Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Resumo

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Resumo

Dano do ADN é um fenômeno comum para cada célula durante sua vida útil e é definido como uma alteração da estrutura química do DNA genômico. Terapias de câncer, tais como o rádio e quimioterapia, apresentar a enorme quantidade de danos adicionais de DNA, levando à detenção do ciclo celular e apoptose para limitar a progressão do câncer. Avaliação quantitativa do dano do ADN durante a terapia de câncer experimental é um passo fundamental para justificar a eficácia de um agente genotóxico. Neste estudo, focamos em um ensaio de electroforese única célula, também conhecido como o ensaio cometa, que pode quantificar single e double-strand DNA quebras em vitro. O ensaio cometa é um método de quantificação de dano de DNA que é eficiente e fácil de executar, e tem exigências de tempo/orçamento baixas e alta reprodutibilidade. Aqui, destacamos o utilitário do ensaio cometa para estudos pré-clínicos, avaliando o efeito genotóxico de terapia de combinação olaparib/temozolomide U251 células de glioma.

Introdução

O ensaio cometa foi primeiro desenvolvido por Ostling e Johanson, em 1984, demonstrando que a migração do DNA fragmentos dos núcleos sob uma condição neutra¹. A técnica foi desenvolvida mais tarde por Singh et al, mostrando que uma condição alcalina aumentou substancialmente a especificidade e a reprodutibilidade do ensaio². Desde então, o ensaio cometa neutro é usado principalmente para detectar quebras de DNA dupla-hélice, Considerando que o ensaio cometa alcalino é mais sensível para pequenas quantidades de dano do ADN, incluindo único e quebra de DNA de fita dupla, alcaloide-labile sites, DNA-DNA ou Cross-linking da ADN-proteína e quebras de single-strand DNA associadas com incompleta excisão reparar sites^3,4. Ambos os ensaios permitem a visualização de DNA fragmentado e fornecem uma maneira simples de avaliar quantitativamente o dano do ADN. O ensaio cometa é considerado como um método sensível para os estudos toxicológicos in vitro e em vivo genéticos e é aplicável a áreas de investigação diferentes, tais como a seleção precoce de drogas-candidato, monitoramento ambiental, a biomonitorização humana, e fundamental Pesquisar no dano do ADN e reparar⁵.

O princípio do ensaio é que sob um campo elétrico, DNA fragmentado migra para fora do corpo do nucleoide (também conhecido como o "cabeça de cometa") e forma uma mancha de DNA no gel do agarose (também conhecido como a "cauda de cometa"). Com coloração de nucleótidos, a extensão dos danos do DNA pode ser quantificada pela análise "cometas", formados por electroforese esta única célula. Cálculo do momento de cauda mais pode ajudar a comparar o dano do ADN entre diferentes grupos experimentais. Em comparação com métodos tradicionais de detecção de danos do DNA, o ensaio cometa é direta, sensível, barata e relativamente simples.

Radioterapia e agentes quimioterápicos são estratégias comuns para o tratamento de câncer, gerando único filamento e quebras de DNA de fita dupla em cromossomos⁶. O avanço recente em inibidores de reparação do ADN permite um mais eficaz efeito genotóxico pela quimioterapia de combinação e, portanto, potencialmente reduz os efeitos secundários sistêmicos tais como anemia, infecção e medula óssea supressão^{7, 8}. neste estudo, mostramos a investigação de um inibidor de poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), olaparib (Ola)⁹. PARP é uma proteína nuclear abundante e é responsável pelo reparo de excisão de base de DNA, formando um polímero de poli (ADP-ribose)¹⁰. Temozolomide (TMZ) é um Agente alquilante disponível por via oral e tem sido amplamente utilizada para o tratamento do paciente de glioma. Usando o ensaio cometa para quantificar os danos do DNA, demonstramos que combina olaparib com temozolomide profundamente aumenta o dano de DNA em células de glioma, que sugere a terapia combinada de olaparib/temozolomide é uma estratégia eficaz para tratar de glioma, comparado com o temozolomide sozinho¹¹.

Protocolo

1. preparar reagentes

1. 1X PBS
   1. diluir 100 mL x 10 PBS com 900 mL dH ₂ O e ajustar o pH para 7,4 usando um medidor de pH. Armazenar em temperatura ambiente.
2. Solução de lise (LS)
   1. preparar 2,5 M NaCl, EDTA dissódico de 100 mM, 10 mM Tris base e 200mm NaOH em 900 mL dH ₂ O; comumente leva cerca de 20 min para permitir a mistura dissolver totalmente. Ajuste o pH a 10 usando um medidor de pH. Adicionar sarcosinate de Laurilsulfato de sódio 1% e 1% Triton X-100 e ajustar o volume final de 1.000 mL. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
3. Solução de eletroforese alcalina (AES), pH > 13
   1. preparar dissódico NaOH e 1 mM 200 mM EDTA em 800 mL dH ₂ O. ajustar o pH e certifique-se que é pH > 13. Ajuste o volume final de 1.000 mL. Fazer fresco antes do utilizar e refrigerar a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
4. Sollution electroforese neutro (NES)
   1. preparar 1.000 mL de tampão de eletroforese neutro misturando 100 mM Tris base e 300mm de acetato de sódio para 1.000 mL dH ₂ O. ajustar o pH a 9.0 com ácido acético glacial. Legal a 4 ° C, durante pelo menos 30 min antes do uso.
5. Solução de precipitação de DNA (DPS)
   1. preparação de ações de acetato de amónio de 7,5 M 10 mL. Para 50 mL de solução de precipitação de DNA, mistura de acetato de amónio 6,7 mL 7,5 M com 43,3 mL de etanol 95%. Armazenar em temperatura ambiente.
6. Solução de coloração
   1. Adicionar 1 µ l 10.000 x mancha verde fluorescente de ácidos nucleicos (por exemplo, SYBR Green) em tampão de 30 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, EDTA dissódico de 1 mM, pH 7,4) e loja em 4 ° C. proteger da luz.
7. 1% baixa fusão agarose
   1. derreter 1% baixa fusão ponto agarose (1 g em 100 mL dH ₂ O) no microondas. Agite a agarose cada 15-20 s para certificar-se que a agarose é completamente derretido. Coloque o agarose em banho de água a 37 ° C pelo menos 20 min antes do uso.
8. Pontas de pipetas pre-quente
   1. cortar as extremidades estreitas de pontas de pipetas P200 por 3 mm e quente a 37 ° C antes de pipetagem agarose.

2. Preparar os Slides cometa

1. , deslize o revestimento
   1. Melt agarose a 1% (1 g em 100 mL dH ₂ O) no microondas durante 2-3 minutos ou até que a agarose é completamente derretido. Mergulhar as vidro corrediças do microscópio para a agarose e limpar um lado da lâmina utilizando um cotão.
   2. Colocar os slides sobre uma superfície plana para secar ao ar livre ou aqueça a 50 ° C para secagem mais rápida; um filme de agarose transparente deve ser formado após a secagem. Coloque as lâminas revestidas em 37 ° C antes do uso.
2. Preparação de suspensões celulares único
   1. cultura e tratar as células de glioma
      1. cultura as células U251 MG em meio DMEM-Ham F-12 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 10 de µ g/mL em 37 & # 176; C com 5% de CO ₂.
      2. Digerir as células usando a tripsina 1 mL por 3 min e neutralizar a tripsina usando meio DMEM-Ham F-12 com FBS. Coletar em tubo de 15 mL, giram a 300 x g, durante 4 min, Aspire o meio e suspender as células em 2 x 10 ⁵ células/mL de 1X PBS.
         Nota: A amostra de célula deve ser preparada imediatamente antes de iniciar o ensaio e todas as amostras devem ser manuseadas em um ambiente escuro ou esmaecido para evitar danos no DNA da luz.
      3. Combinar a suspensão de células com agarose a 1% derretido baixo ponto de fusão (a 37 ° C) na proporção de 01:10 (v/v), misture suavemente pipetando para cima e para baixo e imediatamente distribuir 30 µ l de uma lâmina. Use o lado da ponta da pipeta para espalhar a mistura para garantir a formação de uma camada fina de agarose/célula.
      4. Coloque a corrediça plana a 4 ° C, no escuro por 10 min., aumentando o tempo de coagulação para 30 min melhora a aderência das amostras em ambientes de alta umidade.
      5. Imergir o slide em 4 ° C LS no escuro por 1h durante a noite.

3. Única célula eletroforese

1. prosseguir com alcalino (passo 3.2) ou cometa neutro (passo 3.3) do ensaio
2. para ensaio cometa alcalina
   1. gentilmente remover slides de LS, escorra o excesso reserva e delicadamente mergulhe na AES por 1h no 4 ° C para permitir o desenrolar de DNA. Manter os slides no escuro.
   2. Adicionar pre-refrigerados AES na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima os slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 30 min em 4 ° C.
   3. Solução de electroforese em excesso de dreno de slide. Mergulhe delicadamente slides duas vezes na dH ₂ O por 5 min à temperatura ambiente.
   4. Delicadamente mergulhe slides em etanol a 70% por 5 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.
3. Para ensaio cometa neutro
   1. Remover suavemente os slides de LS, escorra o excesso tampão e delicadamente mergulhe no NES por 30 min em 4 ° ° C. conservar o slide no escuro.
   Tampão de eletroforese neutro previamente refrigerados
   2. Add na bandeja de slide de electroforese, não deve exceder 0,5 cm acima slides (isso depende do tamanho das unidades de eletroforese), coloque os slides dentro e cubra com uma tampa. Definir a tensão de alimentação para 1 V/cm (o comprimento entre os eletrodos) e executada por 45 min em 4 ° C.
   3. Buffer excesso de drenagem das lâminas de. Mergulhe delicadamente slides em DPS por 30 min à temperatura ambiente.
   4. Delicadamente mergulhe os slides em etanol a 70% durante 30 min à temperatura ambiente. Avance para o passo 4.

4. Mancha de Slides cometa

1. seco slides a 37 ° C por 10-15 min no escuro.
2. Lugar 50-100 µ l verde fluorescente ácido nucleico manchando a solução em cada secas agarose e mancha durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro.
3. Lavar os slides brevemente em dH ₂ O e secar completamente a 37 ° C, no escuro. Proceder à análise e aquisição de imagens.

5. Aquisição e análise de imagens

Nota: A visualização e a quantificação de quebras de DNA baseiam-se na microscopia de epifluorescência e o software do ensaio cometa (ver Tabela de materiais) ¹² .

1. Coloque os slides sobre o microscópio com um suporte de slide. Certifique-se que o gel de agarose é voltado para a lente objetiva. Aleatoriamente, capturam imagens de slides cometa manchada usando um microscópio de fluorescência com uma lente objetiva de 10x. Evitar as bordas e as áreas ao redor de quaisquer bolhas de ar.
2. , Certifique-se de cada cauda de cometa é distribuída horizontalmente. Cabeças de cometa devem se originam da esquerda e a cauda da direita.
3. Salvar cada imagem em um formato binário de TIF com mancha brilhante de DNA e fundo escuro. Carregar imagens para o software usando o " selecione arquivos para analisar " botão, que está localizado no lado esquerdo da barra de ferramentas. Uma janela de exibição de imagem deve aparecer ( Figura 1).
4. Desenhar um quadro de medição na tela e ajustar seu tamanho em conformidade com o cometa da célula. Clique o " ajustar " o botão para configurar o limite da cabeça, cometa, cauda de acordo com a imagem e, em seguida, clique o " começar as medições " botão ( Figura 1).
5. , Selecione uma célula usando o frame e ativar a medição clicando com o mouse sobre o " do ensaio cometa " botão; uma intensidade imagem aparece no " perfis " janela com os parâmetros de medição selecionado. Os resultados podem ser salvos clicando o " armazenar resultado " botão ( Figura 1).
   Nota: O software calcula os parâmetros, incluindo o comprimento da cauda de cometa, a porcentagem de DNA cauda, o momento de cauda (TM) e o momento de cauda verde-oliva (OTM). Os momentos de cauda são calculados por fórmulas como segue:
   
   
6. analisar pelo menos 50 células por tratamento.

Resultados

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para a execução do ensaio cometa e análise de dados (Figura 1). Resultados de ensaios os cometa alcalino e neutro, mostrou que a cauda do cometa de células U251 tratados com doxorrubicina (1 µM, 20 h) era maior e tinha maior intensidade de DNA, sugerindo um acúmulo substancial de DNA fragmentado devido à quimioterapia (Figura 2).

Discussão

O ensaio cometa é uma ferramenta eficiente para medir intervalos de single e double-strand DNA a nível celular. O ensaio foi amplamente aplicado como um "padrão ouro" em estudos sobre a genotoxicidade e biomonitorização¹³, variando de ligações cruzadas base lesões, DNA, desenvolvimento de drogas e locais sensíveis do alcaloide. No presente estudo, mostramos dois protocolos distintos de passo a passo para ensaios de cometa alcalino e neutro, respectivamente. Combinando a electroforese úni...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf