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Resumo

O objetivo do presente protocolo é permitir detecção de in vivo matando de uma célula-alvo em um modelo murino de antígeno-específicas.

Resumo

Metodologias atuais para matar antígeno-específicas são limitadas para uso em vitro ou utilizadas em modelos de doenças infecciosas. No entanto, há não um protocolo especificamente concebido para medir o antígeno-específicas matança sem uma infecção. Este protocolo é projetado e descreve métodos para superar essas limitações, permitindo a detecção de antígeno-específicas matando de uma célula-alvo por CD8+ T células na vivo. Isso é realizado através da fusão de um modelo de vacinação com um alvo marcado CFSE tradicional matando o ensaio. Esta combinação permite que o pesquisador avaliar o potencial CTL antígeno-específicas diretamente e rapidamente como o ensaio não é dependente do crescimento do tumor ou infecção. Além disso, a leitura é baseada em citometria de fluxo e assim deve ser facilmente acessível para a maioria dos pesquisadores. A principal limitação do estudo é identificar o cronograma na vivo que é apropriado para a hipótese a ser testada. Variações na força de antigénio e mutações nas células T que podem resultar em função citolítica diferencial precisam ser cuidadosamente avaliada para determinar o momento ideal para colheita da pilha e avaliação. A concentração apropriada de peptídeo de vacinação foi otimizada para hgp10025-33 e óvulos257-264, mas ainda mais validação seria necessária para outros peptídeos que podem ser mais adequados para um determinado estudo. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Introdução

Múltiplos protocolos existem para avaliar o potencial (CTL) citolítica de um CD8+ ou CD4+ células T. Esta avaliação pode ser facilmente feita em vitro sob condições controladas1,2,3. Além disso, modelos de doenças infecciosas, tais como LCMV, classicamente têm examinado a função CTL através do uso de diferencialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetato succinimidil éster) rotulada nas células-alvo onde o CFSEOi-pilhas etiquetadas são pulsado com um peptídeo e CFSEEis-etiquetado alvo, as células são deixadas unpulsed. As células são então injetadas na proporção de 1:1 e avaliados em relação à perda do CFSEOi-etiquetados pulsados alvos por citometria de fluxo4. Modelos de vacina e rejeição também usaram estratégias semelhantes para avaliação do na vivo matando por ambos os CD8+ e CD4+ T células bem como NK células5,6. Isto é um ensaio poderoso, mas requer o uso de agentes infecciosos que encha o sistema imunológico antes da injeção do alvo.

Este protocolo, por outro lado, não requer nenhuma infecção prévia do host e em vez disso, utiliza uma estratégia de vacinação para prime o sistema imunológico antes da injeção do alvo. Esta vacinação é composta por uma formulação à base de água de vacina de peptídeo que exige a prestação de um cocktail de immunostimulatory chamado covax7, consistindo de um receptor Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod creme), uma agonística anti-CD40 anticorpo e a interleucina-2 (IL-2) levando a combinação sinérgica de immunostimulatory agentes para o levantamento de escorva de peptídeo específico e robusta resposta imune. Como tal, este ensaio fornece uma leitura rápida da função CTL como a vacina é administrada junto com as células para avaliação da função de apenas três dias antes da injeção das células alvo. Além disso, a preparação de covax é forte o suficiente para que a capacidade de abate da célula T antígeno-específicas aprontada pode ser vista entre 4 e 24 h após a injeção.

A principal limitação do presente protocolo é identificar o cronograma na vivo para a detecção de matança de destino que é apropriada para o antígeno e a hipótese a ser testada. Cuidadosa avaliação deve ser realizada, como variações na força de antígeno, bem como alterações genéticas sendo testado em células T pode resultar em função CTL diferencial que exigiria uma detecção de temporização diferente de matar alvo. Além disso, enquanto que a concentração adequada de peptídeo para vacinação foi otimizada para melanoma humano antígeno glicopeptídeo 100 (hgp10025-33) e ovalbumina257-264 (óvulos257-264)8,9 , uso de outro modelo de antígeno que pode ser mais apropriado para um determinado estudo exigiria mais validação. Por causa de diferenças antecipadas na capacidade dos antígenos um alvo para estimular a função efetora CTL em combinação com o covax como adjuvante, otimização da frequência de concentração e dose de dose IL-2 pode ser essencial para atingir o objetivo desejado. Em geral, este protocolo permite uma avaliação rápida de matar função na vivo e pode ser adaptado a qualquer determinado antígeno.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e institucional Cuidado Animal.

