Avaliação dos efeitos endócrinos compostos no desenvolvimento da função de vertebrados Rede Neural utilizando eletrodos multi matrizes

Resumo

Exposição a toxinas ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento de embriões. Endócrinos produtos químicos tais como bisfenóis são conhecidos por afetar o sistema nervoso. Aqui descrevemos um protocolo utilizando um modelo de rede neuronal in vitro vertebrado (embrião do pintinho) para estudar o impacto funcional de exposição toxina em embriões adiantados.

Resumo

Bis-fenóis, como bis-fenol A (BPA) e bis-fenol-S (BPS), são polimerização agentes amplamente utilizados na produção de plásticos e inúmeros produtos de uso diário. Eles são classificados como compostos desreguladoras endócrinos (EDC) com estradiol-como propriedades. A exposição prolongada a CDE, mesmo em doses baixas, tem sido associada com vários defeitos de saúde, incluindo câncer, distúrbios comportamentais e infertilidade, com maior vulnerabilidade durante períodos do desenvolvimento precoce. Para estudar os efeitos do BPA sobre o desenvolvimento da função neuronal, usamos um em vitro neuronal rede derivado do cérebro embrionário precoce garota como um modelo. Nós achamos que a exposição ao BPA afetou o desenvolvimento da atividade de rede, especificamente picos de atividade e sincronização. Uma mudança na atividade de rede é a ligação crucial entre o alvo molecular de uma substância ou composto e seus efeitos no resultado comportamental. Eletrodo multi matrizes são cada vez mais ferramentas úteis para estudar os efeitos das drogas na rede atividade in vitro. Existem vários sistemas disponíveis no mercado e, embora haja variações no número de eletrodos, o tipo e a qualidade da matriz de eletrodo e o software de análise, os princípios básicos subjacentes, e os dados obtidos é a mesma em toda a diferentes sistemas. Embora atualmente limitado a análise bidimensional em vitro culturas, estes sistemas MEA estão sendo melhorados para habilitar na vivo atividade da rede em fatias de cérebro. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para exposição embrionária e gravar a atividade da rede neuronal e sincronia, juntamente com resultados representativos.

Introdução

4, 4 '-Isopropilidenodifenol, comumente referido como bisfenol-A, ou BPA, é um aditivo antioxidante encontrado em uma ampla variedade de policarbonato e produtos de resina à base de epóxi variando de papel térmico, CDs e despedaçar-se prova de vidro, no interior do revestimento de latas de bebidas. Embora o BPA é conhecido por ser um agente desreguladoras endócrino que imita o estrogênio¹, estudos sobre seus efeitos doentes devido à exposição casual todos os dias ao BPA principalmente saíram nos últimos 10 a 15 anos. As consequências do mesmo níveis baixos de exposição BPA são mais profundas nos primeiros períodos do desenvolvimento, incluindo durante a embriogênese, através da exposição de mães^2,3. Exposição no útero de embriões a endócrinos produtos químicos também tem sido associada a suscetibilidade a doenças aumento de vaginal para câncer de mama^4,5. Estudos em animais demonstraram que a exposição ao BPA leva a estrutura cerebral atípico e anormalidades funcionais que se manifesta no comportamento⁶. Como consequência, o uso do BPA nos biberões infantis foi proibido pelas agências reguladoras mais na Europa e América do Norte, incluindo a FDA. Para cumprir com regulamentos, muitos fabricantes mudaram-se para 4, 4'-sulfonyldiphenol ou Bisfenol-S (BPS). Baseado no fato de que o BPA e BPS são análogos estruturais e que relatórios recentes mostraram potência comparável de BPS na transcrição estrogênicos⁷, é importante estudar a toxicidade deste composto em relação ao BPA.

Aqui descrevemos um protocolo para testar os efeitos do BPA (e outros CDE) em redes de neurônios, usando um modelo de vertebrados, o embrião do pintinho. In vitro de culturas de neurônios formam contatos sinápticos e geram potenciais de ação (também chamados de picos). A atividade de cravação dessas culturas pode ser gravada usando sistemas de multi eletrodo matriz (MEA). Picos são considerados em sincronia quando ocorrem dentro de 5 ms do outro. Inicial atividade aleatória de cravação que eventualmente sincroniza é uma característica-chave do desenvolvimento de redes neuronais^8,9. Sincronia pode ser medida usando vários métodos e vários algoritmos são descritos na literatura^9,10,11. Em nossas análises, utilizamos um algoritmo desenvolvido pela Paiva e colegas de trabalho,¹² que está integrada no software de gravação que impulsiona o sistema de aquisição de MEA. A atividade de cravação robusta de neurônios embrionários garota oferece um protótipo para estudar o efeito do BPA na rede neural atividade¹³. Usando matrizes de multi eletrodos para atividade de cravação recorde, observamos que a exposição BPA inibe o desenvolvimento de sincronia cravação neuronal^9,14. Aqui, nós fornecemos uma metodologia detalhada para estudar a exposição BPA em neurônios de embrião pintinho na cultura juntamente com resultados representativos sobre o desenvolvimento de sincronia de cravação neuronal em culturas embrionárias de garota.

Protocolo

O protocolo abaixo tem sido padronizado para testar os efeitos da exposição BPA durante a embriogênese (início) e pode ser modificado para uso com BPS, BPF ou outro EDC em neurônios embrionários de garota.

Este protocolo segue as políticas institucionais da Universidade do estado de Delaware e a política de NIH para embriões aviários. O protocolo também está na confirmação do DSU material e as orientações de segurança química.

1. material instalação

1. Dissolva o BPA (m.w. 228.29) em etanol a 10% (v/v) em água para fazer uma solução stock de 1 mM (0,23 mg / mL de 10% de etanol). Faça diluições subsequentes (0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM) em neurobasal médio.
   Cuidado: BPA é uma toxina ambiental e deve ter cuidado ao manusear o pó.
2. Incubar ovos pintinho em uma incubadora do ovo do tabletop comercialmente disponível a 37 ° C. Incube os ovos durante 7 dias para E7 embriões.
3. Preparar medidas esterilize o número necessário de MEAs por imersão em etanol a 70% para 3 a 4 h e depois enxaguar três vezes em cerca de 10 mL de água destilada estéril no bairro BSLII.
   Nota: A MEAs contêm 64 eletrodos de platina nanoporous, organizados em uma grade de 8 x 8. O diâmetro do eletrodo é 30 µm e o espaçamento entre os eletrodos é 200 µm. Não utilize álcool etílico desnaturado para esterilizar a MEAs como isto conduzirá à corrosão da MEA.
4. Coloque a MEAs dentro de um recipiente estéril com tampa (para manter condições estéreis) e mover para uma incubadora de parte superior de tabela. Asse pelo menos 6 horas a 55 ° C. Esta etapa é fundamental para obter uma esterilização adequada e a temperatura não deve exceder 60 ° C. Manter a esterilidade, mova o prato contendo MEAs para a capa BSLII para armazenamento até nova utilização.
   Nota: Nós usamos uma assadeira de vidro seguro de forno com tampa de plástico e sterilize a superfície com etanol a 70% e o lugar do bairro de BSLII para a secagem.
5. Alíquota da solução de matriz extracelular ECM. Descongelar o frasco a 4 ° C durante a noite e congelar 100 alíquotas µ l a-20 ° C.
   Nota: ECM é enviado congelado. ECM não deve ser trazido à temperatura ambiente até que esteja pronto para revestir como que se polimeriza em temperatura ambiente e, quando polimerizado, é impossível para o casaco. ECM sem fatores de crescimento é a preferida para evitar efeitos adicionais devido a fatores desconhecidos.
6. Esterilizar todos os instrumentos de dissecção (Dumont #5 pinça, pinça curva, tesouras pequenas e tesoura de mola) e auto-selante material revestido pratos de dissecação com etanol a 70% e deixe-os secar no bairro dissecação.

2. chick embrionárias neurônio cultura e actividade de rede

1. No dia do chapeamento, remover um frasco do ECM do congelador-20 ° C, pulverize com etanol a 70% e colocar no gelo. Dilua a 25%, adicionando-se meio de frio neurobasal 300 µ l dentro dos bosques BSLII.
2. Usando um P200 pipetteman adicionar 100 µ l de ECM de 25% para o centro do MEA, tomando cuidado para não tocar os eletrodos e remover imediatamente, deixando uma fina película na superfície. Cubra o MEA e coloque a incubadora de CO₂ (37 ° C e 5% CO₂) até que esteja pronto para os neurônios da placa.
3. Esterilize o escudo exterior de um ovo de E7 (embrionário dia 7, incubado a 37 ° C por 7 dias) com etanol a 70%. Decapitar o embrião em um prato de dissecação de fundo Sylgard contendo balanceamento de sais solução (HBSS do frio Hank estéril) sem cálcio. Corte ao redor dos olhos e retire os globos oculares. Usando o DuMont #5 finos pinça e mola tesoura faça uma incisão no lado ventral e remove as camadas externas da pele para expor a tectum prosencéfalo e óptica. Descasque e retire a membrana pial cuidadosamente. Transferir o prosencéfalo em outra placa de Petri e corte em pequenos pedaços de cerca de 2 mm com tesoura de mola.
   Nota: Não deve haver qualquer vasos sanguíneos anexados ao prosencéfalo após a remoção da membrana pial. Se estiver disponível, é preferível realizar a dissecação de um capuz de dissecação estéril, embora nós obtivemos resultados muito bons quando dissecação é realizada fora de um capuz, enquanto a área de dissecação e instrumentos são cuidadosamente esterilizados com etanol a 70% .
4. Utilizando uma pipeta de transferência estéril, coletar os pedaços de cérebro anterior em um tubo de centrífuga de 15 mL e retire o máximo do HBSS quanto possível depois de deixar as peças do prosencéfalo afundar até o fundo do tubo.
5. Adicionar 1 mL de 0.05% tripsina/EDTA (pré aquecido a 37 ° C) e incubar a 37 ° C por 15 minutos.
6. Com uma pipeta Pasteur, Retire cuidadosamente tripsina sem perturbar os pedaços de tecido e adicionar 1 mL de meio de neurobasal. Deixe as peças de tecido afundar até o fundo e retire o meio. Repeti esta lavagem mais uma vez. Esta etapa é de lavar o tripsina/EDTA.
7. Adicionar 2 mL do meio de neurobasal e começar a moer. Trituração envolve tomar uma pipeta de Pasteur estéril fogo polido e passando o tecido por isso várias vezes suavemente até que não mais pedaços de tecido são vistos. Se todas as partes permanecem após repetidas passagens, deixá-los a ajustar-se ao fundo.
   Obs.: Evite a formação de espuma durante a moer - se espuma formar, parar e remover por aspiração.
8. Diluir a re-suspensão de células 01:10 com neurobasal médio e contagem de células viáveis usando corante Trypan azul e um hemocytometer. Mix 50 µ l de células diluídas com 50 µ l de solução de azul de Trypan em um tubo de centrífuga de 0,5 mL. Adicionar 10 µ l para o hemacytometer após a colocação no sentido do lamela e contar as células de claras brilhantes (células azuis estão mortos e não devem ser contadas).
   Nota: Típico celulares de um único intervalo de óptica tectum E7 entre 1 e 5 x 10⁷ células/mL.
9. O dissociada da placa células na ECM revestido MEAs em uma densidade de 2.200 mm de células/praça. Para o nosso sistema MEA, isso se traduz em aproximadamente 130.000 células por MEA. Adicione neurobasal médio para trazer o volume o MEA para 1 mL e colocar MEAs a incubadora de CO₂ durante a noite para a ligação de célula e a extensão do axônio (Figura 1).
   Nota: Para MEAs de diferentes áreas e números de eletrodo, densidades diferentes células poderiam ser tentadas - em geral, maior densidade de célula resulta em maior atividade de rede, mas também leva a culturas viveu mais curtas.
10. No dia seguinte, adicione BPA para uma concentração final de 10 µM em neurobasal médio do estoque 1mm feito na etapa 1.1 para a MEA Tratado. Para o controle MEA, adicione o mesmo volume de etanol a 10% em solução de água (v/v).
11. Substituir o gasto médio com neurobasal médio contendo 10 µM BPA todos os outros dias até 7 dias em vitro (7DIV) e todos os dias daí em diante, medida que aumenta a atividade de rede.
    Nota: À medida que aumenta a atividade de rede, aumenta a atividade metabólica e alterações de mídia precisam ser mais frequentes. Não permita que o meio laranja.

3. gravar a atividade da Rede Neuronal

1. No dia da aquisição, troca de meio de cultura com meio fresco neurobasal e retornar o, como para a incubadora de CO₂ por um período mínimo de 2 h antes da gravação. Inicie o software de gravação e definir a temperatura da MEA a 37 ° C, clicando no ícone de temperatura (suplementar Figura 3.1-b).
   Nota: A gravação pode começar assim que dia 3 do chapeamento e pode continuar contanto que as culturas estão vivas.
2. Configurar os parâmetros de aquisição clicando no ícone de "Musa" (sob fluxos no painel esquerdo da janela) e selecione "Adicionar processamento" e "Detector de pico" e clique em Okey na janela pop up. "Detector de spike (6 x STD)" irá aparecer abaixo do nome do arquivo (suplementar Figura 3.2-b).
3. Em seguida clique com o botão direito sobre o Detector de Spike, selecione "Adicionar processamento" e "Burst Detector" e clique em Okey na janela pop up. "Burst Detector" (ISI) aparecerá abaixo do ícone de Musa (suplementar Figura 3.3-b).
4. Em seguida clique com o botão direito em Burst Detector, selecione "Adicionar processamento" e "Compilador de estatísticas Neural". Na janela pop up, certifique-se de que o arquivo de cabeçalho, agregados bem estatísticas e sincronia são selecionados. Clique Okey. "Estatísticas compilador" aparecerá abaixo (Figura suplementar 3.4a-b).
   Nota: Isto irá definir o cruzamento de limiar adaptativo (filtro de STD 6 x), o intervalo de pico inter no 100 ms, com um número mínimo de picos no 5, a média de disparar a deteção da taxa em 10 s, com um parâmetro de sincronia em 20 ms e a taxa de pico mínimo 0,083333 picos por min.
5. Configurar a gravação marcada para o tempo de gravação de 5 minutos (300.000 ms) clicando no ícone na parte inferior do relógio. Isto é conseguido alterando as informações da seção de configuração para gravar cada 5,1 minutos e gravar por 5 minutos. Isto será iniciado imediatamente e será executado uma vez (Supplemental Figura 3.5).
6. Certifique-se de que a temperatura da MEA chegou a 37 ° C antes de se mudar a MEA. Remover o MEA da incubadora, coloque-o na unidade de gravação e bloquear o MEA. Começa a gravar a atividade de rede, clicando sobre o registro de início na seção de gravação programada ou o ícone de registro na janela de "Arquivo Play". Normalmente, um tempo de gravação de 5 minutos (300.000 ms) é suficiente, embora mais gravações de até 10 minutos podem ser obtidas.
7. Depois da gravação, retorne o MEA para a incubadora.
   Nota: Deve ter cuidado para manter a esterilidade e minimizar o tempo que o MEA fica fora da incubadora.

4. análise de dados

1. Análise dos dados brutos pode ser feita off-line usando o software de gravação. Clique sobre o arquivo menu suspenso e abrir a gravação. Selecione o arquivo de dados brutos para ser analisado. Reproduza as gravações crus para capturar os parâmetros necessários de cravação.
2. Para obter o número médio de espinhos, use o módulo Detector de pico e para a obtenção de índice de sincronia, usar o módulo Neural estatísticas de compilador.
3. Carrega o Detector de Spike, Burst Detector e módulos de compilador de estatísticas como antes (secção 3).
4. Os menus suspensos dentro o Spike Detector, Detector de estourar e estatísticas compilador módulo windows, selecione lista de Spike, rede lista de estourar e métricas avançadas, respectivamente.
5. Clique no botão gravar para começar a gravar o arquivo de dados que irá criar um arquivo. csv na pasta dirigida. Os parâmetros de pico - o número total de pontos e o índice de sincronia - serão gravados no arquivo. csv.
   Nota: análise em tempo Real durante a gravação de dados brutos não é recomendado como isto pode consumir tempo de processador e recursos computacionais.

Resultados

Nós examinamos o efeito do BPA sobre o desenvolvimento de sincronia em culturas neuronal de embrião de pinto. Sincronização de picos de atividade é um indicador do desenvolvimento normal de redes neuronais em vitro. Quando dois picos ocorrem em 5 ms do outro, eles são considerados síncronos. Em vitro culturas neuronal inicialmente exibem atividade cravação aleatória — picos ocorrem aleatoriamente e os intervalos de pico inter mostram uma distribuição normal. Como as culturas amadurecem, a atividade de cravação torna-se mais sincronizada e os intervalos de pico inter são constantes. Atividade síncrona de cravação de uma cultura foi quantificada pela análise de correlação cruzada de espigão vezes usando gravação software¹² para derivar um índice de sincronia (SI). Nós achamos que exposição BPA afeta negativamente a desenvolvimento de atividade de rede, reduzindo a atividade de cravação e o índice de sincronia (Figura 2a e 2b). Em resumo, mostramos que os efeitos nocivos da exposição do BPA em um embrião influencia seu desenvolvimento, incluindo a função neuronal que pode ser avaliada através do desenvolvimento de sincronia em garota os neurônios em cultura.

