Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 para analisar a formação e reparação do DNA Double-strand Breaks

Resumo

Este manuscrito fornece um protocolo de análise de quebras de DNA dobro-costa pela microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Resumo

Quebras de DNA dobro-Costa (DSB) são graves lesões do ADN. Análise da formação e reparação do DSB é relevante em um amplo espectro de domínios de investigação, incluindo a integridade do genoma, genotoxicidade, biologia da radiação, envelhecimento, câncer e desenvolvimento de drogas. Em resposta ao ORL, o histona H2AX é fosforilado em serina 139 em uma região de vários pares de megabase formando discretos focos nucleares detectáveis pela microscopia de imunofluorescência. Além disso, 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra importante proteína DSB-responsivo promover a reparação de DSB, juntando-se não-homólogos final-evitando a recombinação homóloga. De acordo com as funções específicas de γH2AX e 53BP1, a análise combinada de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser uma abordagem razoável para uma análise detalhada de ORL. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo, complementado com notas metódicas para executar a técnica. Especificamente, a influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX é demonstrada em fibroblastos normais da linha celular NHDF. Além disso, o valor dos focos de γH2AX como um biomarcador é retratado em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável. Finalmente, a instabilidade genética é investigada em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda por microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1.

Introdução

O DNA é danificado continuamente por endógenos (por exemplo, estresse de replicação, espécies reativas de oxigênio, instabilidade intrínseca do DNA) e exógenos (por exemplo, os radicais químicos, irradiação) fontes (Figura 1)^{1,2 ,3,4}. Entre os danos do DNA, DNA dupla quebras (DSB) são particularmente graves lesões e podem induzir a morte celular ou carcinogênese. Cerca de 50 DSB pode surgir por célula e ciclo celular⁵. Em células de mamíferos, recombinação homóloga (HR) e não-homólogos final-adesão (NHEJ) desenvolveram-se como principais vias para a reparação de ORL (Figura 2). RH ocorre no final da fase S/G2 e usa uma irmã intacta cromátides irmãs como um modelo para reparação potencialmente livre de erros. Em comparação, NHEJ é ativo ao longo do ciclo celular e potencialmente mutagénicas como pares de base pode ser adicionados ou ressecados antes da ligadura das extremidades quebradas. Além disso, final alternativo-adesão pode ser contratado como um mecanismo lento mutagénicas backup reparação em caso de deficiência NHEJ^6,7.

DSB induzir a fosforilação da histona H2AX em serina 139 em uma região de vários pares de megabase ao redor de cada DSB. Os focos de formação nucleares são denominados focos de γH2AX e são detectáveis por microscopia de imunofluorescência⁸. ΓH2AX promove o recrutamento de mais proteínas DSB-responsiva e está envolvido na cromatina remodelação, reparação de DNA e de transdução de sinal⁹. Como cada foco de γH2AX é considerado para representar um único DSB, a quantificação do DSB por microscopia de imunofluorescência é possível, que tem sido demonstrada em linhas de células de câncer e espécimes paciente^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (p53 binding protein 1) é outra proteína-chave na mediação reparação de ORL. Está envolvido no recrutamento de DSB-responsivo proteínas, sinalização de ponto de verificação e a sinapse de ORL termina¹⁵. Além disso, 53BP1 desempenha um papel crítico na escolha de caminho de reparação de ORL. Ele aciona a reparação de ORL para NHEJ enquanto HR é impedido de¹⁶. Considerando as funções genuínas de γH2AX e 53BP1 no reparo DSB, a análise simultânea de γH2AX e 53BP1 por microscopia de imunofluorescência pode ser um método útil para a análise precisa da formação e reparação de ORL.

Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células. Especificamente, a técnica é aplicada em fibroblastos normais da linha celular NHDF, em linfócitos de raio-x irradiado de um indivíduo saudável e em células CD34 + de um paciente com leucemia mieloide aguda. Os detalhes do método são apontados no contexto dos resultados apresentados.

