Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

Resumo

Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

Resumo

A análise de DNA do tumor (ctDNA) usando o sequenciamento de próxima geração (NGS) em circulação tornou-se uma valiosa ferramenta para o desenvolvimento da oncologia clínica. No entanto, a aplicação deste método é um desafio devido à sua baixa sensibilidade ao analisar a quantidade de rastreamento de ctDNA no sangue. Além disso, o método pode gerar resultados falsos positivos e negativos a partir desta análise de sequenciamento e subsequente. Para melhorar a viabilidade e a confiabilidade da deteção de ctDNA na clínica, aqui apresentamos uma técnica que enriquece raras mutações por sequenciamento, enriquecer a rara mutação sequenciamento (ER-Seq). ER-Seq pode distinguir uma única mutação fora 1 x 10⁷ nucleotídeos de tipo selvagem, que o torna uma ferramenta promissora para detectar alterações genéticas extremamente baixa frequência e, portanto, será muito útil no estudo de heterogenicity doença. Em virtude da ligadura do adaptador exclusivo de sequenciamento, esse método permite uma recuperação eficiente de moléculas de ctDNA, ao mesmo tempo corrigindo para erros bidirecionalmente (sentido e antisentido). Nossa seleção de sondas 1021 kb enriquece a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações em 12 tumores relacionados ao tumor motorista. Esse método cost-effective e universal permite uma acumulação excepcionalmente bem sucedida dos dados genéticos. Depois de forma eficiente filtragem de erro de fundo, ER-seq precisamente pode detectar mutações raras. Usando um estudo de caso, apresentamos um protocolo detalhado demonstrando sonda design, construção de biblioteca e metodologias de captura de DNA alvo, enquanto incluindo também o fluxo de trabalho de análise de dados. O processo para realizar este método normalmente leva 1-2 dias.

Introdução

Sequenciamento de próxima geração (NGS), uma poderosa ferramenta para investigar os mistérios do genoma, pode fornecer uma grande quantidade de informações, que podem revelar alterações genéticas. A aplicação da análise NGS na clínica tornou-se mais comum, especialmente para a medicina personalizada. Uma das maiores limitações da NGS, no entanto, é uma taxa de erro elevada. Embora considera-se adequado para estudar as mutações herdadas, a análise de mutações raras é extremamente limitada^1,2, especialmente quando analisar o DNA obtido de uma biópsia"líquida".

Tumor de circulação DNA (ctDNA) é sem célula DNA (cfDNA) no sangue que é derramado de células tumorais. Na maioria dos casos, a quantidade de ctDNA é extremamente baixa, que tornam sua deteção e da análise muito desafiador. No entanto, o ctDNA tem muitas características atraentes: seu isolamento é minimamente invasivo, ele pode ser detectado na fase inicial de crescimento do tumor, o nível de ctDNA reflete a eficiência terapêutica e ctDNA contém as mutações de DNA encontradas em lesões primárias e metastáticas ^{3 , 4 , 5}. portanto, tendo em conta o rápido desenvolvimento da técnica NGS e análise, a aplicação da deteção de ctDNA tornou-se mais atraente.

Sequenciamento em paralelo diferentes abordagens têm sido utilizadas para a deteção de ctDNA, mas nenhuma dessas abordagens foram aceites para uso rotineiro em clínicas devido às suas limitações: baixa sensibilidade, falta de versatilidade e um custo relativamente alto^{6 ,7,8}. Por exemplo, sequenciamento de frente e verso, baseado em uma marca de identificador exclusivo (UID), repetidamente corrige erros em bidirecionalmente o consenso, a maioria dos erros de sequenciamento de rectificação. No entanto, a viabilidade desse método é perdida devido ao seu alto custo e utilização de dados baixa^9,10. Da mesma forma, CAPP-Seq e sua iteração melhorada, CAPP-IDES^11,12, têm maior praticidade na detecção de cfDNA, embora a precisão e a universalidade desses métodos precisam ser melhoradas.

Para atender a necessidade atual para detecção de ctDNA precisos e análise, desenvolvemos uma nova estratégia, enriquecer a rara mutação de sequenciamento (ER-Seq). Esta abordagem combina o seguinte: adaptadores de sequenciamento exclusivo para recuperar com eficiência ctDNA moléculas, com correção de erro bidirecional e a capacidade de distinguir uma única mutação de > 1 × 10⁷ nucleotídeos de tipo selvagem; sondas de 1021 kb que enriquecem a medição de regiões-alvo que cobrem mais de 95% das mutações relacionados ao tumor de 12 tumores, incluindo câncer de pulmão, câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de rim, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de tireoide, câncer de colo uterino, câncer de esôfago e carcinoma de endométrio (tabela 1); e triagem de banco de dados de base tornando-o eficiente e fácil de detectar precisamente mutações raras em ctDNA.

Para construir um banco de dados de base, encontre todas as mutações do gene por ER-Seq de um número do mesmo tipo de amostras (~ 1000 no início). Estas mutações reais devem ser verificadas por vários outros métodos de deteção de confiança e análise. Em seguida, resumem o padrão de mutações falsas e todas as mutações falsas para criar o banco de dados de base inicial de cluster. Continue a adicionar falsas mutações encontradas de experimentos subsequentes sequenciamento a esse banco de dados. Portanto, esse banco de dados de base torna-se uma dinâmico expandido de banco de dados, que melhora significativamente a precisão de sequenciamento.

Para promover o progresso na monitorização e diagnóstico de tumor, apresentamos ER-Seq, um método de baixo custo e viável para a aquisição de dados universais. Apresentamos um estudo de caso que foi submetido a análise de ER-Seq, demonstrando sua exatidão para detectar mutações raras e viabilidade para uso na clínica.

Protocolo

amostras de tumor e amostras de sangue foram obtidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê ética de Peking University povo ' ' s Hospital. Obteve-se consentimento escrito dos pacientes para usar suas amostras. Os participantes foram selecionados de acordo com os seguintes critérios: fêmea, avançado de câncer de pulmão de células não pequenas, mutação de EGFR p.L858R indicado pelo anterior de sequenciamento Sanger, progressão da doença após dois sessão de EGFR alvo terapia com Erlotinib, e Que foi aplicado a ctDNA para analisar a causa da resistência e encontrar novas drogas alvo ER-Seq.

1. extração de DNA de sangue periférico para cfDNA e o DNA genômico (gDNA)

1. coletar 10 mL de sangue periférico em um tubo de coleta, inverter suavemente para cima e para baixo 6 - 8 vezes para misturar. Evite a distorção da célula. Amostras de sangue podem ser armazenadas no tubo de coleta a 6-37 ° C por até 72 horas.
2. Centrifugar o tubo de coleta em temperatura ambiente por 10 min a 1600 (150) x g.
3. Transferir o sobrenadante (plasma) do tubo da coleção para quatro 2ml limpo adequadamente rotulados tubos de centrífuga, usando uma pipeta descartável sem perturbar a camada de sedimento (glóbulos brancos).
4. ML de Transfer1 das células usando uma pipeta descartável limpo para um 2ml adequadamente rotulados tubo de centrifugação. As células podem ser armazenadas a-20 ° C ou mais frio antes passo 1.8.
5. Centrífuga plasma (etapa 1.3) por 10 min a 4 ° C e 16000 (150) x g.
6. Transferir o plasma para limpar tubos de centrífuga correctamente rotulados como " plasma ", embora ~0.1 mL de volume residual no fundo para evitar a contaminação. Armazenar o plasma a-80 ° C até o passo 1.7.
7. Use 3 mL de plasma da etapa 1.6 para isolar cfDNA (contém ctDNA) usando um kit disponível comercialmente, seguindo o fabricante ' instruções de s.
8. Uso 200 µ l de células brancas do sangue da etapa 1.3 para isolar gDNA usando um kit disponível comercialmente, seguindo o fabricante ' instruções de s.
   Nota: Os dois cfDNA e gDNA podem ser armazenadas a-20 ° C antes do uso.
9. Aplicar controles de qualidade diferentes para cfDNA e gDNA (tabela 2). Execute o controle de qualidade através de um método padronizado para o bioanalyzer determinar níveis de degradação de amostra e/ou contaminação gDNA. Análise do pico da qualidade de extração de cfDNA deve aparecer semelhante à Figura 1.
   Nota: O tamanho do pico de cfDNA é de cerca de 170 BP nota que aumentando a quantidade de DNA irá resultar em uma biblioteca de qualidade superior para a detecção eficaz de mutações raras no cfDNA. Recomendamos o uso de pelo menos 30 ng cfDNA (30.000 cópias).

2. Preparação de biblioteca

Nota: construção de biblioteca de base no DNA fragmentado, cfDNA existe em fragmentos com um pico tamanho ~ 170 bp e, portanto, não necessita de ser fragmentado.

Amostra de

1. fragmento do controle (gDNA) pelo sonication para obter fragmentos de bp 200-250.
   1. Preparar 1 µ g de amostra gDNA em 100 µ l de tampão Tris-EDTA em um tubo limpo sonication.
   2. Definir o programa de sonication como 30 s no e 30 s fora durante 12 ciclos para um total de 12 min.
   3. Após sonication, confirmar o produto (5 µ l) contém fragmentos de 200-250 bp executando uma análise com gel de agarose 2%.
   4. Todos os produtos da fragmentação de transferência para um novo tubo de 1,5 mL e incubar com 150 µ l de grânulos magnéticos por 5 min selecionar os fragmentos corretos.
   5. Remover o sobrenadante, colocando o tubo em um rack magnético para 30 s.
   6. Lave os grânulos com 200 µ l de etanol a 80% (preparado na hora) com o tubo ficar na prateleira magnética. Incubar durante 30 s antes de remover o sobrenadante. Repetir uma vez.
   7. Ar secar as contas com a tampa do tubo aberta enquanto estiver hospedado no rack magnético. Evite o superaquecimento de grânulos para certificar-se de que o alvo do DNA se recupera bem. Eluir os fragmentos de DNA de grânulos adicionando 32 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8) aos talões para resolver os fragmentos de DNA seguidos de quantificação por espectroscopia UV/Vis.
      Nota: pelo menos 200 ng é necessário para os experimentos seguintes.
2. Fim Prep reação
   Nota: Siga fabricante ' instrução s e modifique conforme necessário. Uso 30 ng de cfDNA; e 1 µ g de gDNA como o controle.
   1. Adicionar 7 µ l de tampão de reação, 3 µ l da mistura da enzima, 30 ng de cfDNA em um tubo estéril de nuclease-livre e adicionar ddH ₂ O volume total de 60 µ l. Em um tubo separado, adicione os componentes acima mas com 1 µ g de gDNA em vez de cfDNA.
   2. Mix e incubar a mistura a 20 ° C por 30 min, seguido de 65 ° C por 30 min em um thermocycler sem a tampa aquecida. Dirijam-se para a próxima etapa.
3. Adaptador ligadura
   1. Adicionar 30 µ l do mix mestre da ligadura, 1 µ l do realçador de ligadura e 4 µ l dos adaptadores de sequenciamento exclusivo para a mistura da etapa 2.2.
   2. Incubar a 20 ° C por 15 min em um thermocycler sem a tampa aquecida.
   3. Vortex Resuspenda as esferas magnéticas e deixar as contas em temperatura ambiente pelo menos 30 min antes da próxima etapa.
   4. Adicionar 87 µ l dos grânulos magnéticos ressuspensão à mistura previamente mencionado; misture bem pipetando para cima e para baixo e então incubar a temperatura ambiente por 5 min.
   5. Lavagem e ar seco os grânulos, conforme descrito no passo 2.1.
   6. Eluir o alvo do DNA da missanga, adicionando 20 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
4. Fragmentos de enriquecimento de DNA ligados com adaptador
   1. Adicionar 20 µ l de adaptador ligado DNA fragmentos, 5 µ l de índice Primer/i7 (2,5 µ l Primer-P7 (22:00) e 2,5 µ l de Primer-P5 (22:00), para fins de sequenciamento), 25 µ l de biblioteca amplificação mestre mix e ddH ₂ O para um volume total de 50 µ l.
   2. PCR amplifica o adaptador ligado DNA e ciclo térmico da seguinte forma: desnaturação inicial a 98 ° C por 45 s, seguido de 8 ciclos (cfDNA) ou 4 ciclos (gDNA) de recozimento ° C por 15 s, 65 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s) e uma extensão final a 72 ° C, durante 60 s e, em seguida, mantendo a temperatura em 4 ° C.
   3. Adicionar 45 µ l de suspensão magnéticos grânulos ao DNA PCR-enriquecido para obter fragmentos adquiridos.
   4. Fragmentos de DNA eluir com adaptadores em 30 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Controle de qualidade da biblioteca
   1. siga o fabricante ' protocolo de s para o kit comercial medir o adaptador ligado a concentração de DNA. Use o bioanalyzer para determinar a qualidade do DNA.

3. Alvo de captura de DNA

Nota: enriquecimento de destino foi realizado usando uma sequência personalizada captura-sonda, que é projetada especificamente para uma região de enriquecimento do alvo 1021 kb cobrindo mutações de motorista conhecido tumor-associado de 12 diferentes tipos de tumores. Modificações para o fabricante ' protocolo s são detalhados nas etapas a seguir.

1. 1. Adicionar 1,5 µ g de bloqueio de pool de bibliotecas (número máximo de bibliotecas para piscina para cfDNA 6, gDNA 20) da etapa 2, 8 µ l de Block(100P) P5, 8 µ l de Block(100P) P7 e 5 µ l de berço-1 DNA (1 µ g / µ l) em um tubo estéril. Secar o conteúdo do tubo usando um concentrador de vácuo fixado em 60 ° C.
2. Cruzar a captura de DNA probes com a biblioteca.
   ,
   1. Adicione os seguintes componentes para o tubo de passo 3.1: 8,5 µ l de tampão de hibridização de X 2, 2,7 µ l de potenciador de hibridação e 1,8 µ l de nuclease livre ddH ₂ O.
   2. Mix de pipetagem para cima e para baixo e incubá-los em uma thermomixer a 95 ° C por 10 min.
   3. Após incubação, imediatamente adicione 4 µ l de sondar o costume. Incubar as amostras em um termociclador em 65 & #176. o; C com tampa aquecida a 75 ° C por 4 h.
3. Captura de fragmentos de DNA
   1. Incubar o ADN alvo hibridizado com grânulos streptavidin seguidos lavando as contas para retirar DNA desacoplado. Use o kit comercial de acordo com o fabricante ' instruções de s para obter um final 20 µ l de ressuspensão grânulos com DNA capturado fragmentos.
4. Fragmentos de amplificação do DNA capturado
   1. realizar PCR usando o comercial kit com 2 oligonucleotides de espinha dorsal µM, de acordo com o fabricante ' instruções de s.
   2. Reação de PCR o quando for concluída, adicionar 45 µ l de suspensão grânulos diretamente para o produto do PCR e enriquecer os fragmentos de DNA alvo amplificado vinculados aos talões por eluição com 30 µ l de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Quantificar os fragmentos de DNA com o kit de quantificação de biblioteca e determinar o comprimento do fragmento de média pelo Bioanalyzer ( Figura 2).

4. sequenciamento

1. sequência multiplexado bibliotecas usando 75 bp emparelhado-participante executa em um sequenciador de bancada para dados de Total de 18 h. produzidos são até 60 Gigabytes, 15 G é necessário para a amostra do paciente cfDNA e 1g para controle amostra gDNA.

5. fluxo de trabalho de análise de dados

Nota: a Figura 3 exibe o processo de análise de dados e fluxo de trabalho geral. Parâmetros de análise de dados e comandos são mostrados abaixo.

1. Filtrar leituras de baixa qualidade e corrigir erros e mascaramento de UID usando NCfilter.
   NCfilter(own)
   NCfilter filtro -l 5 - q 0.5 -n 0.1 -T 3 - G -1 fastq1-2 fastq2
   realSeq(own)
   python bin/realRealSeq fq1 MaskUID -1-2 fq2 -ó saída dir -p prefixo -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f.
2. Hg19 do genoma de referência (genoma humano 19), localize os resultados de sequenciamento usando mem BWA (versão 0.7.12-r1039) e realinhar com Genome Analysis Toolkit (GATK) (versão 3.4-46-gbc02625).
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
   GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conhecido dbsnp —
   allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - eu cancerBam-eu normalBam
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conhecido dbsnp
   - allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervalos-eu cancerBam-eu normalBam
As duplicatas de acordo com o UID e a posição dos fragmentos do modelo, que irá corrigir o erro bases introduziram por PCR/sequenciamento e modificar a qualidade da base de cluster
3. .
   realSeq(own)
   python realSeq/bin/realSeq de CLUSTER -p -b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -ó output_dir
   prefixo -m 6
4. re-alinhar as duplicatas em cluster pela BWA Madame
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
5. realizar um realinhamento local, seguido de uma recalibração de contagem de base de qualidade usando GATK (versão 3.4-46-gbc02625).
   Realinhamento de localizar: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conhecido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -CancerBam-eu normalBam
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conhecido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalos-eu cancerBam-eu normalBam
   base recalibração de qualidade-Pontuação: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites cósmica - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - eu java de grp -o bam-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-eu bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
6. para SNV (single-nucleotide variante) e chamando INDEL (pequenas inserções ou exclusões), a precisão das mutações de baixa frequência é ainda mais confirmada pelo GSR (bom suporte lê) com ambos frente e verso vertente ler pares e filtração através do grupo de controle (mutações do germline) e banco de dados de base.
   realDcaller(own)
   python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30
7. usar amostras de base como um controle para ligar CNV (variação de número de cópia).
   NCcnv(own)
   python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv..--normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk
8. Realigned desmapeada, clipes e leituras de pares discordantes chamar SV (variações estruturais).
   NCsv(own)
   python NCsv -t tmpdir - r hg19 -ó outputdir x - transcrição -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

Resultados

As sondas de 1021 kb regiões-alvo enriquecido usadas em ER-Seq são mostradas na tabela 1, que abrange mais de 95% das mutações gene em 12 tumores comuns. A vasta gama de tais sondas torna este processo aplicável para a maioria dos pacientes com câncer. Além disso, nosso exclusivo sequenciamento adaptadores e triagem de banco de dados de base tornam possível detectar mutações raras precisamente.

Discussão

A existência de circular de DNA do tumor (ctDNA) foi descoberta há mais de 30 anos atrás, no entanto, a aplicação de análises ctDNA é ainda não é rotina na prática clínica. Interesse na aplicação prática dos métodos de ctDNA aumentou com o desenvolvimento de tecnologias para a detecção de ctDNA e análise. Tumor de monitoramento com ctDNA oferece uma abordagem minimamente invasiva para a avaliação de doença residual microscópica, resposta à terapia e perfis molecular do tumor sob o fundo do tumor ev...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51105	DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Measure cfDNA concentration
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32853	Measure library concentration
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent	5067-1504	Measure cfDNA and library fragments
The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	E7645L	Library Preparation
Agencourt SPRIselect Reagent	Beckman	B23317	DNA fragment screening and purification
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	Dissolution
xGen Lockdown Probes	IDT	——	xGen Custom Probe
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Targeted DNA capture
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Targeted DNA capture
xGen Lockdown Reagents	IDT	1072281	Targeted DNA capture
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	post-capture PCR enrichment libraries
KAPA Library Quantification Kit	KAPA	KK4602	Measure library concentration
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Measure gDNA concentration
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantify
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubation
16-tube DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina