Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Resumo

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de_180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Resumo

Neurite auto-imune experimental (EAN) é um modelo experimental bem apreciado de doenças desmielinizantes periféricas auto-imune. Doença EAN é induzida pela imunizar ratos com peptídeos neurogênicos para dirigir um ataque inflamatório para componentes do sistema nervoso periférico (SNP). Avanços recentes permitiram a indução de EAN na linha de rato relativamente resistente C57BL/6 usando proteína mielina zero (P0)_106-125 ou P0_180-199 peptídeos entregue em adjuvante, combinado com a injeção de toxina de coqueluche. A capacidade de induzir a EAN de estirpe C57BL/6 permite a utilização das inúmeras ferramentas genéticas que existem sobre este fundo de rato e assim permite que o sofisticado estudo da patogênese da doença e interrogatório da ação mecanicista da novela terapêutica em combinação com abordagens transgénicas. Neste estudo, vamos demonstrar uma abordagem simples para induzir com êxito EAN usando o peptídeo de_180-199 P0 em camundongos C57BL/6. Também descrevem um protocolo para a avaliação dos défices funcionais que ocorrem neste modelo, acompanhado por um conjunto de características neuropatológicas. Assim, este modelo é um poderoso modelo experimental para estudar a patogênese das neuropatias desmielinizantes periféricas humanas e para determinar a eficácia de terapias potenciais que visam promover a reparação da mielina e proteger contra danos nos nervos em auto-imune neurite.

Introdução

Neuropatias periféricas podem ser genético na origem ou adquiridos, com neuropatias adquiridas tendo ou metabólica, isquêmica, inflamatórias ou tóxicas precipitants. Estas doenças são também útil classificadas como axonal ou demyelinative na origem. O mais comum adquirida desmielinizantes neuropatias periféricas são aguda desmielinizante Polineuropatia inflamatória (AIDP, também conhecida como síndrome de Guillain-Barré, GBS) e crônica inflamatória desmielinizante polineuropatia (PDIC)^{1, 2 , 3 , 4}; os dois pathogenetically são caracterizados por uma reação auto-imune contra a bainha de mielina, causando desmielinização dos nervos periféricos. Estas doenças, células T ativadas atravessam a barreira de sangue do nervo em geram uma reação imune dentro o PNS. Ativação de macrófagos dentro do nervo então causa desmielinização diretamente via fagocítica ataque ou indiretamente através de mediadores inflamatórios secretados, resultando em deficiências clínicas como paralisia e disfunção sensorial⁵. Enquanto axônios desmielinizados mantêm a capacidade de ser remyelinated seguindo a desmielinização, como muitas vezes é tardio ou incompleta, resultando em susceptibilidade dos axônios nus ao dano irreversível, que é a principal causa da clínica permanente Deficiência. Atualmente, os tratamentos mais eficazes são imunomodulador, mas apesar de sua eficácia, em muitos casos a recuperação é muitas vezes lenta e ~ 25% pacientes experimentarão residuais déficits funcionais que reduzem significativamente a sua qualidade de vida^{6, 7}.

EAN é um modelo animal amplamente utilizado de desmielinizante neuropatia periférica que forneceu insights valiosos sobre patogênese e um meio para avaliar novos agentes terapêuticos⁴. Este modelo pode ser induzido em diferentes espécies, tais como coelhos, ratos, ratos e porquinhos da Índia e é induzida pela imunização com antígenos neurogênicos. No entanto, em última análise, a indução de EAN bem sucedida depende uma resposta imune adequada para doença ocorra. Tendo em conta as variações de espécies (e inter-species/tensão) na função imune, várias combinações de antígenos e adjuvantes foram desenvolvidas para induzir com êxito EAN. Em termos de ferramentas genéticas murino, a C57BL/6 é o mais utilizado; no entanto, o peptídeo de proteína P2 tradicional 57-81 (P2_57-81) que resulta em doença do suscetível SJL rato estirpe⁸ é incapaz de patogênese ilícito, levando a déficits funcionais na linhagem C57BL/6. Felizmente, paradigmas de sensibilização usando o P0_106-125 ou P0_180-199 peptídeos, entregue em adjuvante combinada com a injeção de coqueluche toxina pode superar essa barreira, permitindo que ferramentas sofisticadas de genéticas ser utilizada na modelo murino EAN.

Aqui, um método simples para a indução do EAN nos camundongos C57BL/6 é apresentado. Além disso, uma abordagem abrangente e detalhada por que avaliar os défices funcionais e neuropatológicas associados com a doença é fornecida. O P0_180–199 peptídeo⁹ foi escolhido em preferência a alternativa de_57-81 P0¹⁰. O modelo de₁₉₉ P0_180–tem sido descrito para produzir sinais clínicos menos graves em comparação com a alternativa de_57-81 P0¹⁰e, portanto, susceptível de suportar a introdução de potencialmente perturbações genéticas deletérias, recuperar-se de procedimentos cirúrgicos (como implantação de bomba osmótica) e é passíveis de função de marcha de esteira teste⁴. No entanto, os testes de função da marcha de esteira e histológicos protocolos descritos aqui poderiam facilmente ser aplicados ao estudar a doença em uma variante de_57-81 induzido P0.

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Protocolo

todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Instituto de Florey de neurociência e Saúde Mental (centro do cérebro de Melbourne) Comitê de ética Animal e siga a australiana código de prática para o uso de animais para científico Fins.

1. indução de EAN

Nota: EAN pode ser induzido com sucesso em camundongos C57BL/6 do sexo masculino com idade entre 6-8 semanas. O protocolo de indução leva 9 dias no total. Dia 0 refere-se ao dia da primeira imunização. Para este protocolo, injeções foram realizadas sob anestesia (consulte a etapa abaixo 1.1.2).

1. Em dia -1:
   1. preparar a toxina Pertussis (ver Tabela de materiais) solução 1,6 µ g/ml, utilizando o fosfato de rato-isotônica estéril 0,1 M tampão salino (MT-PBS).
   2. Anesthetization com isoflurano:
      1. Coloque o mouse (C57BL/6, 6-8 semanas, do sexo masculino) na câmara de anesthetization e ajustar o fluxo de oxigênio para 1 L/min.
      2. Ligue o vaporizador de isoflurano, ajustá-la para 2,5% para anesthetization e monitor de respiração e espere por 2 min, ou até reflexos primários (membro da córnea e traseiro) são já não responsivo
   3. Remover o mouse da câmara anesthetization e administrar 250 µ l da solução de toxina Pertussis acima através de uma injeção intraperitoneal (i.p.), utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 30 ^1/2 G.
   4. Preparar o inóculo injetável para imunização:
      1. preparar solução A usar 2 mg/mL solução de peptídeo de _180-199 P0 (com > 98% de pureza, sequência S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) em soro fisiológico a 0,9%.
      2. Preparar Solução B usando 20 mg/mL solução de Mycobacterium tuberculosis (ver Tabela de materiais) em Freund ' adjuvante completo de s (FCA, compreendendo: monoolate 15% mannide + 85% de óleo de parafina e 0,5 mg/mL de dessecada mortos e secos Mycobacterium M butyricum).
      3. Tornar-se o inóculo final para injetar, combinar partes de igual volume de soluções A e B em um batedor do grânulo e misturá-los a uma velocidade máxima por 1 min à temperatura ambiente.
         Nota: Soluções A e B podem ser mantidas como estoque e armazenadas a 4 ° C por um período máximo de um mês, mas o inóculo final combinado deve ser preparado no dia da injeção rato.
2. No dia 0, administrar 50 µ l de inóculo (preparação descrito no passo 1.1.4) em um rato através de uma injeção subcutânea usando uma agulha 23G.
   Nota: A injeção pode ser colocada entre as omoplatas, ou entre os membros traseiros e cauda sobre o dorso caudal.
3. No dia 1, faça a solução de toxina Pertussis 1,2 µ g/ml (em MT-PBS) e administrar 250 µ l em um rato através da injeção i.p. utilizando uma seringa de 0,5 mL com agulha 30 ^1/2 G.
4. No dia 3, repita etapa 1.3 acima.
   Nota: Soluções Stock A e B podem ser feitas e armazenadas a 4 ˚ c por um período máximo de um mês. No entanto, o inóculo injetável final, produzido combinando as soluções A e B, deve ser feito no dia da injeção.
5. No dia 8, administrar 50 µ l de inóculo (preparação descrito no passo 1.1.4) em um rato através de uma injeção subcutânea (consulte a etapa 1.2 supra), no local da injeção mesmo como na etapa 1.2 (para cada animal)

2. Pontuação clínica

1. executar marcando clínica diária, começando no dia 0.
2. Dá cada rato uma pontuação de 0, 1, 2, 3 ou 4 de acordo com os critérios publicados ⁴. Consulte a tabela 1 para marcar clínico do EAN.
   Nota: Para obter consistência, deve ser feito um esforço para marcar os ratos ao mesmo tempo diariamente pelo mesmo pesquisador.

3. Motor de avaliação de função

Nota: O desempenho do motor é avaliado em paralelo com marcador clínico para a mesma coorte de animais. O aparelho de avaliação de função motora deve ser conectado a um computador que tenha um sistema de imagem de função da marcha (ver Tabela de materiais) instalado. Também é recomendável que todos os ratos para ser avaliado devem ser hábito para a tarefa em execução antes da indução da EAN. Para fazer isso, a prática é executado (2 testes por rato) é realizados três dias antes da indução da doença (dia -3).

1. Ligue o instrumento de avaliação de função motora e interruptor no botão luz.
2. Nuca o mouse firmemente tinta seus pés por abaixá-la em um recipiente com tinta vermelha, mantendo sua cauda e.
   Nota: Este passo é necessário para a linhagem C57BL/6, mas pode ser ignorado se estiver sendo usada uma cepa de rato com uma casaco branco cor.
3. Posicione o mouse no compartimento ambulante e definir a velocidade da esteira em 15 cm/s.
4. Ligar a esteira e clique o " registro " botão para capturar o movimento execução do mouse usando a função de marcha, sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais).
5. Usar um timer e medir cada corrida para 36 s. Depois de 36 s, parar gravação e parar a esteira.
   Nota: Os ratos que não podem concluir com êxito a tarefa em execução para este intervalo s 36 são considerados ter falhado.
6. Salvar o arquivo de vídeo na pasta designada.
7. Repita os passos acima para cada mouse para ser avaliado. Testar os ratos com a mesma tarefa em execução a cada 3 dias.
8. Analisar os arquivos de vídeo editados usando software para parâmetros de função de marcha (ver Tabela de materiais).
   Nota: Os detalhes de como analisar os diferentes parâmetros do motor variam entre software então por favor, consulte o fabricante ' instrução s antes da análise. Para obter a evidência histológica de axonal e mielina danos através de microscopia eletrônica, animal, os tecidos podem ser tomados na qualquer fase post função motora avaliação dependendo dos objectivos específicos de pesquisa ou imuno-histoquímica.

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Resultados

P0_180-199 peptídeo induzida EAN em pistas de camundongos C57BL/6 para uma doença monofásica com escore clínico início do post 6 dias primeira imunização (dpi) e a máxima pontuação severidade é observada de dpi 25 seguido por alguns clínicos placar melhoria de 40 dpi duração (Figura 1)^4,9. Em termos de função da marcha, os ratos começam a falhar logo em 6 dpi em uma simples ...

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Discussão

Este relatório descreve um método simples para induzir EAN usando o peptídeo de_180-199 P0 em camundongos C57BL/6, permitindo a quantificação dos principais défices neuropatológicas e funcionais em ratos induzidos com EAN. Distinto para o protocolo de indução de EAN descrito aqui é o uso de anestesia durante a realização das injecções de imunização. O uso de isoflurano anestesia realça extremamente a capacidade de assegurar que o volume total de inóculo é injetado por via subcutânea no local...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc