Preparação do hidrogel injetável à base de quitosana e sua aplicação em cultura de células 3D

Resumo

Aqui nós descrevemos uma preparação superficial de hidrogel injetável à base de quitosana usando química imina dinâmico. São apresentados métodos para ajustar a força mecânica do hidrogel e sua aplicação em cultura de células 3D.

Resumo

O protocolo apresenta um método fácil, eficiente e versátil para preparar hidrogel baseado em quitosana usando química imina dinâmico. O hidrogel é preparado misturando-se soluções de glicol quitosana com um gelator de polímero sintetizado benzaldeído finalizado e hidrogel com eficiência é obtidos em vários minutos à temperatura ambiente. Por razões diferentes entre quitosana glicol, gelator de polímero e conteúdo de água, obtêm-se versátil hidrogel com tempos diferentes de gelificação e rigidez. Quando danificadas, o hidrogel pode recuperar suas aparições e módulo de elasticidade, devido a reversibilidade das obrigações imina dinâmico como crosslinkages. Esta auto reparáveis propriedade permite que o hidrogel ser injetável, uma vez que pode ser auto curado de peças espremidas de um hidrogel em massa integral após o processo de injeção. O hidrogel é também multi sensível a muitos estímulos bio-ativos devido ao status de equilibração diferente das obrigações imina dinâmico. Este hidrogel foi confirmado como bio-compatível e células de fibroblasto de rato L929 foram incorporados procedimentos padrão e a proliferação das células foi facilmente avaliada por um processo de cultivo de células 3D. O hidrogel pode oferecer uma plataforma ajustável para diferentes pesquisas onde um mímico fisiológico de um ambiente 3D para as células é lucrou. Juntamente com suas propriedades multi responsivos, auto reparáveis e injetáveis, o hidrogel potencialmente pode ser aplicados como várias transportadoras para drogas e células em futuras aplicações biomédicas.

Introdução

Hidrogel é materiais de polímero reticulado com grandes quantidades de água e propriedades mecânicas macias, e eles têm sido usados em muitas aplicações bio-medical^1,2. Hidrogel pode oferecer um ambiente suave e molhado, que é muito semelhante ao ambiente fisiológico para células em vivo. Portanto, hidrogel tornaram-se uma das plataformas mais populares para cultura de células 3D^3,4. Em relação à cultura de pilha do prato de Petri 2D, cultura de células 3D avançou rapidamente para oferecer que uma matriz extracelular (ECM) imitou o microambiente para células de contato e montar para fins de proliferação e diferenciação⁵. Além disso, o hidrogel contendo polímeros naturais poderia oferecer biocompatível e promovendo ambientes para as células a proliferar e diferenciar³. Hidrogel derivado de polímeros sintéticos é preferidos para seus componentes simples e claras, que excluem influências complexas como as proteínas de origem animal ou vírus. Entre todos os candidatos de hidrogel para cultura de células 3D, hidrogel que facilmente é preparados e têm uma propriedade consistente é sempre preferidos. A facilidade para ajustar propriedades do hidrogel para atender necessidades diferentes pesquisas é importante como bem⁶.

Aqui apresentamos uma preparação superficial de um hidrogel de glicol baseado em quitosana usando química imina dinâmico, que se torna uma plataforma versátil de hidrogel para cultura de células 3D⁷. Neste método, conhecido biocompatível glicol quitosana são usados para estabelecer quadros de redes do hidrogel. Seus grupos aminoácidos são reagiu com um glicol de polietileno benzaldeído encerrado como o gelator de polímeros que formam ligações de imina dinâmico como crosslinkages de hidrogel⁸. Obrigações de imina dinâmico podem formar e decompor reversível e responsiva ao redor, dotando o hidrogel com quitosana mecanicamente ajustável redes^9,10,11. Devido ao seu conteúdo de água de alto, materiais biocompatíveis e forças mecânicas ajustáveis, o hidrogel é aplicado com sucesso como um andaime para células L929 em cultura de células 3D^12,13. O protocolo aqui detalha os procedimentos, incluindo a síntese de polímeros gelator, preparação de hidrogel, incorporação de célula e cultivo celular 3D.

O hidrogel também mostra várias outras características devido a sua crosslinkages de imina dinâmico, incluindo sua multi responsivo aos vários estímulos bio-(ácido e pH, piridoxal derivados de vitamina B6, papaína de proteína, etc), indicando que o hidrogel pode ser induzido a decompor-se sob condições fisiológicas⁸. O hidrogel é também auto reparáveis e injetável, o que significa que o hidrogel pode ser administrado através de um método de injeção invasiva mínima e ganhar uma vantagem em droga e célula entregas^14,15. Pela adição de aditivos funcionais ou gelators de polímero preconcebidos específico, o hidrogel é compatível para obter propriedades específicas como magnética, temperatura, pH-responsivo, etc.^16,,¹⁷, que pudesse cumprir um ampla gama de requisitos de pesquisa. Essas propriedades revelaram capacidade potencial do hydrogel ser um injetável várias transportadoras para drogas e células em ambos in vitro e em vivo pesquisa biomédica e aplicações.

Protocolo

atenção: favor consultar todas as fichas de dados de segurança (MSDS) antes do uso. Por favor, use as práticas de segurança adequadas ao realizar experimentos de química, incluindo o uso de uma coifa e equipamento de protecção pessoal (óculos de segurança, luvas de proteção, jaleco, etc.). O protocolo exige célula padrão manipulação técnicas (esterilização, recuperação da célula, célula passagem, congelamento de célula, coloracao celular, etc).

1. preparação do hidrogel

1. síntese do benzaldeído finalizado di-acrescida de polietileno glicol (PEG DF)
   1. pré-dessecação de PEG polímero
      1. pesar 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), transferir para um balão de fundo redondo (250 mL) e adicionar tolueno (100 mL).
         Nota: Outras PEGs com diferentes pesos moleculares pode trabalhar para a formação de hidrogel, mas levará a rigidez diferente.
      2. Aquecer a solução por uma pistola de calor (ou um prato quente em torno de 40 ° C) ligeiramente para ajudar a dissolver todos os polímeros. Depois de dissolvem todos os polímeros, use um evaporador para remover todos os solventes. Repita esse processo seco e dissolver duas vezes tornar o PEG secado polímeros.
         Atenção: Esta deve ser executada em uma coifa com extremo cuidado. Tolueno é inflamável.
   2. Reação de terminação benzaldeído de PEG
      1. Adicionar um agitador magnético e tetrahidrofurano (THF, 100 mL) no balão e dissolver PEG, utilizando um agitador. Adicionar 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0,07 g, 0,6 mmol) em sequência para as soluções para dissolver todos os sólidos completamente.
      2. Add N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) para a solução e adicionar um tubo de secagem que é preenchido com anidro CaCl ₂ para o balão. Manter a reação sob agitação à temperatura ambiente (~ 20 ° C) por cerca de 12 h.
   3. Processo de pós-reação
      1. filtrar os sólidos brancos gerados na solução por vácuo, depois que a reação é terminada. Despeje a solução em éter dietílico frio (500 mL) sob agitação para precipitar os sólidos brancos. Reunir todos os sólidos brancos pelo filtro e seque os sólidos em uma coifa.
      2. Dissolver os sólidos brancos em THF novamente, filtrar qualquer sólidos insolúveis brancos, despeje a solução de éter dietílico frio fresco para precipitar os sólidos brancos e secá-lo. Repita este processo de duas a três vezes e em seguida, coloque os sólidos brancos em um forno de secagem a vácuo (20 ° C, 0.1 mbar) para secá-los completamente. Recolher o pó branco como o produto final: benzaldeído finalizado PEG DF.
2. Preparação do hidrogel
   1. pesar quantidades diferentes de PEG DF (0,11 g, 0,028 mmol g 0,22, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) em um tubo (10 mL), adicionar água desionizada (5,0 mL) e use um vórtice ou agitador magnético para ajudar dissolver o polímero.
   2. Dissolver glicol quitosana (0,495 g, 6.18 x 10 ^-3 mmol) em água desionizada (15,0 mL) em um tubo (50 mL) e usar um vórtice por alguns minutos para homogeneizar a solução de quitosana (3% em peso).
   3. Adicionar a solução de quitosana glicol (0,2 mL, 3% em peso) e soluções DF PEG (0,2 mL) sequencialmente em um tubo (2,0 mL). Use um vórtice para misturar as soluções homogênea de hidrogel forma em vários minutos. Siga as proporções na tabela 1 tornar hidrogel de forças mecânicas diferentes.
      Nota: Use o método do tubo-invertendo para determinar se o hidrogel já formou.
3. Análises de reologia
   1. efectuar análises de reologia em um rheometer rotatória com uma placa de aço paralela (diâmetro: 20 mm). Para o teste de gelificação, espalhe o glicol solução de quitosana (0,2 mL, 3% em peso) em uma placa inferior. Em seguida, adicionar DF PEG soluções aquosas (0,2 mL, 2% em peso) gota uniformemente sobre a superfície da solução de quitosana e misture rapidamente com uma pipeta. Abaixe a placa superior e iniciar para teste
   2. De hidrogel ' s teste de rigidez, cortar um círculo um hidrogel (diâmetro: 20 mm) e medir o módulo de armazenamento (G ') valores contra as análises de frequência na estirpe de 1%. G típico ' valores a 6,3 rad s ^{− 1} estão listados na tabela 1.
      Nota: Efectuar as análises de reologia do hidrogel 0,5 h após a formação de hidrogel para assegurar a estabilização de vínculo dinâmico do hidrogel.
   3. Para o hidrogel ' s auto reparáveis Propriedade testar, cortar um hidrogel em pedaços e juntar os pedaços de auto-recuperação de uma peça integrante. Em seguida, corte a peça de hidrogel para fazer um círculo (diâmetro: 20 mm) e colocá-lo sobre o rheometer para realizar a análise de reologia.

2. cultivo de célula 3D em hidrogel

1. preparação de soluções de gelificação de hidrogel
   1. pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) em um tubo estéril (4,0 mL), adicionar em meios de cultura celular (RPMI-1640, 2.0 mL) e usar um vórtice ou agitador para ajudar a dissolver o polímero para obter a solução de polímero (20% em peso). Carregar a solução em uma seringa (10,0 mL) e então ele esterilizar por passagem através de um filtro de bactérias-retentiva mícron (0,22 µm).
   2. Pesar a quitosana de glicol (0,165 g, 2,06 x 10 ^-3 mmol) em um tubo estéril (15,0 mL), adicionar em meios de cultura celular (RPMI-1640, 4,0 mL) e o vórtice para ajudar a dissolver o polímero para obter a solução de quitosana glicol (4,0% em peso). Carregar a solução em uma seringa (10,0 mL) e filtrá-la com um filtro de 0,22 µm bactérias-retentiva.
2. Cultivo celular em hidrogel
   atenção: executar todos os procedimentos relacionados em uma capa de cultura de tecidos de células. Conhecimentos básicos de técnica estéril é esperado.
   1. Preparação da suspensão de células
      1. células L929 cultura RPMI-1640, suplementado com 10% FBS, 5% de penicilina (10 mL) em uma Petri prato (diâmetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂. Mudar o meio todos os dias antes de usar.
      2. Colher as células L929 com PBS contendo tripsina (0,025% do w/v) e EDTA (0,01% w/v), centrifugar (70 x g, 5 min) e ressuspender as células em meio RPMI-1640 (1,0 mL). Realize a contagem de células usando a operação padrão da placa de contagem de sangue. Ressuspender as células para ajustar a concentração de células para ~ 3,75 × 10 ⁶ células/mL.
   2. Encapsulamento de célula em hidrogel
      1. misturar as suspensões de células L929 (0,4 mL, 3,75 x 10 ⁶ células mL ^-1) com solução de quitosana glicol (0,4 mL) em um tubo (4,0 mL) pelo vórtice. Pipetar a solução de quitosana L929/glicol (0,8 mL) para o centro de um prato de Petri confocal (diâmetro 2,0 cm). Pipetar as DF PEG soluções (0,2 mL) para o mesmo prato e pipetar delicadamente para misturar a solução e induzir a formação de hidrogel.
         Nota: Avaliar a formação de hidrogel inclinando o prato de petri.
      2. Para cultura de células direta, adicionar quantidades adicionais de meios de cultura RPMI-1640 (1,0 mL) em cima do hidrogel. Colocar a célula incorporada hidrogel (1,0 mL, 1.5 wt % glicol quitosana, 4,0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 ⁶ células mL ^-1) em uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) e altere o meio todos os dias. Prepare-se para a imagem latente de célula no dia 1, 3, 5 e 7 após encapsulamento celular.
   3. Para a pós-cultura de células 3D em hidrogel após a injeção, preparar celular carregado hidrogel (1,0 mL, consulte a etapa 2.2.2) numa seringa (10,0 mL, agulha 48 G). Após as formas de hidrogel, injetar o hidrogel lentamente em uma placa de Petri para a imagem latente confocal. Adicionar um montante adicional de meios de cultura (1,0 mL) em cima do hidrogel e alterá-lo todos os dias. Coloque o prato de Petri em uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂) e prepare-se para a imagem latente depois.
      Atenção: Verifique e seguir o protocolo de operação de segurança de uma seringa.
3. Análise de viabilidade de células
   1. Confocal observação
      1. Enxaguar o hidrogel com PBS (1,0 mL) por duas vezes. Mancha o hidrogel com diacetato de fluoresceína (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) e soluções de propidium iodeto (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) por 15 min. Depois da coloração, remover todos os solventes.
      2. Observar o hidrogel usando um microscópio confocal em comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 543 nm a visualização ao vivo e mortos células, respectivamente. Leva pilhas através de cada profundidade de 2 µm do hidrogel para validar uma distribuição uniforme de células ao longo de z.
         Nota: FDA manchas de células vivas enquanto PI manchas de células mortas.
   2. Degradar o hidrogel (1,0 mL) com ácido acético (HAc, 3% de v, 1,0 mL) por 5 min e pipetar para um tubo (4,0 mL). Coletar as células por centrifugação (70 x g, 5 min) e ressuspender as células em meio de cultura RPMI 1640 celular (1,0 mL). Executar célula contagem usando um sangue contagem placa.

Resultados

Uma apresentação esquemática do presente protocolo na preparação do hidrogel e seu uso como cultura de células 3D é oferecida na Figura 1. Informações do hidrogel conteúdo e rácios, preparados com diferentes forças mecânicas estão resumidas na tabela 1. O hidrogel é auto reparáveis e reologia Propriedade apresenta rigidez do hidrogel por módulo de armazenamento versus teste de frequência na Figura 2. As imagens confocal de cél...

Discussão

O hidrogel apresentado neste protocolo (Figura 1) tem dois componentes principais: a polímero natural quitosana de glicol e um sintético benzaldeído encerrado gelator polímero PEG do DF, que são ambos os materiais biocompatíveis. Síntese do DF PEG é apresentado utilizando uma reação de modificação de uma etapa. PEG, de peso molecular 4.000 foi escolhida no presente protocolo em preocupações de solubilidade, eficiência de modificação, bem como rigidez de hidrogel. Uma série ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST