Determinação das taxas de decaimento transcrição de todo o genoma em quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos

Resumo

Descreveremos um protocolo para gerar proliferando e quiescentes fibroblastos dérmicos humanos primários, taxas de decomposição de transcrição de monitoramento e identificação de genes diferencialmente em decomposição.

Resumo

Quiescência é um estado temporário, reversível, em que células cessaram a divisão celular, mas mantém a capacidade de proliferar. Vários estudos, incluindo a nossa, têm demonstrado que a quiescência está associada a generalizada alterações na expressão gênica. Algumas destas mudanças ocorrem através de alterações no nível ou atividade associada a proliferação de factores de transcrição, tais como E2F e MYC. Nós demonstramos que o decaimento do mRNA também pode contribuir para alterações na expressão gênica entre células proliferando e quiescentes. Neste protocolo, descrevemos o procedimento para estabelecer culturas quiescentes e proliferação de fibroblastos humanos prepúcio dérmica. Em seguida, descrevemos os procedimentos para inibir nova transcrição em células proliferando e quiescentes com actinomicina D (ActD). ActD tratamento representa uma abordagem simples e reprodutível para desassociar nova transcrição do decaimento de transcrição. Uma desvantagem da fatura de tratamento é que o curso de tempo deve ser limitado a um curto espaço de tempo porque ActD afeta a viabilidade celular. Níveis de transcrição são monitorados ao longo do tempo para determinar as taxas de decomposição de transcrição. Este procedimento permite a identificação de genes e isoformas que apresentam deterioração diferencial em proliferando contra fibroblastos quiescentes.

Introdução

Níveis de estado estacionário de transcrições refletem a contribuição de decaimento de transcrição e síntese de transcrição. Regulamentada e coordenada transcrição decaimento é um importante mecanismo para controlar processos biológicos^1,2,3,4. Por exemplo, taxas de decomposição de transcrição foram mostradas para contribuir para a série temporal de eventos após a ativação pela citoquina inflamatória fator de necrose tumoral⁵.

Mostramos anteriormente que a transição entre a proliferação e quiescência em fibroblastos humanos primários está associada a alterações dos níveis de transcrição de muitos genes⁶. Algumas destas mudanças refletem as diferenças na atividade de fatores de transcrição entre estes dois Estados.

Mudanças na taxa de decaimento de uma transcrição também podem contribuir para as alterações do nível de expressão de uma transcrição em dois Estados diferentes^7,8. Baseado em nossos achados anteriores que a transição entre a proliferação e quiescência está associada a alterações nos níveis de vários microRNAs⁹, perguntamos se existe também uma contribuição do decaimento de transcrição diferencial nas alterações em expressão gênica em proliferando contra fibroblastos quiescentes.

A fim de monitorar a estabilidade de transcrição, determinamos a taxa de decaimento de transcrições todo o genoma em proliferando contra células quiescentes. Para conseguir isso, temos monitorado taxas de decaimento em proliferando contra fibroblastos quiescentes introduzindo um inibidor da nova transcrição e monitorar a taxa em que as transcrições individuais desapareceram ao longo do tempo. A vantagem dessa abordagem é que, em comparação com métodos que simplesmente monitorar geral expressão gênica, inibindo a síntese de transcrição novo, seremos capazes de determinar a taxa de decaimento para essas transcrições separadamente da taxa em que forem transcrito.

ActD tratamento para inibir a transcrição de nova e determinar taxas de decaimento de transcrição tem sido aplicado com sucesso em vários estudos anteriores. ActD tem sido usada para dissecar a importância da estabilidade de RNA nas mudanças na abundância de transcrição que resultam do tratamento com citocinas pró-inflamatórias⁵. Uma abordagem similar também tem sido utilizada para dissecar as diferenças na taxa de decaimento de transcrição em proliferando contra células diferenciadas de C2C12 como a adoptarem uma diferenciada músculo fenótipo¹⁰. Como outro exemplo, global mRNA meias-vidas também foram detectados em pluripotentes e tronco embrionárias diferenciadas do mouse células¹¹. Nestes exemplos, decaimento do mRNA tem demonstrado ser importante para a regulação da abundância de transcrição e para a transição de células a célula diferentes Estados.

Aplicando os métodos descritos abaixo, descobrimos que mudanças nas taxas de decomposição de transcrição em aproximadamente 500 genes quando comparando os fibroblastos em proliferação e quiescente Estados¹². Em particular, nós descobrimos que os destinos do microRNA miR-29, que é ativador nas células quiescentes, são estabilizados quando células de transição de quiescência. Aqui descrevemos a metodologia que usamos para determinar taxas de deterioração nas células proliferando e quiescentes. Esta metodologia é útil para comparar taxas de decaimento do mRNA global em duas distintas mas condições semelhantes quando é solicitada informação sobre decaindo rapidamente os genes. Ele também pode ser usado para abordar outras questões tais como o efeito das condições de cultura celular na decadência de transcrição, por exemplo, em duas dimensões contra três culturas dimensionais. Taxas de decomposição podem ser determinado genoma-largo com métodos como microarrays ou RNA-Seq. Alternativamente, em tempo real qPCR ou mancha do Norte pode ser usada para determinar as taxas de decomposição de forma gene-por-gene ou isoform-por-isoforma. Estas taxas podem ser usadas para calcular a meia-vida de cada gene monitorado e identificar genes com taxas de decomposição que são diferentes em duas condições.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram aprovados pelos conselhos de avaliação institucional na Universidade de Princeton e a Universidade da Califórnia, em Los Angeles.

1. prepare fibroblastos proliferando e inibida pelo contato para curso de tempo ActD

Nota: Este protocolo utiliza uma timecourse com quatro momentos. Três amostras biologicamente independentes podem ser coletadas por commit através da recolha de placas de cultura de tecidos diferentes em um experimento, ou o experimento pode ser repetido várias vezes com diferentes culturas de células. Em nossa experiência, um prato de cultura de tecido de 10 cm (diâmetro) (uma placa) fornece RNA suficiente para análise. Se necessário, vários pratos de cultura de tecido podem ser agrupados para cada amostra a aumentar o número de células em cada commit. Além disso, o mesmo experimento pode ser executado com fibroblastos isolados de diferentes indivíduos como Replica biológico verdadeiramente independente.

1. Estabelece culturas quiescentes e proliferação de células para a análise de decomposição de transcrição. Para pilhas proliferating, separam as células a cada três dias enquanto as células inibidora de contato estão se tornando inibida pelo contato.
   1. Para as células de contato-inibida, mude o meio de cada 2 dias durante 7 dias. Dividi as pilhas proliferating 2 dias antes dos fibroblastos inibida pelo contato estão prontos para a coleção. Um exemplo de um esquema de cultura de células é mostrado na Figura 1. As etapas restantes nesta seção fornecem um protocolo detalhado para estabelecer e divisão das células.
2. Isole os fibroblastos dérmicos primários da pele neonatal de acordo com protocolos estabelecidos¹³. Fibroblastos de passagem para garantir uma população homogênea.
   Nota: Fibroblastos podem ser congelados e descongelados, se necessário.
3. Descongele ou replate fibroblastos, se necessário. Cresce fibroblastos em DMEM com 10% de soro sob condições estéreis em uma incubadora de cultura de tecidos em 37 ° C e 5% de CO₂. Use os fibroblastos que foram produzidos para menos de 10 passagens. Fibroblastos devem ser < confluente de 80% no dia de dividir células tornar as populações proliferando e quiescentes.
4. Para dividir um prato de cultura de tecido em várias placas, escaldar PBS, tripsina e meio com o soro em um banho de água de 37 ° C por 20 min.
5. Aspirar ou usar uma pipeta para remover o meio de cada placa de cultura de tecidos com células para ser replated.
6. Pipeta quente PBS em cada prato (10 mL da solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de 6 placa bem) e 1 mL para um poço de um prato bem 12.
7. Aspirado ou pipeta para remover PBS de cada placa de cultura de tecido.
8. Delicadamente, Pipetar 1 x Trypsin-EDTA em cada prato (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12).
   Nota: Fazer 1 x Trypsin-EDTA diluindo estéril 10 x Trypsin-EDTA em PBS estéril. A solução final 1 x deve ser EDTA de tripsina e 0,02% 0,05%.
9. Incube a tripsina com células por 5 min.
10. Bata levemente a placa para desalojar as células da placa.
11. Pipetar para Ressuspender as células em suspensão uma única célula.
12. Células em solução de tripsina de transferir para um tubo cônico, contendo o mesmo volume de DMEM com 10% de soro (8 mL de solução para uma placa de 150 mm, 3 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um 12 bem da placa).
13. Spin para baixo as células a 4 ° C por 5 minutos a 1.000 x g para remover a tripsina.
14. Ressuspender as células em um volume adequado do meio e contagem com um hemacytometer para determinar a concentração de células.
15. Sementes de 5 x 10⁵ células por placa de cultura de tecidos de 100 mm para se proliferando e células inibida pelo contato.
16. Usando esse método, estabelece as amostras de proliferação e inibida pelo contato exigidas para análise (Figura 1).

2. ActD tempo curso

1. Resuspenda ActD na concentração das ações de 1 mg/mL (para 1 mg de fatura, uso, 950 µ l de PBS estéril e 50 µ l de DMSO estéril).
   Nota: Soluções estoque congeladas da fatura devem ser estáveis por um mês a-20 ° C. Soluções diluídas devem ser descartadas e não armazenadas de continuar a utilizar.
2. Adicionar ActD ao volume apropriado de escaldadas médio para toda a cultura biológica célula replicar as placas que foram definidas para 0, 120, 240 e 480 min momentos (Figura 2). Adicione ActD na concentração de 15 µ g / mL de meio. Misture bem, Aspire fora o antigo médio e adicionar ActD contendo meio para as células.
   1. Para um estoque de 1 mg/mL, adicionar 15 µ l fatura para cada mL do meio, por exemplo, para 10 mL de meio para uma placa de 100mm, adicione 150 µ l ActD.
3. Para coletar a amostra de commit zero, aspire suavemente o ActD médio e pipetar pré-aquecido PBS para as células. Pipetar 10 mL de solução para uma placa de 150 mm, 5 mL de solução para uma placa de 100 mm, 2 mL para um poço de um prato bem 6 e 1 mL para um poço de um prato bem 12.
4. Aspire suavemente ou pipeta fora da PBS.
   Nota: Todas as etapas que envolvem o isolamento do RNA devem ser realizadas com água livre de RNase, livre de RNase microcentrifuga tubos e pipetas RNase-livre. Luvas devem ser usadas e alteradas com frequência ao trabalhar com o RNA.
5. Adicione solução de isotiocianato de guanidina-fenol (1 mL/10-cm placa com 4 x 10⁵ 4 x 10⁷ células) diretamente para a placa de cultura de tecidos.
   Nota: Solução de isotiocianato de guanidina-fenol é uma solução de monofásico que mantém a qualidade do RNA enquanto lise de células e separando proteínas, DNA e RNA.
   Cuidado: Isotiocianato de fenol e guanidina são corrosivos. Use proteção adequada.
6. Pipetar o fenol-guanidina isotiocianato solução-célula a mistura acima e para baixo várias vezes para fazer uma mistura homogênea.
   Nota: A solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisada pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite ou a-20 ° C por até um ano.
7. Recolha a cada ponto do tempo decorrido a quantidade adequada de tempo usando o método descrito em etapas 2.3-2.6.

3. isolamento do RNA Total da solução de isotiocianato de guanidina-fenol lisado

1. Incube as amostras à temperatura ambiente por 5 min garantir a completa dissolução de complexos de RNA-proteína.
   Nota: Os passos do protocolo de solução de isotiocianato de guanidina-fenol podem ser executados à temperatura ambiente a menos que indicado o contrário.
2. Introduza as transcrições de pico-no controle que podem ser detectadas com a metodologia utilizada.

Introduza esses controles em cada amostra em uma quantidade conhecida e concentração.
Nota: O externo RNA controle consórcio (ERCC) pico-no controle mistura¹⁴ foi desenvolvida especificamente como um pico no controle para RNA-Seq Ele também pode ser usado para os borrões do Norte ou em tempo real qPCR. Pico-no controles projetados especificamente para microarray tecnologias também estão disponíveis (ver Tabela de materiais).

Transfira a mistura de solução de isotiocianato de guanidina-fenol para um tubo de microcentrifugadora de 2,0 mL com uma pipeta. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio à mistura de solução de fenol-guanidina isotiocianato para cada 1 mL de solução de isotiocianato de guanidina-fenol usada (por exemplo, adicionar 0,3 mL de clorofórmio para mistura de solução de isotiocianato de guanidina-fenol 1,5 mL).

Agitar o tubo microcentrifuga vigorosamente por 15 s e então incubar a mistura de isotiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio à temperatura ambiente por 3 min.

Girar as amostras a 12.000 x g por 20 minutos a 4 ° C.
Nota: Após a rodada inicial, a amostra deve separar em 3 camadas - uma camada orgânica vermelha na parte inferior, uma interfase branco/rosa no meio e uma camada aquosa clara na parte superior (Figura 3).

Transferi a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifuga 2,0 mL utilizando uma micropipeta.
Nota: Tenha cuidado para não perturbar a intérfase durante este processo. É okey deixar algum da fração aquosa. É melhor deixar um pouco da fração aquosa do que para também incluir algumas das camadas da interfase, como incluindo a interfase camada poderia contaminar o RNA com DNA. A camada aquosa será aproximadamente metade do volume inicial, então cerca de 0,9 mL se a mistura de clorofórmio/solução de isotiocianato de guanidina-fenol foi de 1,8 mL.

Descarte a interfase e frações orgânicas.

Adicionar um volume igual de 2-propanol a fração aquosa e inverter o tubo 10 vezes. Adicione até 1 µ l de solução aquosa de 20 mg/mL de glicogênio por 20 µ l de amostra, especialmente se o rendimento é esperado para ser baixo, porque menos de 10⁶ células foram coletadas.
Nota: Isto irá resultar em uma pelota densa, sólida que é fácil de monitorar após as etapas de centrifugação que seguem.

Incube as amostras à temperatura ambiente por 10 min.

Girar as amostras a 12.000 x g por 20 minutos a 4 ° C. Garantir que, no fim deste spin, o RNA precipitou-se para formar um sedimento branco no fundo do tubo.

Com uma pipeta, remover e descartar o sobrenadante tomar cuidado especial para não perturbar a pelota do RNA branca.
Nota: A ponta da pipeta solto realizada na mão pode ser usada para remover o excesso etanol. Se a pelota do RNA é perturbada, mas não descartada, o investigador pode repetir a girar e remover o sobrenadante novamente. Evite descartando a pelota como isto exigirá o investigador para repetir todo o procedimento.

Prepare uma solução de água de 75% de etanol e 25% livre de nuclease. Adicione 1 mL de etanol a 75% por 1 mL de reagente de solução de isotiocianato de guanidina-fenol para lavar o sedimento.

Girar as amostras a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.

Depois de retirar a maior parte do sobrenadante, use uma pipeta para remover tanto etanol quanto possível, enquanto ainda está tomando cuidado para não perturbar a pelota.
Nota: A pelota do RNA é menos compacta neste passo e tende a subir. Cuidado ao manusear a pelota neste momento para evitar a perda do RNA.

Gire as amostras 12.000 x g por 2 min à temperatura ambiente a pelota todo excesso de etanol.

Retire todo excesso de etanol o tubo utilizando uma micropipeta, tendo o cuidado de não perturbar a pelota.

Deixe o ar de pelota do RNA secar por 5 min.

Adicionar 50 µ l de água livre de nuclease para a pelota do RNA e resuspenda o pellet em água livre de nuclease.

Tratar as amostras com 1 µ l DNase (2 unidades / µ l) para remover o DNA e então inativar DNase e cátions (ver Tabela de materiais).

Armazenar as amostras de RNA em tubos de microcentrifuga 2,0 mL a-80 ° C.

4. análise da abundância de transcrição

1. Verificar RNA pureza usando um espectrofotômetro e quantificar o RNA.
   Nota: A relação da absorvência em 260 nm a 280 nm deve ser aproximadamente 2.0 para o RNA.
2. Analise RNA com um gel de agarose a 1% ou uma tecnologia equivalente para visualizar a extensão da degradação.
   Nota: Duas claras bandas representando 18S e rRNA 28S deve ser claramente visíveis (Figura 4). Se essas bandas não são visíveis, o RNA pode ser degradado. Dicas de tiro problemas para degradação do RNA são fornecidas na discussão.
3. Abundância de transcrição monitor nas alíquotas recolhidas do RNA em comparação com o cravado no padrão interno usando microarrays¹⁵, RNA-Seq¹⁶, em tempo real qPCR¹⁷, ou norte borrões¹⁸.
   1. Determine a abundância para cada transcrição em cada ponto de tempo em comparação com um controle cravado em abundância conhecida.
      Nota: Para microarrays, os valores serão as intensidades de fluorescência. Para os borrões do Norte, bandas do filme de raios-x podem ser quantificadas. Para qPCR em tempo real, a abundância de transcrição pode ser determinada por comparação com padrões conhecidos com o 2^{- σσC}_T método¹⁹. Para RNA-Seq, valores normalizados podem ser determinados como FPKM ou fragmentos por quilobase do exon por milhão leituras mapeado. Para taxas de decaimento isoforma específica, RNA-Seq dados podem ser analisados utilizando metodologias isoform reconhecem como DEXSeq²⁰. Taxas de decaimento isoforma específica melhor são determinadas com RNA-Seq Se eles são determinadas com dados de microarray, os dados devem ser analisados em uma base de sonda-por-sonda ao invés de uma base de gene-gene-por. O analista deve ter cuidado ao interpretar a informação de um número limitado de sondas. Por exemplo, pode haver 5 ou menos sondas que são informativas sobre uma isoforma específica. Neste caso, o analista precisará determinar se o comportamento de tais sondas é suficientemente consistente para que os resultados são confiáveis.
4. Execute em tempo real qPCR na RNA isolado¹⁷ nas amostras coletadas para analisar genes rapidamente em decomposição, como c-Myc e um gene lentamente decadente como GAPDH, ganhar confiança essa decadência de transcrição taxas foram detectadas com precisão.
   Nota: Para confirmação, sondas isoform-específicos em tempo real qPCR podem ser desenvolvidas e usadas para monitorar a abundância de isoformas específicas ao longo do tempo²¹.

5.Determinação constante de decaimento taxa

1. Para cada commit, log-transformar os valores de abundância para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos).
   Nota: Log-transformando os valores irão converter as curvas de decaimento exponencial para linhas que podem ser cabidas com um decaimento linear modelo²².
2. Se encaixa no perfil de expressão para cada transcrição (gene-específico ou isoforma específicos) para um modelo linear de decadência. A fórmula para esse modelo é f (t) = C - r * t. Nesta equação, C é uma constante que representa o montante inicial de uma transcrição, r é a taxa de declínio e t é o tempo desde o início do experimento. Desta equação, determinar a taxa de deterioração, como r*ln(10) (ver referência¹¹).
   Nota: O pacote de software maSigPro é uma abordagem baseada em regressão, projetada para detectar diferenças de perfil de expressão de gene significativo no tempo curso dados²³. Resultados para maSigPro e código de exemplo estão disponíveis em: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.
3. Filtre os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência. Isso pode ser feito com um teste F ANOVA.
   Nota: O teste F é baseado na estatística F, que é definida como a variação entre os meios de amostra divididos pela variação dentro de amostras. Corrigi os valores de p para comparações múltiplas aplicando o linear Step-up Benjamini e Hochberg falsa descoberta procedimento²⁴. Um q-valor maior que 0,05 com o F-teste pode ser usado como um limite para os genes que não conseguem encaixar um modelo log-linear de decadência.
4. Executar um teste F ANOVA para determinar as transcrições com um termo de interação significativa entre uma condição categórica de ciclo celular e o tempo (taxa falsa da descoberta, FDR < 0,05).

Resultados

Nós já relatado os resultados das análises de microarray de taxas de decaimento de transcrição em proliferação e inibida por contato primários fibroblastos humanos ao longo de um curso de 8 horas¹². É fornecida uma lista de genes com uma mudança significativa na estabilidade de transcrição comparando fibroblastos proliferando e inibida pelo contato em complementar a tabela 1. As intensidades de fluorescência no tempo zero e um longo te...

Discussão

Quiescência pode ser induzida por sinais externos, incluindo a retirada de mitógenos ou soro, falta de aderência de célula e inibição de contato. Inibição de contato, um dos vários métodos possíveis para indução de quiescência, é um processo altamente evolutivamente conservado em que células sair do ciclo celular proliferativo em resposta ao contato célula a célula. Aqui focamos na inibição de contato como um exemplo de um método para induzir quiescência. Estudos anteriores relataram que contato cé...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
Equipment for running agarose gels
Sterile tissue culture plates and conical tubes
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Life Technologies	11965-118
Fetal bovine serum	VWR	35-010-CV
Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	For decontaminating work surfaces from RNase
2.0 ml eppendorf tubes
Trypsin-EDTA  Solution 10X	Millipore Sigma	9002-07-07
Sterile PBS	Life Technologies	14190-250
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Actinomycin D	Millipore Sigma	A1410-2 mg	inhibits transcription
Sterile DMSO	Fisher Scientific	31-761-00ML	solvent for actinomycin D
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	ICN19400225	MP Biomedicals, Inc product
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618500	molecular biology grade
Ethanol	Fisher Scientific	BP28184	molecular biology grade
RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution)	Thermo Fisher Scientific	R0551	carrier for RNA precipitation
TURBO DNA-free Kit	Thermo Fisher Scientific	AM1907	removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
Agarose	Thermo Fisher Scientific	ICN820721	MP Biomedicals, Inc product
Loading dye for RNA gel	Thermo Fisher Scientific	R0641	suitable even for denaturing electrophoresis
Millenium RNA markers	Thermo Fisher Scientific	AM7150	RNA ladder
One-color RNA Spike-in Kit	Agilent Technology	5188-5282	Example spike-in control for Agient microarray analysis
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	molecular biology grade, for TAE buffer
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38-500	for TAE buffer
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500	electrophoresis grade, for gels
Ethidium bromide	Millipore Sigma	E7637	for molecular biology
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix	Thermo Fisher Scientific	4456740	Spike-in control for RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes)	Illumina	RS-122-2101	for RNA Seq
96-well 0.3 ml PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB-0600	for real-time qPCR
Microseal B adhesive seals	Bio-Rad	MSB1001	for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs	VWR	89094-662	for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps	Thermo Fisher Scientific	AM12230	for real-time qPCR
SuperScript Reverse Transcriptase	Invitrogen	18090010	for real-time qPCR
AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	for real-time qPCR