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Resumo

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Resumo

Modelos de pesquisa de câncer de fígado, regeneração, inflamação e fibrose, sistemas flexíveis para a expressão do gene na vivo e silenciamento são altamente úteis. Injeção de veia cauda hidrodinâmica de construções baseadas em transposon é um método eficiente para manipulação genética dos hepatócitos em ratos adultos. Além de expressão constitutiva do transgene, este sistema pode ser usado para aplicações mais avançadas, tais como implicação de knock-down, mediada por shRNA gene do sistema CRISPR/Cas9 para induzir mutações genéticas, ou sistemas inducible. Aqui, a combinação de expressão constitutiva de CreER juntamente com expressão inducible de um transgene ou miR-shRNA de escolha é apresentado como um exemplo dessa técnica. Cobrimos o processo de várias etapa, a partir da preparação da bela adormecida-transposon constrói, a injeção e o tratamento de ratos e a preparação do tecido do fígado para análise por imunocoloração. O sistema apresentado é uma abordagem eficiente e confiável para realizar manipulações genéticas complexas nos hepatócitos. É especialmente útil em combinação com cepas de rato Cre/loxP-baseado e pode ser aplicado a uma variedade de modelos na pesquisa de doença hepática.

Introdução

Doença hepática crônica apresenta um fardo de saúde em todo o mundo1. Modelos de pesquisas com animais são ferramentas essenciais no estudo da doença hepática e ajudaram a responder questões complexas na regeneração hepática, inflamação hepática, esteatose hepática e câncer de fígado2. Um número substancial desses modelos animais depende da modificação genética das células do fígado. Portanto, ferramentas eficientes para manipular a expressão gênica em hepatócitos são úteis3. Estabelecidos métodos tais como a reprodução de linhagens geneticamente modificados do mouse ou a geração de vetores virais para a infecção do hepatócito são ou demorado, Porto preocupações de segurança, ou produzem expressão do transgene pobre em hepatócitos na vivo 4 , 5. injeção de veia de cauda hidrodinâmica (HTVI) é um método alternativo para transfeccao na vivo dos hepatócitos, permitindo a fácil, rápido e eficiente de interrogatório da função do gene no fígado. Para HTVI, um vetor carregando a sequência de DNA desejada é dissolvido em um volume de solução salina, correspondente a 10% do peso corporal do animal injetado. A solução então é injetada na veia da cauda dentro de 5-10 s6. Excedendo o débito cardíaco, o soro flui da veia cava inferior nas veias hepáticas, levando a expansão do fígado e transfection hidrodinâmico de hepatócitos7. Para conseguir a integração estável de genômica, o método foi combinado com transposon-com base em vetores, como o sistema de transposon dormir beleza. Este sistemas Medeia a recombinação de vetores de alvo com sites de recombinação genômica catalisadas por uma de8,de transposase dormir beleza -9. Para modelos de fibrose hepática ou carcinogênese, muitas vezes é desejável para genes overexpress ou silêncio em determinados pontos do tempo do modelo de doença. Para esta finalidade, ferramentas para expressão de gene inducible, tais como o sistema Cre/LoxP ou o sistema de expressão de gene tetraciclina-inducible (Tet-On) pode ser usado10.

Aqui, descrevemos um protocolo para transfeccao na vivo de hepatócitos murino usando HTVI de um sistema baseado em transposon bela adormecida . Além de um protocolo para a expressão estável, constitutiva de um transgene sob o controle de um promotor específico fígado, descrevemos um sistema mais avançado de vetor que combina expressão constitutiva da recombinase (CreER) do Cre tamoxifeno-dependente com o expressão inducible de um transgene ou microRNA-adaptado de shRNA (miR-shRNA), chamado o pTC TET-sistema11. Neste sistema de vetor, inducible transgenes ou miR-shRNAs para expressão dependente de tetraciclina são clonados no vetor coluna vertebral com um sistema de clonagem recombinational, permitindo a geração de novos vetores12rápida e fácil. Este guia em vídeo abrange a preparação de vetores apropriados, injeção e tratamento de ratos para alcançar expressão inducible do transgene/miR-shRNA e, finalmente, a preparação do tecido do fígado para análise. O método descrito neste protocolo foi projetado para permitir a combinação de qualquer sistema de rato Cre/loxP mediada com a expressão ou batida para baixo de qualquer gene de escolha, tornando-se um sistema amplamente aplicável na investigação de doença hepática.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório e foram aprovadas pelas autoridades responsáveis (Regierung von Oberbayern, Munique, Alemanha e Stanford cuidados institucionais do Animal e usar Comité, Stanford, CA, EUA). Uma lista de todos os plasmídeos de clonagem (passo 1 a 4) é fornecida na tabela complementar S1.

