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Resumo

Uma plataforma de único-molécula magnética pinças para manipular G-quadruplexes é relatada, o que permite o estudo da estabilidade de G4 e regulamento por várias proteínas.

Resumo

Estrutura secundária não-canônicos do ácido nucleico que g-quadruplexes (G4) estão envolvidos em diversos processos celulares, tais como a replicação do DNA, transcrição, processamento de RNA e alongamento do telômero. Durante estes processos, várias proteínas ligam e resolver estruturas G4 para desempenhar a sua função. Como a função do G4 muitas vezes depende da estabilidade de sua estrutura dobrada, é importante investigar como proteínas obrigatórias do G4 regulam a estabilidade do G4. Este trabalho apresenta um método para manipular o único G4 moléculas usando uma pinça magnética, que permite estudos do Regulamento das proteínas de ligação G4 em uma única molécula de G4 em tempo real. Em geral, este método é adequado para uma ampla gama de aplicações em estudos para interações de proteínas/ligantes e regulamentos sobre várias estruturas secundárias DNA ou RNA.

Introdução

Quatro-hélice do DNA ou RNA G4 estruturas desempenham um papel crítico em muitos processos biológicos importantes1. Muitas proteínas envolvidas no G4 vinculação e regulamento, incluindo proteínas obrigatórias do telômero (telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, fatores de transcrição (nucleolin, PARP1)3, proteínas (hnRNP A1, de processamento de RNA hnRNP A2)4, helicases (BLM, FANCJ, RHAU, AVI, Dna2, Pif1)5e replicação de DNA relacionadas com proteínas (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Emperramento da proteína pode estabilizar ou desestabilizar estruturas G4; assim, regula as funções biológicas subsequentes. A estabilidade do G4 foi medida por térmica fusão usando radiação ultravioleta (UV) ou de métodos de Dicroísmo circular (CD)7. No entanto, tais condições não são fisiológicas relevantes e são difíceis de aplicar para estudar os efeitos de ligação a proteínas7.

O rápido desenvolvimento em tecnologias de manipulação do único-molécula permitiu estudos de dobramento e desdobramento de uma biomolécula, tais como um DNA ou uma proteína, a um nível único-molécula com resolução nanômetros em tempo real8. Microscopia de força atômica (AFM), pinça óptica e pinças magnéticas são os mais comumente usados métodos de manipulação de único-molécula. Comparado a AFM e pinça óptica9, pinça magnética permite medições estáveis de dobradura-revelação dinâmica de uma única molécula de dias usando uma técnica do ADS10,11.

Aqui, uma plataforma de manipulação do único-molécula usando uma pinça magnética para estudar a regulação da estabilidade do G4 por proteínas de ligação é relatado12,13. Este trabalho descreve as abordagens básicas, incluindo a preparação de amostra e fluxo de canal, a instalação de uma pinça magnética e a calibração de força. O controle de força e os protocolos do ADS como descrito no passo 3 permitem medições em longo tempo sob diversos controles de força, tais como a força constante (braçadeira de força) e constante carregando taxa (força-rampa) e medição de força-salto. O protocolo de calibração de força descrito na etapa 4 permite a calibração de força do < 1 µm curto baraços ao longo de uma vasta força variam até 100 pN, com um erro relativo dentro de 10%. Um exemplo de regulamento da estabilidade do RNA Helicase associado com AU-rico elemento (RHAU) helicase (alias DHX36, G4R1) que tem um papel essencial na resolução de que RNA G4 é usado para demonstrar as aplicações desta plataforma13.

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Protocolo

1. preparação de DNA G4 para único-molécula esticão

  1. Prepare 5 '-tiol rotulado e 5 '-biotina etiquetado dsDNA alças por PCR usando polimerase DDNA em um modelo de ADN do fago lambda usando 5 '-tiol e 5 '-biotina as primeiras demão 14 ( Figura 1). As duas alças de dsDNA tem alto teor de GC (> 60%) para evitar DNA derretendo quando o DNA é realizada em altas forças ou durante a distensão excessiva DNA transição 15.
  2. Produtos de PCR purify usando um kit de purificação comercial e digest com enzima de restrição BstXI de acordo com o fabricante ' protocolo de s.
  3. G4 ligate formando ssDNA e flanco ssDNA e dsDNA alças usando T4 DNA ligase de acordo com o fabricante ' protocolo s. Purificar o produto ligado por extração de gel usando um kit de purificação comercial de acordo com o fabricante ' protocolo de s.

2. Preparação do canal de fluxo

  1. lamela limpeza e superfície functionalization
    1. lugar inferior lamelas (#1.5, 22 mm × 32 mm) e lamelas superiores (#1.5, 20 x 20 mm) em vidro de tampa frascos (cada frasco pode segurar 7 peças de lamelas, de coloração o volume é ~ 20 mL). Enxagúe as lamelas nos vidrinhos com água destilada, 2 - 5 vezes.
    2. Add ~ 20 mL da solução de detergente de 5-40% em cada frasco e coloc então em um banho de limpeza ultra-sônica de 30 min. Enxágue com água destilada para > 10 vezes para remover o detergente.
    3. Secar as lamelas nos frascos no forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente), ou pelo gás de 2 N. Armazenar as lamelas top secas em um armário seco.
    4. Plasma de uso (O gás de 2) para limpar as lamelas na jarra por 10 min. Durante o 10 min, prepare-se 20 mL da solução a 1% (3-aminopropil) triethoxysilane (APTES) em metanol (cuidado, tóxico/inflamável). Usar uma coifa química para dissolver APTES em metanol.
      Nota: Evite a umidade ao armazenar a solução APTES. APTES velho muitas vezes causa problema na superfície funcionalização de lamelas.
    5. Imediatamente após o plasma limpeza, adicionar todas da solução APTES 1% para os vidrinhos e incubar por 1 h. Despeje os resíduos para a garrafa de resíduos específico para 1% metanol APTES. Execute as etapas relacionadas com metanol a coifa para produtos químicos inflamáveis.
    6. Lavar os potes de uma vez com metanol e > 10 vezes com água destilada e em seguida seco pelo forno (~ 150 ° C; Cuidado, quente). Armazenar as lamelas de fundo APTES revestido em um armário seco senão na utilização por até duas semanas.
      Nota: Após cada etapa sub de 2.1.1 a 2.1.4, o processo de limpeza pode ser pausado antes da próxima etapa.
  2. Montar o canal de fluxo
    1. preparar dois " espaçadores ", ou seja, parafilm ou dobro-lado fita (~ 4 mm × 20mm) para cada canal. Coloque os dois pedaços de espaçadores sobre uma lamela inferior ao longo da borda longa. Coloque o espaçador, formando uma célula de fluxo entre uma lamela superior (~ área 10 mm × 20mm, Figura 2A , B).
    2. Se parafilm é usado como um espaçador, coloque o canal do fluxo sobre um aquecedor (60-120 ° C; Cuidado, quente) por 5-10 s pressionando suavemente os lados da lamela superior para unir as duas lamelas por parafilme. O canal de fluxo resultante tem uma altura de ~ 100 µm, e desse modo o volume do canal é ~ 20 µ l.
    3. Selar a borda longa do canal com cola de silicone para evitar fugas. Use cola de silicone para fazer uma pequena estrutura de pia em cada borda aberta do canal de fluxo, que serve como uma entrada e uma saída da solução.
      Nota: A entrada e saída também podem ser feitas por outros meios, por exemplo, por anéis de plástico pequenos aderente usando cera.
    4. Armazenar canais em um armário seco por até 4 semanas.
  3. DNA baraço para a superfície inferior do canal de fluxo
    1. diluir as esferas de poliestireno revestido amino (diâmetro: 3 µm) por 200 X em água destilada 1 X fosfato tamponado tampão salino (PBS). Vórtice a solução do grânulo e então fluxo em canais. Incubar a solução do grânulo em canais para ~ 30 min. Retire qualquer surpresa desagradável grânulos por lavagem com 200 µ l de 1 tampão PBS X.
    2. Ajuste (aumentar/diminuir) o tempo de incubação para atingir uma densidade de superfície dos grânulos de 1-5 por área de 50 x 50 mm. Armazenar os canais depositados com os grânulos de referência até 3 dias.
      3. Sulfosuccinimidyl
    3. dilua 4-(N-maleimidomethyl) ciclo-hexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) pó para solução de PBS X 1 (~ 0,5 mg/mL). Vórtice a solução e em seguida fluxo dentro do canal.
      Nota: Preparar a solução de Sulfo-SMCC fresca antes da utilização e adicioná-lo imediatamente para o canal para evitar a hidrólise da SMCC.
    4. Incubar a solução SMCC no canal de 30 min. Remove a solução SMCC lavando com uma grande quantidade (mL 1, ~ 50 X o volume do canal) de 1 solução de PBS X.
      Nota: Lave o excesso SMCC cuidadosamente. Esta etapa é essencial para a ligação do DNA na lamela.
    5. DNA amarrar
      1. diluir o tiol-biotina rotulado de DNA em 1X PBS, com uma concentração de DNA resultante de ~ 0,3 nM. Pipetar delicadamente para misturar a solução, a solução de DNA de fluxo dentro do canal SMCC-revestido e incubar durante 30 min à temperatura ambiente (~ 23 ° C).
    6. Lavar delicadamente DNA livre com 200 µ l de solução que contém 1X PBS com 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e 0,01% de 2-Mercaptoetanol de bloqueio.
    7. Bloco a superfície do canal incubando o canal em solução (10 mg/mL BSA, 0,01% 2-Mercaptoetanol) de bloqueio para > 2 h; após este passo, o canal está pronto para as experiências. O canal preparado pode ser mantido a 4 ° C para ~ 1 dia.
      Nota: A etapa de bloqueio é importante para a redução da ligação não-específica de DNA e grânulos magnéticos para as lamelas.

3. Magnético pinças instalação e identificação de único dsDNA Tether

  1. instalação de pinça magnética
    1. iniciar o magnético pinças controlam o programa. Aqui, a pinça magnética eram controlada por um programa LabVIEW escrito casa.
    2. Alinhar os centros do ímã antes de montar o canal. Use uma lente de objetivo 4 X para ajustar para o x - e eixo y dos ímãs no eixo óptico do microscópio.
    3. Usar um manipulador motorizado controlado por computador para mover os ímãs na direção-z ( Figura 2A) e defina a distância como d = 0 (d: distância entre os ímãs e lamela) quando os ímãs anexar a uma lamela no microscópio.
      4. O movimento dos ímãs através da manipulação para conseguir o controle da força, incluindo a força constante (ou seja, constante d) do programa de
    4. e tempo variando a força F (t) (ou seja, variando o tempo d(t )).
    5. Brilhante use uma fonte de luz do diodo emissor de luz (LED) para a iluminação difusa de volta do cordão com o objetivo de. Recolher as imagens do grânulo, a uma taxa de amostragem de 100 Hz por uma câmera do dispositivo de carga acoplada (CCD). < / lEu >
  2. configuração da amostra e identifique o baraço dsDNA único
    1. formação Tether
      1. suavemente o fluxo em 200 X diluído grânulos M-280, paramagnéticos na solução de ensaio (100 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 10mm Tris-pH 7,4 ) para um canal. Incube durante 10 minutos permitir que os grânulos vincular a biotina-rotulado moléculas de DNA imobilizadas na superfície de SMCC-revestido através da extremidade do thiol-rotulados. Lavar delicadamente grânulos un-amarrados usando 200 µ l da solução de reação padrão.
        Nota: Os grânulos de M-280 mostram menor ligação não específica para a superfície em comparação com outros grânulos magnéticos comerciais tais como M-270.
    2. Montar o canal para o palco do microscópio. Pesquisa para os grânulos na superfície de fundo usando o 100 X objetivo de imersão de óleo.
    3. Selecione um grânulo de referência na superfície e um grânulo amarrado em movimento. Construir as bibliotecas de imagem inicial do grânulo de referência e do grânulo amarrado em aviões diferentes desfocagem.
    4. Calibração da imagem de grânulos
      1. antes de experimentos, use um atuador piezo objetiva para obter imagens de referência e grânulos amarrados em aviões diferentes desfocagem espaçadas de 20-50 nm, que são armazenados como dois imagem separada do grânulo bibliotecas e são respectivamente indexados com a distância de desfocagem ( Figura 2D).
    5. x, y, determinação de posição z
      1. durante as experiências, determinar a posição do cordão de no plano x-y pelo centroide do grânulo. Determine a mudança de altura do cordão amarrado de comparando a imagem atual do grânulo com aqueles armazenados na biblioteca. Usar a análise de função autocorrelação do espectro de energia da transformada de Fourier do grânulo imagens 16.
    6. Do ADS gabarito usando a conta de referência
      1. durante as experiências, usar o piezo para " bloqueio " a distância entre o objectivo e uma imagem de grânulo de referência específicas armazenadas na biblioteca através de uma frequência baixa controle de gabarito, para que a imagem do grânulo preso tem a melhor correlação com uma imagem específica armazenada na biblioteca ( Figura 2D).
    7. Determinar se o baraço é uma molécula única dsDNA aplicando ~ 65 pN força determinar uma molécula dsDNA único se o baraço sofre o ADN característico distensão excessiva transição 17 , 18 , 19. Repita o processo até que seja encontrado um única dsDNA baraço. (Consulte a próxima seção para calibração de força e DNA distensão excessiva transição).

