Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

Resumo

Este estudo relata dois métodos diferentes para a análise de migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e em vitro vídeo baseado em microscópio cicatrização ensaio. São descritos os protocolos para estes dois experimentos, e suas vantagens e desvantagens são comparadas.

Resumo

A capacidade de invasão e migração de células tumorais é principais contribuintes para a progressão do câncer e recorrência. Muitos estudos têm explorado as capacidades de migração e invasão de entender como as células cancerosas se disseminar, com o objectivo de desenvolver novas estratégias de tratamento. Análise das bases celulares e moleculares destas habilidades levou para a caracterização da mobilidade celular e as propriedades físico-químicas do citoesqueleto e microambiente celular. Por muitos anos, o ensaio de câmara Boyden e o risco de ferimento ensaio foram as técnicas padrão para estudar a migração e invasão celular. No entanto, estas duas técnicas têm limitações. O ensaio de câmara Boyden é difícil e demorado, e o ensaio da ferida zero tem baixa reprodutibilidade. Desenvolvimento de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, aumentou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Utilizando sistemas de análise poderosas, um microscópio de vídeo de "no-incubadora" pode ser usado para fornecer análise automática e em tempo real de migração celular e invasão. O objetivo deste trabalho é relatar e comparar os dois ensaios utilizados para estudar a migração e invasão celular: o ensaio de câmara Boyden e um otimizado em vitro vídeo microscópio com base em zero do ensaio de ferida.

Introdução

Migração e invasão celular estão envolvidas na disseminação das células cancerosas, que é a causa principal da resistência ao tratamento¹ e podem levar a locorregional ou metastática recorrência após tratamento de câncer². A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é o processo inicial de invasão-migração celular no qual câncer células alternar de um epitélio para um fenótipo mesenquimal. E-caderina é um marcador extracelular do fenótipo epiteliais³e expressão aumentada de N-caderina e vimentina é característica do fenótipo mesenquimais⁴. Migração também depende da capacidade intrínseca das células cancerosas invadir a matriz extracelular (ECM) através da ação das metaloproteases de matriz⁵.

Esse mecanismo de invasão – migração tem sido descrito por câncer em muitos locais, particularmente no câncer de cabeça e pescoço⁶. Muitos pesquisadores têm incidido sobre os processos de migração e invasão de entender melhor como as células cancerosas se disseminar na esperança de que esse conhecimento vai levar a novas estratégias de tratamento. É fundamental que estes estudos são realizados utilizando ensaios confiáveis e reproduzíveis.

Análise in vitro da motilidade celular pode ser um desafio. O ensaio de câmara Boyden desenvolveu há muitos anos, é considerado para ser o padrão para análise de invasão – migração⁷. No entanto, é demorado e muitas vezes é impreciso. Um segundo teste é a cicatrização da ferida ensaio⁸, que envolve fazer um arranhão em uma cultura celular de monocamadas e captura de imagens da invasão celular e migração em intervalos de tempo fixo. Esta técnica tem sido criticada extensamente por causa das grandes variações entre os resultados de dois testes sucessivos. No entanto, a aplicação de tecnologias modernas, especialmente em microscopia, melhorou a reprodutibilidade do ensaio do risco de ferimento. Microscópios de vídeo podem ser facilmente introduzidos em incubadoras e podem gerar imagens em tempo real de migração celular. Estes dispositivos gravar dados microscópicos e fornecem análise automática de confluência de célula ferida ao longo do tempo. O objetivo deste trabalho é descrever o ensaio de câmara Boyden e o ensaio da ferida zero otimizada e discutir as vantagens e fraquezas de cada abordagem.

Protocolo

Nota: Os ensaios de câmara e zero de Boyden sem inclusão de ECM são referidos como o ensaio de migração, e os ensaios mesmos com o ECM é referido como o ensaio de invasão.

1. Boyden câmara de ensaio

Nota: Este protocolo é adaptado para a linha de celular SQ20B, que é derivada de um câncer de laringe recorrente de cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas (HNSCC) e foi obtida por John Little (Boston, MA, USA).

Dia 1

1. Célula de semeadura
   1. Semente 10 2⁶ SQ20B células em 12 mL de meio de cultura (CM) em um balão de² 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.
      1. Para preparar CM para as células SQ20B, suplemento meio modificado de águia de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
   2. Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com solução salina tampão fosfato (PBS) e adicionar 2,5 mL de ácido de tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,5 g/L). Incube as celulas por 5 min a 37 ° C e em seguida, pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
   3. As sementes das células em balão de² 25 cm, com uma densidade de células de 10 6 células de⁵ para cada condição a ser avaliada. Incube as celulas por 24h em 3 mL de CM.

Dia 2

2. Fome de célula e preparação das câmaras revestidas
   1. Morrer de fome as células, substituindo o meio em cada frasco com 3 mL de meio de soro bovino fetal-baixo (FBS) usando 0.1% albumina de soro bovino (BSA) em vez de FBS. Morrer de fome as células por 24 h na incubadora.
      1. Para preparar a fome CM (s-CM), suplemento DMEM com 0,1% BSA, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
   2. Para o ensaio de migração, vá para a etapa 1.3.
   3. Para o ensaio de invasão, 12h antes do dia 3, prepare as câmaras revestidas de Boyden adicionando 500 μL de s-CM para cada câmara revestida. Usar comercialmente preparadas câmaras revestidas de Boyden e mantê-los em 4 ° C antes do uso. Coloque cada câmara Boyden na placa companheiro e defini-la em incubação a 37 ° C durante a noite.

Dia 3

3. Célula semear na câmara Boyden
   1. Utilize a placa de companheiro para preparar o quimiotático. Encha cada um bem da placa 24-bem companheiro com 750 µ l de meio completo com 10% FBS, hidrocortisona 0,04 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
      1. Adapte o quimiotático para cada linha de célula e de cada condição de tratamento. Para preparar o quimiotático CM (ca-CM), suplemento DMEM com 10% FCS, hidrocortisona 0,4 mg/mL, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 0,1 g/L.
   2. Transferi a câmara superior para a placa de companheiro pré-carregadas, tendo o cuidado de evitar bolhas.
   3. Para o ensaio de invasão, Retire cuidadosamente 450 μL de CM de cada câmara de Boyden.
   4. Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 0,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e em seguida Incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
   5. Semente 10 3⁴ SQ20B células em 500 μL de médio de 0,1% BSA, dando uma diluição final de 6 10⁴ células/mL.
      Nota: A concentração de células deve ser adaptada para cada linha de celular.
   6. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 24 h.

Dia 4

4. Fixação da pilha e coloração
   1. Conserte as células antes que o tempo de duplicação específico para essa linha de celular. Fix SQ20B células antes de 24 h.
   2. Remova cada inserção da placa de companheiro e cuidadosamente, remover as células da câmara superior usando um cotonete. É particularmente importante remover todas as células localizadas na câmara alta.
   3. Correção e mancha cada inserem individualmente para obter maio-Grunwald Giemsa coloração⁹ usando o kit de coloração fornecido. Como alternativa, use paraformaldeído 4% em outro prato de companheiro para uma fixação de 30 min.
   4. Manter as inserções em um prato vazio 24-bem companheiro sob uma capa de laboratório para secar cada câmara.

Dia 5

5. Análise microscópica
   1. Insira a placa de companheiro com as inserções em um microscópio de contraste de fase 20 e contar cada célula migrada na parte inferior da membrana. Otimizar a posição do foco certo movendo o objectivo do fundo ao topo e parar a posição na parte inferior da membrana.
   2. Calcule a relação entre os números de células migradas e semeado de células. Repita cada contagem para cada condição de tratamento em triplicado.

2. risque ferida ensaio: Migração de células

Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.

Dia 1

1. Célula de semeadura
   1. Semente de 2 x 10⁶ SQ20B células em 12 mL de CM em um balão de² 175 cm 72 h antes de um dia e permitem que as células a crescer a confluência de célula de 80%.
   2. Sob uma capa de fluxo laminar, trypsinize as células. Remover o meio, lavar as células com PBS estéril, adicionar 2,5 mL de tripsina EDTA (0,5 g/L) e incube as celulas por 5 min a 37 ° C. Pare a reação adicionando 12,5 mL de CM aquecido a 37 ° C. Conte o número de células, usando um contador de célula.
   3. Gere uma amostra pré-diluído em uma densidade de célula de 4 x 10⁵/mL, dando uma densidade final de 10 4 células de⁴ por 100 μL de cada poço. Esta concentração deve ser adaptada para cada linha de celular e deve estar no intervalo de 1 x 10⁴ 6 10⁴ células.
   4. Células de semente em cada cavidade de uma placa de 96 poços por depositar 100 μL de solução preparada na etapa 2.1.2.
   5. Deixe a placa à temperatura ambiente por 5 min dispersar as células uniformemente no fundo dos poços.
   6. Colocar a placa para a incubadora e permitir que as células aderir à placa para 12 a 16 h (máximo) a 37 ° C.

Dia 2

2. Coçar a ferida do ensaio
   1. Retire as placas preparadas na etapa 2.1 da incubadora.
   2. Sob o capô, fazer uma ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
   3. Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.
   4. Lave as células duas vezes, repetindo a aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C para cada poço.
   5. Remova o CM com uma pipeta com uma ponta cónica adaptada após as etapas de lavagem.
   6. Adicione 100 μL de meio específico para cada condição de tratamento para cada poço.
   7. Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.
   8. Coloque a placa dentro do rack adaptado do vídeo microscópio.
   9. Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.
   10. Programa a agenda de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por bem. Um intervalo máximo de 2-h é necessário para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.
   11. No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.

Dias 3, 4 e 5

3. Análise de migração usando o vídeo microscópio
   1. Por um período mínimo de 24 h e até 5 dias, monitorar e verificar a migração celular.
   2. Use uma máscara de célula apropriada adaptada para cada tipo de célula para analisar a migração celular. Para obter uma máscara de célula adaptada para cada linhagem celular, gere uma célula processamento definição do software usando uma coleção de imagens de célula específica.
   3. Traçar as curvas e exportar os dados para uma planilha, o que pode ser usada para analisar e comparar os resultados.

3. risque ferida ensaio: Invasão de célula

Nota: As instruções devem ser adaptadas para cada tipo de célula.

Dia 1

1. Célula de semeadura
   1. Use o mesmo protocolo para semeadura de células conforme descrito no passo 2.1.

Dia 2

2. Preparando o ECM
   1. Descongelar a matriz para pelo menos 12 h antes de usar a 4 ° C. Certifique-se que os agregados não são visíveis. Se agregados são visíveis, manter a matriz a 4 ° C por um período mais longo, até que desapareçam os agregados. Manter a matriz no gelo. Utilize pontas de pipetas pré-resfriada.
      Nota: A matriz solidify se não manteve a 4 ° C.
   2. Relaxa os tubos microcentrifuga no gelo por 5 min.
   3. CM do refrigerador de refrigeração a 4 ° C e diluir a matriz nos microcentrifuga pré-resfriado tubos para obter uma concentração final de 300 μg/mL.
   4. Retornar os tubos microcentrifuga com matriz pré-diluído na geladeira a 4 ° C.
      Nota: Uma grade adaptada para tubos microcentrifuga é útil para manter os tubos em 4° C, durante todo o experimento.

Dia 2

3. Coçar a ferida ensaio e tratamento de ECM
   1. Remova a placa preparada na etapa 3.1 da incubadora.
   2. Sob o capô, certifique-se da ferida usando o dispositivo ferindo comercial de acordo com o protocolo do fabricante.
   3. Retire o meio de cada poço usando uma pipeta com uma ponta cónica adaptada, tomando cuidado para não tocar a ferida.
   4. Lavar as células duas vezes, repetindo o procedimento de aspiração e usando 100 μL de CM aquecido a 37 ° C.
   5. Após a segunda lavagem, coloque a placa sobre a incubadora de 4 ° C para equilibrar a sua temperatura por 5 min.
   6. Remova o meio frio de cada poço com a pipeta de aspiração com uma ponta cónica, cuidando para pipetar cuidadosamente da borda e evite tocar a ferida.
   7. Adicionar 50 μL de matriz pré-diluído a cada poço usando pontas cônicas pré-resfriado a 4 ° C.
   8. Coloque a placa na incubadora a 37 ° C por 30 min.
      Nota: Um rack de apoio escaldadas a 37 ° C é útil para acelerar o aquecimento da placa de 96 poços.
   9. Retirar a placa da incubadora e adicione 100 μL do CM adaptada a cada poço conforme indicado para cada condição de tratamento.
   10. Tente evitar criar quaisquer bolhas nos poços. Uma técnica de pipetagem reversa pode ser útil aqui. Como alternativa, remova as bolhas com uma agulha de seringa.
   11. Coloque a placa dentro do rack adaptado no vídeo microscópio.
   12. Para melhorar a qualidade de imagem, permitem que a placa aquecer durante pelo menos 15 minutos antes do primeiro scan para evitar condensação na parte inferior da placa.
   13. Programe o horário de exames, utilizando o software de vídeo microscópio em uma imagem por alvéolo, no modo de varredura de coçar a ferida. Um intervalo máximo de 2-h em necessários para uma experiência de migração de invasão. Se o objetivo do experimento é produzir um vídeo, um intervalo de 30 min máximo é preferencial.
   14. No final do experimento, lave o dispositivo ferindo com cuidado e siga cada uma das quatro etapas lavagem indicadas pelo fabricante.

Dias 3, 4 e 5

4. Análise de invasão de pilha usando um microscópio de vídeo.
   1. Repita a etapa 2.3.

Resultados

Nós relatamos aqui dois métodos diferentes para analisar a migração e invasão celular. A Figura 1 mostra a Boyden experimento de câmara. As inserções são colocadas em uma placa de companheiro com quimiotático médio, e as células são semeadas em CM. A membrana pode ser sem revestimento (ensaio de migração) ou revestido (teste de invasão). As células são semeadas na câmara superior em s-CM. A câmara baixa é preenchida com CM como um quimiot...

Discussão

Nós relatamos aqui duas modalidades diferentes para estudar o processo de migração e invasão celular. A análise deste processo é importante para a compreensão dos factores envolvidos na recorrência metastática, que pode ser explicada pelo aumento da mobilidade de uma subpopulação de células de câncer chamado câncer células-tronco^10,11.

O experimento de câmara de Boyden é uma o mais frequentemente usado invasão e migra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	-
Wound Maker	Essen Bioscience	4494	Store in safe and dry place
96-well ImageLock Plate	Essen Bioscience	4379
CoolBox 96F System with CoolSink 96F	Essen Bioscience	1500-0078-A00
CoolBox with M30 System	Essen Bioscience	1500-0078-A00
Boyden Insert	Dominique Dutcher	353097
Boyden Coated Insert	Dominique Dutcher	354483	Store at -20 °C
Companion 24-well Plate	Dominique Dutcher	353504
BD Matrigel standard	BD BioScience	BD 354234	Store at -20°C.
RAL 555 Staining Kit	RAL Diagnostics	361550	Store in safe and dry place
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	33511