1. a clonagem de um Transgene para expressão gênica constitutiva

  1. Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.
  2. Adicione restrição sites para PacI (TTAATTAA) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para AscI (GGCGCGCC) ou FseI (GGCCGGCC) à extremidade 5' do primer reverso.
  3. Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica usando um kit de purificação de DNA disponível comercialmente.
    Nota: Tempo de recozimento depende os primers desenhados na etapa 1.1., tempo de alongamento depende do comprimento da construção. Por exemplo, para uma construção de 1.000 bp comprimento uso 60 s de tempo de alongamento.
  4. Digerir o transgene e vector de expressão de gene constitutivo15 com nucleases de restrição respectiva (consulte a etapa 1.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite. Por exemplo, digerir construção com 5 unidades PacI e 5 unidades FseI se apropriado (consulte a etapa 1.2).
  5. Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Execute uma ligadura padrão de 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
  6. Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
  7. Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.
  8. Escolha única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit miniprep comercial de acordo com as instruções do fabricante e verificar a sequência de sequenciamento Sanger17 (cartilha de sequenciamento: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').
  9. Use positivo colônias para maxi escala de amplificação do ADN do plasmídeo e purificam usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Construção está pronta para a injeção, assim, continue com o passo 5.

2. clonagem de um Transgene para expressão gênica Inducible

  1. Desenho de primers para amplificação de transgene13,14.
  2. Adicione sites de restrição para SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) ou KpnI (GGTACC) à extremidade 5' do primer para a frente. Adicione sites de restrição para NotI (GCGGCCGC) ou XhoI (CTCGAG) à extremidade 5' do primer reverso.
  3. Amplifica o transgene por PCR usando condições otimizadas para o transgene desejado14. Purifica a utilização de um kit de purificação de DNA comercial.
  4. Digerir o transgene purificado e 4 µ g do vetor de entrada (pEN_TTmcs-vetor, consulte Tabela de materiais)19 separadamente com nucleases de restrição apropriada (consulte a etapa 2.2) e buffer em um volume total de 50 µ l a 37 ° C durante a noite.
  5. Gel de purificar vetor digerido e insert usando um kit de extração do gel de comerciais de acordo com as instruções do fabricante. Realize a Ligadura padrão com 100 ng do vetor e 100 – 1.000 ng de insert usando 400 U T4 ligase a 14 ° C, durante 16 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
  6. Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
  7. Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.
  8. Escolha única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por sequenciamento17 usando o primer frente pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'.
    Nota: PCR em colônias simples pode ser realizada sem prévia purificação com pCEP primers para a frente e pCEP reversa (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Esta etapa pode útil para pré-selecção das colônias positivas.
  9. Prossiga para a etapa 4.

3. clonagem de um miR-shRNA para Inducible Gene Knock-down

  1. Projeto miR-shRNA oligonucleotides de acordo com o pSLIK protocolo19de clonagem. Recoze e purificar oligonucleotides e diluir 01:20 em ddH2O.
  2. Digest 3 µ g do vetor de entrada com 5 U BfuAI, a 50 ° C por 3 h, então inativar a reação a 65 ° C por 20 min.
    Nota: Se for desejado co expressão da proteína verde fluorescente (GFP), uso pEN_TTGmiRc19 como um vetor de entrada, caso contrário use pEN_TTmiRc219.
  3. Gel de purificar vetor digerido como na etapa 2.5. Realizar a Ligadura padrão de 100 ng do vetor e 1 µ l de purificado e diluído oligonucleotides shRNA (passo 3.1) usando 400 U T4 ligase em temperatura ambiente por 1 h. calor inativar a 65 ° C por 10 min.
  4. Transforme bactérias competentes, usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
  5. Placa de ágar placas contendo gentamicina 15 µ g/mL. Incube a 37 ° C, durante 16 h.
  6. Escolher o única colônias, purificar o Plasmídeo e verificar inserir por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').
  7. Prossiga para a etapa 4.

4. recombinational clonagem para gerar Clones pronto-para-injeção

  1. Mix 150 ng do vetor de entrada (da etapa 2 ou etapa 3) e 150 ng do pTC TET-vetor20.
  2. Adicionar um volume total de 8 µ l tampão TE (pH = 8).
  3. Transfira a mistura de enzima LR-clonase II (ver Tabela de materiais) para gelo, incubar por 2 min. Vortex duas vezes.
  4. Adicionar 2 µ l do mix de enzima LR-clonase II para a reação e incubar a 25 ° C, durante 1 h.
  5. Pare a reação adicionando 1 µ l de Proteinase K-solução. Incube a 37 ° C por 10 min.
  6. Transforme Stbl3 bactérias competentes com 2 µ l de clonagem recombinational misturam usando um padrão de calor-choque-protocolo16.
  7. Placa de ágar placas contendo ampicilina de 100 µ g/mL. Incube a 30 ° C por 24 h.
  8. Escolher o única colônias, purificar DNA do plasmídeo usando um kit preparação livre de endotoxinas plasmídeo18 de acordo com as instruções do fabricante e confirmar a integridade do vetor por Sanger sequenciamento17 (cartilha de sequenciamento 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3').
  9. Construção está pronta para a injeção, continue com o passo 5.

5. preparar solução injectável de veia de cauda hidrodinâmica

Nota: Preparação das construções para a expressão do gene constitutivo e inducible são descritas na etapa 1, 2, 3 e 4.

  1. Preparar a solução salina 0,9% estéril para injeção (que não uso PBS). Use o volume correspondente a cerca de 10% do peso do corpo do mouse. Exemplo: para um mouse com 20 g, prepare-se 2 mL de solução.
  2. Prepare os vetores de injeção que foram purificados usando um plasmídeo livre de endotoxinas purificação kit18 (ver passo 1.8 ou 4.8, respectivamente).
  3. Adicionar 10 µ g ou 15 µ g de construção de vetor livre de endotoxinas a bela adormecida (do passo 1 uso 10 µ g, da etapa 4 µ 15 g uso, respectivamente) e 1 µ g de endotoxinas-free pc-HSB521 / mL de solução salina estéril.
  4. Solução de armazenamento para até 4 h a 4 ° C. Não congele.

6. realizar a injeção de veia de cauda hidrodinâmica

  1. Use uma retenção para injeção de veia de cauda (comercial ou preparada de um tubo cónico de 50 mL com furos para respirar e para a cauda). Preencha o fundo do tubo com papel absorvente.
  2. Para a injeção, use ratos de cerca de 8-10 semanas de idade com pesos de 20 – 25 g.
  3. Pesar os ratos antes da injeção e prepare-se volume de injeção de acordo com o peso corporal (correspondentes a 10% do peso corporal, consulte a etapa 5.1). Prepare um estéril 3 mL-seringa com uma agulha G 27 para injeção e encha-a com o volume necessário.
  4. Coloque o mouse a retenção. Ajustar a quantidade de papel tissue (consulte a etapa 6.1) para deixar um espaço mínimo para o movimento mas espaço suficiente para respirar.
  5. Certifique-se de que o rato está respirando regularmente.
  6. Quente a cauda usando uma lâmpada infravermelha para 30-60 s. cuidadosamente atenção aos sinais de superaquecimento.
  7. Limpe o rabo com um algodão embebido em álcool.
  8. Inserir a agulha quase horizontalmente em qualquer um das duas veias laterais da cauda perto da base da cauda.
    Nota: Se for colocado com êxito, uma pequena quantidade de sangue pode fluir de volta ao cone da agulha. Não é recomendável para aspirar ativamente como qualquer movimento adicional da agulha pode resultar em seu deslocamento e/ou lesão da veia.
  9. Injete o volume total da veia da cauda dentro de 8-10 s.
  10. Imediatamente, remova o mouse a retenção. Comprimir a injeção ferida pelo menos 30 s ou até algum sangramento diminui.
  11. Coloque o mouse em uma gaiola separada. Uma vez que o mouse se recuperou do procedimento (cerca de 30 a 60 min), transferi o mouse volta para sua gaiola original. Checar o mouse regularmente para as próximas 24 horas.
    Nota: A sedação leve do mouse é observada rotineiramente para até 2 h após a injeção.
  12. Antes de prosseguir com mais experiências (ou seja, passo 7), espere 10 a 15 dias para habilitação de vetores não-integrados.

7. indução de CreER Transfectada com tamoxifeno

Atenção: O tamoxifeno é prejudicial, pode ser canceroso ou danificar a fertilidade. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.

  1. Plano de injeções intraperitoneal tamoxifeno em três dias consecutivos.
  2. No dia 1, dissolvem-se 10 mg de tamoxifeno em etanol a 40 µ l. Incube a 55 ° C durante 10 min. Vortex várias vezes até que se dissolva o tamoxifeno.
  3. Adicione o óleo de milho 960 µ l. Incubar durante 5 min. a 55 ° C. Vórtice várias vezes para obter uma solução límpida.
  4. Prepare a solução em uma seringa de insulina 1 mL com agulha 27G.
  5. Nuca o mouse, agarrando o pescoço do mouse cuidadosamente com o polegar e o segundo dedo, fixação da cauda entre a base da mão e o quarto e o quinto dedo.
  6. Injete 0,1 mL (= 1 mg de tamoxifeno) da solução intraperitonealmente no quadrante inferior esquerdo do abdômen.
  7. Repeti as injeções nos dias 2 e 3.

8. indução do Gene de tetraciclina dependente ou expressão de shRNA

Cuidado: A doxiciclina pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.

Nota: Dependendo do tipo e duração do experimento, a doxiciclina pode ser fornecida em água potável (passo 8.1) ou chow (passo 8.2)

  1. Para experiências de curto prazo (< 10 dias) administrar doxiciclina através da água potável, utilizando o seguinte protocolo.
    1. Dissolva sacarose 5 g em 100 mL de água da torneira. Autoclave.
    2. Dissolva 100 mg de doxiciclina-hyclate em 5 mL de solução de sacarose (etapa 8.1.1) em um tubo cônico de 15 mL.
    3. Utilizando uma seringa de 10 mL, estéril filtrar a solução através de um filtro de 0,2 µm. Adicione a solução de sacarose, preparada na etapa 8.1.1.
    4. Fornecer a solução de sacarose-doxiciclina como água potável para o mouse. Verifique diariamente e substituir quando a solução torna-se turva, indicando o overgrowth bacteriano (substituir a solução clara depois de três dias no máximo).
  2. Para experimentos de longo prazo (> 10 dias) ou experimentos sensíveis a mudanças metabólicas, usar doxiciclina-chow comercial (por exemplo, Doxycycline Hyclate Chow 0,625 g/kg) para evitar a desidratação e/ou alterações induzidas pelo sacarose em fígados de animais tratados.

9. preparação do fígado de rato para análise por imunocoloração

Cuidado: Paraformaldehyde pode ser prejudicial. Por favor, consulte a ficha de dados de segurança.

Nota: O commit quando ratos serão analisados varia de acordo com o experimento. Recomenda-se analisar o tecido hepático após não menos de três dias de tratamento doxiciclina para garantir suficiente da indução da expressão do transgene ou shRNA.

  1. Prepare uma seringa de 1 mL com agulha 27G com 1 mL de solução de paraformaldeído 4% (PFA).
  2. Eutanásia o mouse por um método adequado de acordo com um protocolo aprovado do animal.
    Nota: Diretrizes para métodos adequados de eutanásia podem variar dependendo da instituição.
  3. Usando dissecação tesoura e pinça anatômica, abra cuidadosamente a cavidade abdominal com uma laparotomia mediana para expor o fígado. Mova o intestino delgado para o direito de expor a veia porta e a veia cava inferior (VCI).
  4. Insira a agulha da seringa preparada (ver passo 9.1) na veia cava inferior e corte a veia porta. 1 mL de PFA lentamente injete a veia cava inferior para perfundir o tecido do fígado e remover autofluorescente células vermelhas do sangue (desejáveis se coloração imunofluorescente será executada).
  5. Remova o fígado. Enxaguar em água e transferir para 5 a 10 mL de solução PFA 4%.
  6. Para cortes de parafina, tecido de correção para 36-48 h tecido está pronto para desidratação e incorporação de parafina.
  7. Para seções congeladas, fixe o tecido em 4% PFA por 1h.
    1. Por cryoprotection, transferência para a solução de sacarose a 10%. Incube 60 min.
    2. Transferir a solução de sacarose 20%. Incube 60 min.
    3. Transferir a solução de sacarose de 30%. Incubar 12 – 16 h. Embed em incorporação composto por seções congeladas e congelar a-20 ° C.

Resultados

Eficácia transfection por injeção de veia de cauda hidrodinâmica: A porcentagem de hepatócitos murino que são transfectadas direccionado por uma única injeção é variável e depende de vários parâmetros tais como o volume de injeção, tempo de injeção, quantidade de DNA injetado e tamanho da construção injetado6, 22,23. Além disso, a eficiência de transfeccao ?...

Discussão

Transfecção de hepatócitos com injeção de veia de cauda hidrodinâmica tornou-se um método estabelecido desde a sua introdução há mais de 15 anos6. O volume injetado excede o débito cardíaco e flui da veia cava inferior para os sinusoides do fígado7, levando a transfeccao de cerca de 10-20%, em alguns casos até 40% dos hepatócitos25,26. Preditores de um bem sucedida do transfection são o volume injeta...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Krebshilfe, Alemanha (número de concessão 111289 a UE), a Lucile Packard Foundation para a saúde das crianças (Ernest e Amelia Gallo dotado Postdoctoral Fellowship - número de concessão CTSA UL1 RR025744 a UE). Agradecemos o Dr Mark A. Kay para construções de vetor e suporte experimental conselhos e Dr Julien Sage para ratos e experimental.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA LadderThermo Fisher#SM1331DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T.Sakura4583embedding of cryo-sections
Biozym LE AgaroseBiozym840004
Ethidium bromideSigma-AldrichE7637-1G
D(+)-SaccharoseCarl Roth4621.1For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium SaltAppliChemA0839,0010For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller)Carl RothX969.1
LB Broth (Luria/Miller)Carl RothX968.1
S.O.C. MediumThermo Fischer15544034
Gentamicin sulfateAppliChemA1492,0001For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 %Fa. RothP087.6para-formaldehyde solution
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mixinvitrogen/ThermoFisher11791-020contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent CellsThermo Fisher11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo FisherC737303
NameCompanyCatalog NumberComments
Restriction Enzymes
PacINew England BioLabsR0547S
AscINew England BioLabsR0558S
FseINew England BioLabsR0588S
SacINew England BioLabsR0156S
SpeINew England BioLabsR0133S
KpnINew England BioLabsR0142S
NotINew England BioLabsR0189S
XhoINew England BioLabsR0146S
BfuAINew England BioLabsR0701S
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean UpMacherey & Nagel740609.10
NucleoBond PC20Macherey & Nagel740571Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500Macherey & Nagel740574Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseThermo FisherF530S
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 mlBraun9166017VFor intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 mlBraun4616025VFor intravenous injection
Sterican Cannula 24GBraun4657675
Sterican Cannula 27GBraun4657705
TamoxifenSigma-AldrichT5648-1GFor CreER activation
Corn oilSigma-AldrichC8267-500MLCarrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclateAppliChemA2951,0025Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml SyringeBraun4606108V
Filtropur S 0.2Sarstedt831,826,001For filtration of doxycycline
NaCl 0,9%Braun3200905Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50mlCorning Life Science352095
Infrared LampN/AN/AFor warming of mouse tail
IVISPerkin Elmer124262In vivo imaging system
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTCn/aVector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcsAddgene #25755Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2Addgene #25753Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2Addgene #25752Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-TetAddgene #85578Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-TetAddgene #85577Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11

Referências

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