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Resumo

Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.

Resumo

Células do sistema imunológico são importantes componentes do microambiente do tumor e influenciam o crescimento do tumor e evolução em todas as fases da carcinogénese. Notavelmente, está agora bem estabelecido que o infiltrado imune em tumores humanos pode correlacionar com prognóstico e resposta à terapia. A análise do imune infiltrado no microambiente do tumor tornou-se um grande desafio para a classificação dos pacientes e a resposta ao tratamento.

A expressão co de receptores inibitórios como programa célula morte proteína 1 (PD1; também conhecido como CD279), citotóxica dos linfócitos T associado proteína 4 (CTLA-4), T-Cell imunoglobulina e mucina que contém proteína-3 (Tim-3, também conhecido como CD366) e linfócitos Gene de ativação 3 (GAL-3; também conhecido como CD223), é uma marca registrada da exaustão de célula T. Desenvolvemos uma imunofluorescência Multiparamétrico em situ coloração para identificar e quantificar a nível celular, a expressão co destes receptores inibitórios. Em uma série retrospectiva de tecido congelado de carcinomas de células renais (RCC), usar uma tecnologia de imagem multiespectral de fluorescência juntamente com um software de análise de imagem, verificou-se essa expressão co de PD-1 e Tim-3 tumor infiltrando CD8+ T células está correlacionado com um mau prognóstico na RCC. A nosso conhecimento, este representa o primeiro estudo demonstrando que este multiplex em situ tecnologia automatizada pode ter alguma relevância clínica.

Introdução

Nos últimos anos, a imunoterapia tem emergido como um tratamento muito promissor para muitos tipos de cânceres, incluindo o RCC. Particularmente, gosto de imunoterapia baseia a inibição dos postos de controlo inibitórios PD-1 e CTLA-4 foi relatado para ser clinicamente eficaz1,2,3,4,5, 6. anticorpos monoclonais contra CTLA-4, PD-1, ou programa morte ligante 1 (PD-L1) estão já aprovados em vários tipos de câncer e levar a longa duração respostas clínicas em mais de 20% dos pacientes7. No entanto, nem todos os pacientes são os respondentes, o custo do tratamento é alto, e estes tratamentos são tóxicos, levando a graves doença auto-imune, como efeitos colaterais. Portanto, o atual desafio é identificar marcadores preditivos para essas novas imunoterapias. A taxa de mutações no tumor, a expressão de PD-L1 ou os níveis de intratumoral CD8+ infiltração de células T têm sido relatados para correlacionar com a resposta clínica. No entanto, esta associação ainda é muito fraca para recomendar o uso desses biomarcadores clínicos na prática clínica, exceto para o teste de companheiro para PD-L1 antes da administração de Pembrolizumab em não-pequenas células lung cancer (NSCLC) pacientes8 ,9,1011,12. Foi demonstrado que a expressão co de muitos receptores inibitórios como PD-1, Tim-3, 3-Lag, e CTLA-4, induz um fenótipo de exaustão celular e resistência à terapia13,14,15. Desde que o sangue periférico não é representativo do microambiente do tumor, é de grande interesse para analisar as características fenotípicas das células em situ. PD-1 e Tim-3 co expressando as pilhas de T são conhecidas por serem células funcionalmente deficientes em vários contextos13,16,17. Neste estudo, o impacto prognóstico da expressão co dos dois receptores inibitórios PD-1 e Tim-3 em CD8+ T células foi avaliada.

Até agora, estudando a expressão co de vários marcadores tumor infiltrando linfócitos (TILs) tem sido realizado principalmente pela análise de citometria de fluxo, tornando-se necessário trabalhar em tumores frescos e, portanto, impedindo as análises retrospectivas. Com a coloração convencional em situ , manchando apenas um de cada vez pode ser executada, e a caracterização do tipo de célula que co expressa os marcadores não é possível. Por exemplo, PD-L1 é expressa por muitos tipos de células do microambiente tumoral, tornando-se difícil definir por análise imuno-histoquímica convencionais quais células expressando PD-L1 são os mais relevantes para estudos correlativos. Neste trabalho, desenvolvemos um método inovador em situ Multiparamétrico imunofluorescência com contagem de computador correlacionar a expressão co de PD-1 e Tim-3 pelo tumor infiltrando CD8 + T-células com desfechos clínicos na RCC. Esta técnica tem várias vantagens, incluindo a possibilidade de analisar em um nível de célula única e vários marcadores ao mesmo tempo usando uma câmera multiespectral que pode capturar intervalos restritos > 10 nm através de cristal líquido filtra18. Além disso, o procedimento é automático que permite que um operador inter reprodutibilidade e uma análise reduzida em comparação com técnicas manuais19. No campo do câncer, diversos estudos relataram convincente várias colorações de moléculas imunes como PD-1, PD-L1 e CD8 em células de Merkel carcinoma, câncer de pulmão e cabeça e pescoço câncer20,21,22, 23. a contagem automatizada de células é possível com treinamento pelo usuário (etapa de fenotipagem). A fluorescência é medida nos compartimentos diferentes células (núcleos, citoplasma e membrana).

Aqui, os diferentes subconjuntos de tumor infiltrando CD8+ T células expressando PD-1 e/ou Tim-3 em uma grande coorte de RCC foram contados e os resultados foram correlacionados com escores de gravidade clínica e parâmetros de sobrevivência. Também foi possível analisar a intensidade de fluorescência da membrana na resolução do celular com dados de intensidade de fluorescência dizer (IFM) como em citometria. Tanto quanto sabemos, isto representa os primeiro estudo relatórios prognóstico resultados usando esta técnica de contagem com base de imagens multiespectrais.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido em conformidade com a declaração de Helsínquia e foi aprovado pelo Comitê de ética local (CPP Ile de France nr. 2012-05-04). Consentimento informado foi obtido o participante incluído nas coortes.

1. tecido Material

  1. Colete amostras de tecido da RCC no dia da cirurgia. Lidar com o espécime cirúrgico à temperatura ambiente (departamento de patologia).
  2. Recolha uma amostra de tumor de aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho em um tubo seco. Snap freeze em nitrogênio líquido e armazenar a-80 ° C.
  3. Revesti as amostras na temperatura ideal de corte composta. Seção as amostras com um criostato a-20 ° C em 4-6 µm seções espessas. Deixe as amostras de ar seco em slides para 12h e diretamente, armazená-los a-80 ° C para evitar a dessecação.
  4. Verificar a qualidade da amostra exibindo uma hematoxilina e eosina manchado de seção.

2. in Situ mancha da imunofluorescência de TILs

  1. Orientações processuais
    1. Execute todas as etapas experimentais à temperatura ambiente.
    2. Para todas as etapas, execute as diluições com Tris Buffer Saline (TBS; ver Tabela de materiais).
    3. Realizar a lavagem em TBS para todas as etapas, exceto após a incubação do anticorpo primário. Para este último, use Tris Buffer Tween20 salina (TBST, consulte Tabela de materiais). Para a composição do tampão e reconstituição ver quadro suplementar 1.
    4. Use uma câmara de umidade para a incubação do anticorpo e um frasco de coloração para lavar.
    5. Não deixe que a seção secar durante o procedimento.
  2. Pré-tratamento
    1. Descongelar o slide que contém a amostra de tecido e seque cuidadosamente o deslizar a amostra com uma toalha de papel. Delimitar a área de reação contendo o tecido com uma caneta de barreira hidrofóbica (ver Tabela de materiais). Seco por 2 min.
    2. Corrigir as amostras em acetona 100% por 5 min, seco por 2 min e lavar com TBS por 10 min.
  3. Saturação e bloqueio
    1. Pré-tratamento dos slides por 10 min com 3 gotas de avidina 0,1%, torneira e/ou filme de slide para distribuir a avidina e remover bolhas de ar e em seguida tratar por 10 min com 3 gotas de biotina 0,01% (ver Tabela de materiais), toque, e/ou filme. Lavar com TBS.
    2. Realize um bloqueio de receptores de Fc. Aplicam-se 100 µ l de uma volumétrica 5% de soro normal diluído em TBS usar soro da mesma espécie hospedeiro como o anticorpo secundário ou terciário marcado (ver Tabela de materiais); aqui, utilizou-se soro de burro. Incube durante 30 min.
    3. Durante a incubação, rotação brevemente o anti-CD8, PD-1 e Tim-3 anticorpos (Tabela de materiais). Prepare a mistura de anticorpos primários na TBS, conforme descrito no quadro suplementar 2.
  4. Imuno-mancha para CD8, PD-1 e Tim-3
    1. Prepare a mistura de anticorpo primário. Consulte Tabela de materiais e suplementar tabela 2 para os anticorpos usados (anti-CD8, PD-1, Tim-3 e seus correspondentes anticorpos secundários) e as respectivas concentrações.
    2. Toque e/ou agite o soro restante de burro (adicionado na etapa 2.3.2). Incube as lâminas com 100 µ l da mistura os anticorpos primários não-rotulados por 1h em uma câmara umidificada.
    3. Durante a incubação, brevemente girar a cianina 5 anticoelho, AF488-anticabra e anticorpos de biotinilado antirato e preparar a mistura de anticorpos secundários, conforme descrito no quadro suplementar 2.
    4. Lave as lâminas em TBST 5 min. seco os slides.
    5. Incube as lâminas com 100 µ l dos anticorpos secundários por 30 min em uma câmara umidificada.
    6. Prepare a mistura de anticorpo terciário contendo Cy3-streptavidin conforme descrito no quadro suplementar 2.
    7. Lave as lâminas em TBS durante 10 min. seco os slides.
    8. Incube as lâminas com 100 µ l da mistura de anticorpo terciário por 30 min.
    9. Lave as lâminas em TBS durante 10 min. seco os slides.
  5. Célula de montagem
    1. Montar as lâminas em um 4' 6-Diamidino-2-Phenylindole, contendo dicloridrato DAPI médio (1,5 µ g/mL DAPI) com uma lamela compatível para microscopia de fluorescência de montagem (veja a Tabela de materiais).
      Nota: Como um controle negativo para cada experimento, utilizou-se um slide com anticorpos isotipo-combinados na mesma concentração como os anticorpos correspondentes. Para esta coloração, usamos rato IgG1, IgG de coelho e anticorpos de controlo negativo de IgG de cabra (veja a Tabela de materiais). Como um controle positivo, usamos tonsila hiperplásica humana que é sabida para ser positivo para os marcadores testados, para cada experimento. Uma coloração típica é descrita nos resultados (Figura 1). Mono-coloração de CD8, PD-1 e Tim-3 devem ser realizada individualmente (uma coloração por slide) com o mesmo tratamento prévio e sem DAPI. Também deve ser realizado um slide nas mesmas condições experimentais sem qualquer anticorpo e apenas meio de montagem de DAPI. Um slide deve ser fotografado usando idênticas condições experimentais sem qualquer anticorpo e sem DAPI.

3. análise fluorescência e automatizado de contagem de células

  1. Aquisição de imagens com o microscópio automatizado
    1. Crie um protocolo.
      1. Ative o software automatizado do microscópio e o iluminador de fluorescência.
      2. Na barra de menus, clique em "Arquivo", "criar o protocolo," selecione "DAPI," "FITC" e "TRITC."
      3. Clique em "Next", "Seção de tecido" e clique em "Next", "Nome do protocolo." Escolha um clique de nome, por exemplo, "CD8-PD-1-Tim-3,", "Next" e "salvar".
      4. Manualmente coloca um slide no palco.
      5. Na barra de menus, clique em "configurar", "configurações". Clique em "conjunto Z casa" na nova janela.
      6. Ajustar o tempo de exposição com um controlo positivo deslize, ou seja, um CD8, PD-1 e Tim-3 triplo-manchado com amostra DAPI.
      7. Na barra de controle clique em "definir a exposição."
      8. Ajuste o tempo de exposição para cada filtro até à obtenção de um sinal suficiente mas não saturante.
      9. Para imagens monocromáticas, execute o seguinte procedimento:
      10. Selecione a aquisição e em 'autofocus' escolha filtro DAPI.
      11. No "limite de área de verificação", mova o objetivo superior para o canto superior esquerdo do slide. Clique em "Marcar". Faça o mesmo para o canto inferior direito.
        Nota: Este passo delimita a área de baixa potência de imagem (imagem latente do LP) em 4x; esteja ciente de que colocar a marca tão bem quanto cercar todas as amostras da série.
      12. De alta potência (HP) de imagem, execute o seguinte procedimento:
      13. Em 'Autofocus', escolha "DAPI".
      14. Em banda 'Aquisição', escolha "DAPI", "FITC", "Cy3" e "Cy5". Clique em "Okey". Na barra de menus clique em "Arquivo", "salvar o protocolo".
    2. Digitalizar slides.
      1. Carrega o protocolo clicando em "Arquivo", "protocolo de carga" na barra de menus. Clique em "Iniciar".
      2. Digite 'Laboratório ID' (local da pasta para armazenamento de imagem). Digite o ID de Slide para identificar o slide. Clique em "Next".
      3. Clique em "Imagem monocromática" (para varrer o slide inteiro sob a luz brilhante do campo e adquirir imagens sequenciais usando um objectivo de 4x).
        Nota: Este produz uma visão geral de tons de cinza do slide.
      4. Clique em "Localizar espécime". Selecione a área de tecido a ser digitalizado em baixa resolução (4x): Mantenha a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou cancelar a seleção de campos (Figura 2A).
      5. Clique em "LP Imaging" (imagens de 4x) para aquisição de imagem vermelho azul verde fluorescente de cada campo.
      6. Para a seleção de campo HP, mantenha pressionada a tecla 'Ctrl' e clique em um campo usando o cursor para selecionar ou desmarcar os campos que correspondem à área de tecidos que serão digitalizados em alta resolução (x 20). Selecione 5 campos (Figura 2B).
      7. Clique em "HP Imaging" (20 x imagem) para a aquisição de imagens multiespectrais de cada campo (Figura 2).
      8. Clique em "Armazenamento de dados" para armazenar imagens na pasta que foi seleccionada no início em LabID.
        Nota: O processo é resumido e ilustrado na Figura 2. Para cada etapa (deteção de tecido, seleção de campo), um algoritmo pode ser incrementado e treinado pelo usuário para um processo de verificação automatizada de todo.
  2. Análise de imagens de fluorescência e célula automatizada contando com software de análise acopladas
    1. Construa a biblioteca espectral.
      1. Abra o software de análise de imagem.
      2. No painel da esquerda, abra "Construir bibliotecas". Em 'imagem de carga', clique em "Procurar" e selecione uma imagem manchada de mono (por exemplo, CD8/cianina 5).
      3. Selecione o fluoróforo, (por exemplo, cianina 5). Clique em "extrair". Clique em "Salvar" para armazenar na biblioteca. Clique em "Salvar".
      4. Repita o mesmo processo para PD-1, Tim-3 e slides de mono-manchado de DAPI para integrar o espectro de cada fluoróforo de interesse.
        Nota: A biblioteca espectral de construção integra o espectro para cada fluoróforo usado para o tecido específico (aqui, rim), mas "sintéticas" bibliotecas já existentes podem ser usadas. Como o espectro de autofluorescência é estritamente em relação ao tecido, é importante realizar uma autofluorescência e biblioteca espectral por projeto.
    2. Crie um novo projeto.
      1. Na barra de menus, clique em "Arquivo", "New Project". Na guia 'Recurso Find', selecione "segmentação de célula". Na guia 'Fenotipagem', selecione "fenotipagem". Clique em "Criar".
      2. Integre as imagens representativas do projeto.
        1. Na guia 'Arquivo', clique em "abrir imagem". Escolha de 10 a 30 imagens representativas de toda a série. Adicione o slide não manchadas para remover autofluorescência. No painel direito: fonte selecione biblioteca. Selecione o fluoróforo e escolher os correspondentes à biblioteca espectral anteriormente construída.
      3. Para remover o tecido autofluorescência, clique no botão"AF" e em seguida, selecione a área de autofluorescência no slide em branco.
      4. Tratamento de imagem e geração de imagem composta.
        1. Clique em "Preparar tudo" para integrar a biblioteca de fluorescência e os espectros de autofluorescência para gerar a imagem composta (Figura 3). Clique no ícone 'olho' para abrir o painel 'editor de exibição' e selecione os dados exibidos: selecione os marcadores CD8, PD-1, 3-Tim e DAPI. Remova a autofluorescência. Siga os passos apresentados pelo software.
      5. Segmente as células.
        1. Para segmentar as células, em 'Compartimento', seleccione "Núcleos" e "Membrana". Na guia "Núcleos", defina DAPI como o corante de contraste nuclear.
        2. Na aba 'Máximo e mínimo tamanho (px)' digite "40" e "176" como os tamanhos mínimos e máximos, respectivamente. Para o sinal de 'Mínimo', defina "0,13". Na guia "Split", defina "2,60". Na guia "Núcleos", defina "0.81". Selecione "usar o sinal de membrana para auxiliar a segmentação".
        3. Clique em "Células do segmento" na parte inferior da tela. Verifique a segmentação dos núcleos e das membranas das células e novamente com parâmetros diferentes, se não coincide com a fluorescência DAPI e membrana das células.
          Nota: O software reconhece as células com o DAPI nuclear manchando e baseado no tamanho da célula. Ajuste os parâmetros de célula (tamanho, separação, pixels) de acordo com o projeto.
      6. Fenótipo das células.
        1. Na guia 'Fenótipo', clique em "Adicionar". Criar células fenótipo categorias: CD8 (ponto azul) / CD8-PD-1 (ponto vermelho) / CD8-PD-1-Tim-3 (ponto verde) / outro (ponto preto) (Figura 4).
        2. Selecione mais de 5 exemplos de células de cada categoria. Clique em "Classificador de trem".
          Nota: Isto gera um algoritmo de classificação estatística pelo software.
        3. Clique em "Fenótipo todas" para obter o fenótipo de cada célula.
          Nota: O software dá o fenótipo de uma célula com um intervalo de confiança (IC) de precisão.
        4. Melhorar o algoritmo, o software de treinamento até que a diferença entre o olho e contagem automatizada é concordante (< 5% de erro). Escolha um CI que é aceitável para as células de interesse.
          Nota: Nós escolhemos fazer a formação com base em 55% CI como aceitável.
      7. Salve o projeto e o algoritmo.
      8. Em 'Arquivo' selecione "project". O nome e clique em "Salvar".
    3. Realizar análise de lote da série.
      1. Selecione "Análise de lote". Selecione o projeto. Adicione as imagens para analisar. Selecione uma pasta de armazenamento para os dados. Clique em "Executar". Verifica a qualidade da imagem composta. Verifique se a fenotipagem para todas as imagens da série.
        Nota: O software de análise de imagem acoplado integra todos os sinais de compartimentos (núcleos/membrana/citoplasma) da célula. A etapa de fenotipagem é crucial, embora a formação do algoritmo pode ser uma etapa demorada. Todos os dados de cada imagem estão em um arquivo. txt. Todos os dados de uma célula (particularmente seu fenótipo dado com sua CI) estão em uma linha. Para cada slide, a aquisição de imagens e contagens subsequentes foram realizadas em 5 campos.
  3. Integração dos dados brutos e geração da contagem automatizada de células
    1. Calcule os dados com um programa de estatístico.
      1. Calcule todos os dados a partir das 5 imagens correspondentes aos 5 campos analisados para 1 paciente. Usar uma plataforma estatística e tem um estatístico experiente, Gerenciador de dados ou cientista de dados realizar a análise. Crie um script que conta automaticamente as células dependendo de seu fenótipo, selecionando o CI > 55%.
      2. Coloque todos os arquivos. txt da série na mesma pasta.
    2. Extrair os dados.
      1. Colocar todos os arquivos. txt em uma pasta. Execute o script automático construído na etapa 3.3.1. Abra o arquivo de saída CSV gerado pelo script R. Salve como formato de .xl. A saída reúne o número de células para cada fenótipo (ou seja, sozinho, CD8 CD8-PD-1, CD8-PD-1-Tim-3) para cada paciente.
      2. Calcular o número médio de células para cada paciente por campo: dividir o número de células pelo número de campos (ou seja, 5) para normalizar o número de células para cada paciente por campo.
      3. Calcular a percentagem de células PD-1+ entre CD8 total+ T células e PD-1+ + Tim 3 células entre CD8 total+ T células. Consulte a Figura 5 Resumo desta etapa.
        Nota: A linguagem R (ou outro software de programação de escolha) é necessário para criar e executar os comandos corretamente, e então um usuário experiente ou cientista estatístico/dados é essencial. O programa R pode calcular os dados do mesmo paciente, mas o nome dos 5 arquivos. txt de um paciente deve ter um início idêntico, correspondente a um identificador exclusivo do paciente.
  4. Análise estatística
    1. Use o software estatístico para a análise estatística dos resultados.
    2. Realize análises estatísticas adequadas, com a ajuda de um estatístico.
      1. Uso da não-paramétricos Wilcoxon assinou classificação testes para comparação de PD-1 IFM entre dois fenótipos de célula (Figura 6). Correlacione as características histológicas e covariável com teste Chi-quadrado de Pearson, um.
      2. Use um método de Kaplan-Meier para estimar a sobrevivência livre de progressão e modelos de regressão de Cox para estimar os efeitos covariável no tempo-para-evento resultados, como a sobrevivência global e sobrevivência livre de doença.
      3. Considere p-valores inferiores a 0,05 como significativos.

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Resultados

Usando o protocolo geral descrito acima, tivemos como objetivo quantificar intratumoral CD8+ T células co expressando os receptores inibitórios PD-1 e Tim-3 em tecidos congelados de pacientes com RCC e correlacionar os resultados com os resultados clínicos25.

Otimização de manchar o CD8/PD-1/Tim-3:

Espécies dife...

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Discussão

Modificações e solução de problemas:

A qualidade do tecido é um parâmetro importante; Isso pode ser facilmente verificado pela coloração de hematoxilina e eosina.

Uma vantagem da técnica é a possibilidade de colorações multiplexadas, mas para evitar repercussões fluoróforo, recomendado para escolher com delta de no mínimo 10 nm, comprimentos de onda de emissão. Aqui, porque nós tivemos 4 colorações incluindo DAPI, escolhemos a esp...

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Divulgações

Todos os autores não têm nenhum conflito de interesses para declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por concessões do Institut National du Cancer (INCA) (ET), Ligue contre le Cancer (ET), Université Sorbonne Paris Cité (ET), ANR (Selectimmunco) (ET), Labex imuno-Oncologia (ET), CARPEM SIRIC (CG, ET). EdG foi financiado por uma bolsa da Fundação arco. EV e CD foram financiados por uma irmandade do PHP (bourse année recherche). ChB é financiado por uma bolsa da Université Sorbonne Paris Cité (contrat doutorado). Os autores graças a Bristol Myers Squibb para seu financiamento neste projeto. Os autores agradecer ao departamento de patologia do Hopital Européen Georges Pompidou e Necker (Laurianne Chambolle, Elodie Michel e Gisèle Legall). Os autores graças a plataforma de histologia de PARCC, Hopital Européen Georges Pompidou (Corinne Lesaffre).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Vectra 3 Automated Quantitative Pathology Imaging Perkin ElmerCLS142338
inForm cell analysis 2.1.Perkin ElmerCLS135781
R softwarehttps://www.r-project.org
Dakopen delimiting penDakoS2002
Tris Buffer Salin TBS TabletsTakara, Bio Inc.TAKT9141ZpH7.6 100 tablet
Tris Buffer Salin Tween 20 TBS(+Tween20)Takara, Bio Inc.TAKT9142ZpH 7.6 100 tablets
Biotin blocking systemDakoX0590Avidin 0.1% and Biotin 0.01%
normal donkey serumJackson Immunoresearch017-000-0015% vol./vol. concentration
Fluoroshield with DAPISigma-aldrichF60571.5 µg/mL concentration
Knittel glass coverslipKnittel Gläser,10003924x60 mm 100 cover slips
Rabbit anti-CD8 Clone P17-VnovusNBP1-79055use at 4µg/mL
Mouse anti-PD-1 Clone NATabcamab52587use at 2 µg/mL
Goat anti-Tim-3R&DAF2365use at 3 µg/mL
Rabbit anti-PD-L1 Clone SP142Roche7309457001use at 1 µg/mL
Mouse AF647 labeled pan- Keratin Clone C11Cell Signalling4528use at 0.5 µg/mL
Goat anti-human gal9R&DAF2045use at 0.3 µg/mL
Cyan 5 conjugated donkey anti-rabbitJackson Immunoresearch711-175-152use at 5 µg/mL
Biotinylated F(ab’2) donkey anti-mouse IgGJackson Immunoresearch715-066-150use at 3 µg/mL
Alexa Fluor488 conjugated donkey anti-goat IgGabcamab150133use at 5 µg/mL
Cy3 labeled streptavidinAmershamPA43001use at 3 µg/mL
negative control mouse IgG1DakoX0931use at 2 µg/mL
IgG from goat serumSigma-aldrichI5256use at 3 µg/mL
IgG from rabbit serumSigma-aldrichI5006use at 4µg/mL

Referências

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  2. Granier, C., et al. Cancer immunotherapy: Rational and recent breakthroughs. Rev Med Interne. 37 (10), 694-700 (2016).
  3. Motzer, R. J., et al. Nivolumab for Metastatic Renal Cell Carcinoma: Results of a Randomized Phase II Trial. J Clin Oncol. 33 (13), 1430-1437 (2015).
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  5. Robert, C., et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 364 (26), 2517-2526 (2011).
  6. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
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