1. preparação de peptídeo para a vacina

  1. Dissolver o liofilizado peptídeo com fosfato salino (PBS) para a concentração adequada e vórtice para 30 s.
    Nota: Para hgp10025–33, a concentração final é de 1 mg/mL e para óvulos257–264, a concentração final é de 0,5 mg/mL. Reconstitua o peptídeo antes da injeção. Não guarde após reconstituição.

2. isolamento de Splenocytes de rato transgénico

Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.

  1. Eutanásia o rato transgénico OT-1 usando o método de asfixia aprovado CO2 e remover o baço.
    Nota: Rato transgénico apropriado é utilizado nesta etapa específico para o peptídeo de escolha.
    1. Coloque o mouse do seu lado direito. Pulverize o lado esquerdo do mouse com 70% de etanol (EtOH). Puxe a pele usando fórceps e cortar a pele com uma tesoura cirúrgica; o baço será visível dentro da cavidade peritoneal. Delicadamente abri a cavidade peritoneal para acessar o baço. Remova o baço usando fórceps.
  2. Desagregar o baço por colocá-lo em um filtro de 70 µm em uma placa de Petri com 2 mL de meio A (PBS com 1% de soro fetal bovino (FBS)) e o esmagamento do baço com o fim de um êmbolo.
    1. Recolha os splenocytes da placa de Petri e coloque em um tubo cónico de 50 mL. Lave o tubo de ensaio com 5 mL de meio A duas vezes para coletar todas as células. Adicionar meio um up de 25 mL e centrifugar as células durante 5 min à temperatura ambiente a 475 x g.
  3. Aspirar as células e ressuspender em 1 mL / por tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) baço. Incubar em temperatura ambiente por 5 min. adicionar 10 mL de meio A centrífuga à temperatura ambiente em 475 x g. resuspenda o pellet em 10 mL de meio A e remover detritos filtrando a suspensão de células através de um filtro de 70 µm em um limpo 50ml cónico.
  4. Contar as células usando trypan azul e um hemocytometer. Ressuspender as células em PBS para uma concentração final de 106 -6 de 100 células/mL. Para óvulos257–264 específicos matando, resuspenda em 106 células/mL e para hgp10025–33 específicos matando, resuspenda em 1006 células/mL.
    1. Girar as células restantes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em 15 mL PBS fria para lavar as células. Repita a etapa de lavagem mais uma vez. Girar as células à temperatura ambiente durante 5 min à 475 g. x aspirar o sobrenadante e ressuspender em PBS fria de acordo com o volume final determinado na etapa 2.4.
    2. Suspensão de célula única de transferência para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e manter no gelo até injeção no destinatário C57/BL6 rato.

3. injeção de Splenocytes de ratos transgênicos

  1. Coloque destinatário C57/BL6 rato em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única (secção 2) por via intravenosa na veia de cauda, utilizando uma agulha 27G com o lado de bisel voltado para cima.

4. Covax administração

Nota: Se as células são injetadas no período do tarde, covax deve ser administrado na manhã seguinte até 18 horas após injeção de célula.

  1. Coloque o mouse em uma caixa clara anestesia com isoflurano 1-3%. Depois que os ratos são totalmente anestesiados, transferi os ratos para os cones de nariz ligados ao colector da câmara de anestesia. Manter os ratos contidos com o lado dorsal acima.
    Nota: Anesthetization é confirmado por uma pitada de dedo breve para verificar se que uma resposta de retirada não é eliciada. A lei federal limita o uso de isoflurano na ordem de um veterinário licenciado.
  2. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Injetar 100 µ l de solução de peptídeo (da seção 1) por via subcutânea com uma agulha de 27G com a seringa penetrando 4-5 mm na região base da cauda, a agulha cónica virados para cima.
    Nota: Os ratos são vacinados em um flanco com injeção subcutânea na base da cauda10.
  3. Injete 100 µ l anti-CD40 anticorpo (0,5 mg/mL de caldo) lateralmente o local da injeção de vacina.
  4. Aplique cuidadosamente imiquimod creme 50 mg/rato sobre os locais de vacinação. Esfregue o creme de imiquimod na superfície até que o creme não é mais visível e é totalmente absorvido.
  5. Injetar 100 µ l de proteína de 100.000 UI/mL rhIL-2 intraperitonealmente (i.p.) na região abdominal inferior. Observe os ratos por 5 min após eles recuperarem totalmente da anestesia.
    Nota: Experimento é uma pausa neste ponto por 3 dias.

5. isolamento dos Splenocytes alvo para etiquetar com CFSE

Nota: O isolamento de células do baço deve ser executado de forma estéril.

  1. Abater os camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 . Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.
  2. Remova as células para a contagem usando um hemocytometer e calcular para uma concentração final de células em 106 células/mL em solução CFSE-rotulagem (descrita na etapa 7). Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..

6. o peptídeo pulsando de alvo Splenocytes

Nota: Peptídeo pulsando deve ser executada de maneira estéril.

  1. Ressuspender as células em 106 células/mL em mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)). Divida as células em 2 tubos (cônicas de 15 mL). Rotule cada tubo como pulsado ou unpulsed.
  2. Adicione o peptídeo para o tubo rotulado pulsada. Para óvulos257–264 pulsando, adicionar 1 µ g/mL e para hgp10025–33 pulsando, adicionar 2 µ g/mL.
    Nota: As células unpulsed submeter-se a incubação mesma como as células pulsadas só que sem a adição do peptide.
    1. Incube as células + peptídeo a 37 ° C por 1h.
  3. Adicionar 10 mL de mídia completa (RPMI 1640 mídia com 10% FBS, 1% L-glutamina (Gln-L), 1% penicilina/estreptomicina (caneta/Strep)) para cada tubo de lavar ambos pulsado e unpulsed nas células-alvo. Gire as células remanescentes à temperatura ambiente durante 5 min à 475 x sobrenadante de aspirado de g..

7. preparação de CFSE para etiquetar Splenocytes alvo

  1. Preparar a solução de criação de etiquetas CFSE durante a célula lavar na etapa 6.3; as células pulsadas serão rotuladas como CFSEOi e o unpulsed como CFSEEis. Prepare-se 1 mL de solução CFSE-rotulagem de 106 células.
    Nota: CFSE é sensível à luz e deve ser protegido da luz em todos os momentos.
    1. Preparar CFSEOi -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução de 5 mM) para uma concentração final de 5 µM/mL na mídia RPMI 1640 com 2% FBS.
    2. Preparar CFSEEis -rotulagem mídia adicionando 1 uL/mL CFSE (solução 0,5 mM) para uma concentração final de 0,5 mídia µM/mL RPMI 1640 com 2% FBS.

8. rotulagem dos Splenocytes alvo com CFSE

Nota: CFSE rotulagem deve ser executada de maneira estéril.

  1. Ressuspender as células alvo pulsado e unpulsed (da etapa 6.3) em 106 células/mL CFSE-rotulagem meios de comunicação. Ressuspender as células pulsadas com preparados CFSEOi-rotular a mídia e as células unpulsed com preparados CFSEEis-rotulagem mídia.
  2. Mistura de células e mídia CFSE-rotulagem por inversão suave ou agitação. Não misture num Vortex. Incubar as células e mídia CFSE-rotulagem a 37 ° C durante 15 min. Remix as células cada 5 min.
  3. Adicione 10 mL de mídia completa de células de suspensão e girar cada célula em temperatura ambiente por 5 min a 475 x g.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS frio. Gire as células a 4 ° C por 5 min a 475 x g.
  5. Repita a etapa 8.4.
  6. Contar as células e a mistura do peptide-pulsado, CFSEOi-rotulado com unpulsed, CFSElo-rotulado células na proporção de 1:1 para injeção em ratos destinatários. Manter uma alíquota de 1 x 106 misturada de células a ser usado para uma avaliação de citometria de fluxo da linha de base (seção 11).
    Nota: O volume final para injeção é de 100 µ l por rato. A contagem de células final é 10e6 células. Perda do volume na seringa e agulha precisa ser levado em conta e deve ser estimada em 500 µ l.

9. injeção de células-alvo

Nota: Mantenha células CFSE-etiquetadas, protegidas da luz, antes e durante a injeção, tanto quanto possível.

  1. Coloque destinatários camundongos C57BL/6 em uma retenção com o lado dorsal. Pulverizar a superfície de base de cauda de injeção com álcool isopropílico a 70%. Administre 100 µ l de suspensão de célula única por via intravenosa na veia da cauda com o lado de bisel voltado para cima.

10. re-isolamento de células-alvo

Nota: O timing desta etapa é crítica e dependente da citotoxicidade CTL e a força do antígeno para a estimulação. Para avaliação de matar um alvo264 -pulsado óvulos257–, as células precisam ser colhido 4-6 h após a injeção. Desde que as células CFSE-etiquetados são luz sensíveis, processos baços no escuro.

  1. Eutanásia os destinatários camundongos C57BL/6 de acordo com o método de asfixia aprovado CO2 .
  2. Remova spleen(s) como na etapa 2.1.1. Desagregar o baço e lavar splenocytes como em passos 2.2.1 - 2.2.3. Lyse pilhas de sangue vermelhas como em etapas 2.3 - 2.3.2.
  3. Ressuspender as células em uma célula de fluorescência ativada 1 mL classificação Reserva (FACs) (1% de BSA + PBS) para avaliação por citometria de fluxo.

11. retenção de lógica para determinar a atividade CTL por citometria de fluxo

  1. Realize a avaliação da atividade CTL usando um protocolo de citometria de fluxo padrão. Adquira as células usando o canal FITC em um citômetro de fluxo com um 488 nm laser para excitação11.
    1. Portão em linfócitos ao vivo usando os parâmetros de dispersão (SSC) dispersão direta (FSC) vs lado. Subjulgá dentro do portão de linfócitos ao vivo para a população total de CFSE-positivo.
      Nota: As células injetadas CFSE-rotulado comporão um pequeno subconjunto dos linfócitos totais presentes no baço. As células de CSFE-positivo devem aparecer como duas populações distintas sobre a escala logarítmica.
    2. Use um formato de histograma para determinar a porcentagem do unpulsed (esquerdo pico, CFSEEis) e pulsado (certo pico, CFSEOi) populações. Perda das CFSEOi células indica atividade CTL antígeno-específicas.

Resultados

Antes da injeção de células-alvo CFSE-etiquetadas, a mistura de 1:1 célula é executada em um citômetro de fluxo para determinar as frequências de linha de base de ambos o CFSEOi e CFSEEis nas células-alvo. Figura 1 A mostra a estratégia associada para detectar mudanças nas populações CFSE, um portão inicial é feito usando parâmetros de FSC e SSC. As células CFSE positivo totais então são subgated antes ...

Discussão

Enquanto este protocolo é simples, existem alguns passos críticos que devem ser executados com cuidado. A escorva covax após injeção da antígeno-específicas células T sendo testada é necessária ver qualquer matança dos alvos pulsados. Embora seja possível que a vacinação covax à base de água cria uma condição inflamatória aguda, para a fase inflamatória crônica, substituindo a formulação de curta duração à base de água com uma abordagem baseada em óleo de liberação lenta-antigénio pode prod...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela pesquisa de NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), concessão de pesquisa institucional (RN), start-up conceder (RN) e semente de MD Anderson CIC concede (RN).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice Charles River027C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod cream 5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specific mAb BioXcellBE0016-2clone FGK4.5
rhIL-2 protein Hoffman LaRoche Inc136Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Phosphate Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079fetal bovine serum
RBC lysis buffer Life TechnologiesA10492-01red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicillin/streptomycin
CFSELife TechnologiesC345545-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)Sigma A4503
1.5 mL MCT graduated natural Fisher05-408-129microcentrifuge tube
70% ethanolFisherBP8201500EtOH
Trypan blue solution, 0.4%  Life Technologies15250-061
HemocytometerFisher267110
27 gauge needleBD305109
1 mL syringeBD309659

Referências

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
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  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

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