Figura 1: Esquemático do protocolo representando os passos da dissecação do prosencéfalo garota para dissociação, chapeamento e gravação de atividade da rede. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: (A) o número médio de picos é significativamente menor em BPA tratados E7 culturas de prosencéfalo garota quando comparado a culturas de controle. O número médio de picos foi extraído usando o software de gravação. Os meios (controle, 14.890 ± 949.0, N = 15 e BPA, 5.624 ± 465.9, N = 22) foram significativamente diferentes (teste-t não pareado, p < 0,0001). (B) o índice médio de sincronia (SI) é significativamente menor em BPA tratados E7 culturas de prosencéfalo garota quando comparado a culturas de controle. O SI foi extraído utilizando o módulo Neural estatísticas compilador dentro do software de gravação. Os meios de SI (controle, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 e BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) foram significativamente diferentes (teste-t não pareado, p < 0,0001). Barras de erro representam o desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Fases de rápido crescimento e desenvolvimento como embriogênese são particularmente vulneráveis aos efeitos prejudiciais de vários compostos endócrinos, incluindo o BPA. Nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição do BPA em um modelo de rede neuronal vertebrados in vitro . Usando este protocolo, estabelecemos que o BPA reduz a taxa de pico, bem como o índice de sincronia nas redes neuronais em desenvolvimento (Figura 2a-b).

Nossa metodologia foi projetada para estudar a exposição BPA durante a embriogênese precoce e pode ser facilmente adaptada para estudar os efeitos de outros CDE. Embrionárias culturas neuronal da garota são relativamente fáceis de estabelecer, em comparação com outros modelos de vertebrados, incluindo o rato ou mouse. Além disso, não há nenhuma exigência para uma sala separada do animal — uma incubadora simples em uma bancada de laboratório é suficiente para realizar estes ensaios. Nós descrevemos o uso de um sistema de multi eletrodo (MEA) para avaliar o efeito da CED, BPA, na atividade da rede. Os protocolos descritos aqui podem ser aplicados a outros sistemas. Um aspecto crítico do presente protocolo é manutenção de esterilidade. Isso inclui a dissecação do embrião em condições estéreis — esterilizar instrumentos com 70% de etanol e uso da solução de sais equilibrado do Hank estéril é suficiente. Como os dados são coletados ao longo de um período de semanas, é crítico manter estéreis manipulação da MEAs. As culturas neuronais uma vez estabelecidas podem ser culta a longo prazo - até três meses — e, portanto, são úteis para estudar a exposição prolongada a CDE e outros compostos na rede neuronal. Outro aspecto importante do protocolo é o momento de dissecação de chapeamento. O tempo ideal é de 30 min, incluindo a incubação do tecido com tripsina. Quanto mais o tempo despendido, mais pobre a sobrevivência das células.

Descrevemos aqui um protocolo básico que pode ser aplicado para a avaliação de qualquer produto químico ou droga que afeta o comportamento e função neural. Aqui, nós usamos uma densidade de células de 2.200 células por mm²; no entanto, este pode ser modificado e outras densidades de celular podem ser usadas. Em geral, nós encontramos que aumentando a densidade celular aumenta a atividade de rede - picos mais em menos tempo. O método descrito, embora muito útil em avaliar efeitos químicos sobre a atividade de rede tem limitações. Uma das maiores limitações do método é que essas culturas in vitro são duas dimensões podem não refletir a arquitetura tridimensional do cérebro vertebrado. Isto pode ser superado usando gravações de fatia. Outra alternativa é aplicar os tratamentos para o embrião do pintinho em desenvolvimento por significa de uma janela pequena, corte na extremidade larga do ovo¹⁵, dissecar o cérebro no final do regime de tratamento, fazer seções espessas sobre um vibratome e coloque o MEA para atividade de rede de gravação.

Nosso protocolo é significativo em que permite o exame do efeito da CDE no desenvolvimento da atividade da rede e oferece a exploração de uma base mecanicista para os efeitos destas substâncias químicas.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 foreceps	Fine Science Tools	11251-10
Axion Muse MEA	Axion Biosystems	M64-GL1-30Pt200	Will be called MEA system in manuscript
Axis Software	Axion Biosystems		Will be called recording software in the manuscript
BPA	Sigma-Aldrich	239658-250g
curved forceps	Fine Science Tools	11272-50
EtOH	Sigma-Aldrich	64-17-5
Fertilized chicken eggs	from any local farm or Spafas
HBSS	Fisher	14170112
Hemacytometer	Fisher	02-671-6
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free	BD Biosciences	356231	Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript
Neurobasal medium	BrainBits	Nb4-500
Neuroexplorer statistical software	Nex Technologies	Neuroexplorer version 5
Pasteur pipettes	Fisher	13-678-20A
spring scissors	Fine Science Tools	15514-12
Sylgard bottom dissection dishes	Living Systems Instrumentaion	DD-90-S-BLK-3PK
Trypan Blue dye	Fisher	15-250-061
Trypsin-EDTA	Fisher	15400054