do zebrafish. Desse modo, nosso modelo oferece várias vantagens. Por exemplo, rapidamente criamos uma área bem definida de lesões localizadas na retina exterior, especificamente na camada de fotorreceptores. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid hematoxylin solution	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2852
Albumin	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A07030
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	5470
Dako Pen	Dako, Glostrup, Danmark	S2002
DAPI mounting medium	Vector Labs, Burlingame, CA, USA	H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5%	Carl Roth, Arlesheim, Switzerland	X883.2
Ethanol	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	ED
Eukitt	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, Switzerland	A11020
Goat normal serum	Dako, Glostrup, Danmark	X0907
Hydrogel contact lens	Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland	n.a.	1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2%	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	n.a.	Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany	n.a.	532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody	Millipore, Billerica, MA, USA	MAB302
HRA + OCT Imaging System	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Spectralis
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany	n.a.	Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody	Invitrogen, Waltham, MA, USA	180063
Silicone pin holder	Huco Vision AG Switzerland	n.a.	Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland	n.a.
Slit lamp adapter	Iridex Corp., Mountain View, CA, USA	n.a.
Superfrost Plus glass slides	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain	KIT, Karlsruhe, Germany	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS)	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P5912
Tween 20	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	P1379
78D non-contact slit lamp lens	Volk Optical, Mentor, OH, USA	V78C
Xylene	Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland	534056
Ocular fundus laser lens	Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom	R2100-EU	Steamer