4. Calibração de força de pinça magnética

  1. determinar diretamente a força (até 100 pN) para longa (λ 48.502 bp-DNA) as moléculas de DNA utilizando a flutuação do grânulo através de:
    figure-protocol-10687
    , onde k B é a constante de Boltzmann, T é a temperatura na escala Kelvin, δ 2 y é a variância de flutuação do grânulo na direção perpendicular ao campo magnético e a força direção. Nesse sentido, o movimento da esfera pode ser descrito como uma flutuação de pêndulo com um comprimento de l + r 0, onde l é a distância de ponta a ponta na direção da força (extensão) do DNA, e é r 0 o raio do grânulo 10 ( Figura 3A).
  2. Determinar a curva de calibração para a força F como uma função de ímãs para distância do grânulo, d e F (d) para contas diferentes usando o longo λ-DNA. Geralmente, a distância entre o ímã e a lamela é usada como o comprimento do cabo do DNA pode ser ignorado. Encaixar o F-d curva pela função dupla-exponencial de decaimento:
    figure-protocol-11749
    , onde o encaixe parâmetros α1, α2, γ1, γ2 são determinados pela pinça magnética e o parâmetro C é determinada pela propriedade heterogênea dos grânulos magnéticos. Deslocando o C, o F-d curva Obtida de missanga diferentes pode ser sobreposto 10 ( Figura 3B).
  3. Experimentos de calibração de parâmetro C para esferas magnéticas individuais para curto ADN.
    1. Determinar a força baseada a flutuação requer gravação da posição do grânulo em uma frequência maior do que a frequência de canto:
      figure-protocol-12449
      , onde γ é o arrasto coeficiente do talão. Para DNA curta em alta força, requer frequência de gravação mais rápido do que 100 Hz, portanto, a força não pode ser medida diretamente com base na flutuação com a câmera. No entanto, o parâmetro C pode ser determinada medindo a força em uma baixa força gama (< pN 15) utilizando a flutuação e encaixe os dados com um calibrado F-d curva para obter o parâmetro C 20.
    2. , Alternativamente, para experiências com dsDNA, determinar o parâmetro C usando DNA distensão excessiva transição com uma força de ~ 65 pN ( Figura 3) 21 , 22 , 23, gravando a posição d no qual salto de extensão mostrou dsDNA (0,6 X aumento de comprimento de comprimento de contorno). Depois de determinar o parâmetro C, calcular a força para os grânulos amarrados.
  4. Controlar a taxa de carregamento através da programação do movimento dos ímãs através da função inversa de F (d). O ímã deve aproximar a amostra dupla exponencialmente.
    Nota: O erro relativo da força determinada por tal um método de extrapolação é ~ 10% e é causada principalmente pelo raio de grânulo heterogeneidade 20.

5. Único-molécula manipulação do G4 na presença e na ausência de ligação a proteínas

  1. força-rampa experimentos
    1. depois de identificar o baraço dsDNA, executar uma verificação de aumento de força a uma taxa de carregamento de 0.2 pN/s seguido de um verificação de força-falecimento em-0.2 pN/s. Após cada ciclo de alongamento, segure a molécula de DNA em 1 pN por 30 s para permitir que o ssDNA a redobrar a G4.
  2. Experimentos de força-salto
    1. a força do ciclo entre 54 pN por 30 s sob as quais um G4 dobrado pode ser desdobrado e 1 pN para 60, sob a qual um G4-15T dobrado pode redobrar.
  3. Solução de proteína flui
    1. fluxo de solução da proteína quando em ~ 20 pN força para evitar o apego dos grânulos a lamela. A helicase DEAH-caixa RHAU, que mostrou alta especificidade para a estrutura de G4, foi usado 24. A Drosophila melanogaster RHAU (DmRHAU) helicase recombinante foi expressa em Escherichia coli e purificado conforme descrito anteriormente, 25. O G4 atividade desenrolamento de DmRHAU foi analisada em um tetramoleculares G4 ADN substrato 13.
  4. Analisar a desdobramento força usando um in-house escrito Matlab programa 14.

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Resultados

A montagem da experiência de uma única molécula de G4 de alongamento é mostrada na Figura 4. Uma sequência de formação single-stranded G4 que se expandiu entre duas alças de dsDNA foi amarrada entre uma lamela e um grânulo paramagnético. Para encontrar uma pérola de dsDNA único amarrados, realizou-se um ensaio overstretching, aumentando a força em taxas de carga constante. Três tipos de medidas muitas vezes foram usados para estudar o dobramento...

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Discussão

Conforme descrito acima, uma plataforma para estudar a estabilidade mecânica do ADN do G4 e as interações da proteína para G4 usando pinças de único-molécula magnética é relatada. Que acompanha a plataforma, são desenvolvidos protocolos altamente eficientes de encontrar DNA G4 baraço e medição da dobradura-revelação dinâmica e estabilidade da estrutura G4 com resolução especial nanômetros. O plano focal de travamento permite controle de anti drift altamente estável, que é importante para a detecção...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Meng Pan para revisão do manuscrito. Este trabalho é apoiado por Singapura Ministério da educação acadêmica pesquisa fundo Tier 3 (MOE2012-T3-1-001) a JY; a Fundação Nacional de pesquisa através da Cingapura Mechanobiology Instituto de JY; Fundação Nacional de pesquisa, escritório, Singapura do primeiro-ministro, sob seu programa de Investigatorship da NRF (NRF Investigatorship Award no. NRF-NRFI2016-03, a JY; o fundo de investigação Fundamental para as universidades Central (2017KFYXJJ153) para H. Y.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DNA PCR primersIDTDNA preparations
DNA PCR chemicalsNEBDNA preparations
restriction enzyme BstXINEBR0113SDNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)BMH.BIOMEDIA72204flow channel preparation
Decon90Decon Laboratories Limitedflow channel preparation
APTESSigma440140-500MLflow channel preparation
Sulfo-SMCCThermoFisher Scientific22322flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidinThermoFisher Scientific11205Dflow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μmPolysciences, Inc17145-5flow channel preparation
2-MercaptoethanolSigmaM6250-250MLflow channel preparation
Olympus Microscopes IX71OlympusIX71Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721Physik InstrumenteP-721Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100XOlympusMPLAPON-Oil 100XMagnetic tweezers setup
CCD/CMOS cameraAVTPike F-032BMagnetic tweezers setup
Translation linear stagePhysik InstrumenteMoCo DCMagnetic tweezers setup
LEDThorlabsMCWHLMagnetic tweezers setup
Cubic MagnetsSupermagneteMagnetic tweezers setup
LabviewNational InstrumentsMagnetic tweezers setup
OriginPro/MatlabOriginLab/MathWorksData analysis

Referências

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