Protocolo

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê ética II de a Mannheim faculdade médica da Universidade de Heidelberg. Escrito foi obtido o consentimento de todos os indivíduos.

1. preparação de materiais

1. solução anticoagulante: preparar uma solução anticoagulante de 200 heparina UI / mL de cloreto de sódio 0,9%. Encha cada um dos tubos de coleta (desenhar volume 9 mL) com 2 mL da solução anticoagulante antes da retirada das amostras de sangue ou de medula óssea.
2. Solução de lise de eritrócitos: preparar a 10 x solução de lise de eritrócitos com 82,91 g de cloreto de amônio, bicarbonato de amónio 7,91 g e 2 mL de solução de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M para um pH 8.0, dissolvendo os agentes em água bidestilada, para um volume total de 1 L.
3. Solução de fixação: adicionar 8,3 µ l de uma solução de hidróxido de potássio 1m de paraformaldeído 360 mg (PFA) em um tubo de microtitulação. Encha o tubo com solução salina tamponada fosfato (PBS) até a marca de 1 mL do tubo e calor do tubo em um bloco de aquecimento a 95 ° C para 1 mL de uma solução PFA de 36%. Transferi a solução PFA 36% 1 mL para um tubo com uma capacidade de 15 mL. Adicione 8 mL de PBS para a solução PFA de 36% de 1 mL, para obter 9 mL de uma solução stock de PFA 4%. Alíquota da solução estoque de PFA de 4% e loja a-18 ° C até usam para a fixação das células.
   Cuidado: solução 1) hidróxido de potássio é corrosiva. Esteja ciente de proteção da pele e olhos. 2) PFA é cancerígeno. Evite a inalação e contacto com a pele. Preparar a solução de fixação sob um capô.
4. Solução de permeabilização: adicionar 50 µ l Octoxinol 9 a 50 mL PBS para obter uma solução de aproximadamente 0,1% Octoxinol 9.
5. Obstrui a solução: preparar 5% e 2% de bloqueio soluções misturando o agente bloqueio de proteína com PBS e loja em 6 – 8 ° C.

2. Preparação das amostras

1. fibroblastos em cultura de células: cultivar fibroblastos humanos da linha celular NHDF em um umidificado 5% CO ₂ atmosfera a 37 ° C em meio RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal bezerro, 4 mM glutamina e 1% penicilina/estreptomicina.
   1. a preparação de uma lâmina de microscópio com aderente fibroblastos
      1. remover o meio do balão (área de crescimento de ² de 75 cm), com crescimento exponencial fibroblastos NHDF. Adicione 10 mL de PBS no balão. Lave os fibroblastos aderentes suavemente agitando manualmente o frasco de 1 min.
      2. Remover a PBS e adicionar tripsina 1 mL para o frasco. Agite o frasco com cuidado para assegurar que todas as células aderentes são cobertas por tripsina. Retire o balão a tripsina. Colocar o balão em incubadora para 5 min a 37 ° C.
      3. Tomar o frasco fora da incubadora e adicionar 10 mL de RPMI 1640 de meio para o balão. Pipetar o meio subindo e descendo várias vezes para dispersar os fibroblastos.
      4. Pipetar 0,3 mL dos fibroblastos dispersos em cada um dos dois campos da lâmina de microscópio e colocar o slide em incubadora para 24h para que os fibroblastos aderirem ao slide. Para imunocoloração de γH2AX e 53BP1 em núcleos de fibroblastos, avançar para o passo 3.1.
2. Amostras de pacientes
   1. amostras de sangue: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante e adicionar sangue 7 mL para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isolar a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3).
   2. Amostras de medula óssea: usar os tubos de coleta que foram preenchidos com 2 mL da solução anticoagulante (etapa 1.1) e adicionar 7 mL medula para os tubos. Armazene as amostras durante a noite em temperatura ambiente (ou seja, 18-20 ° C). No dia seguinte, isole a fase G0/G1 descansando células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade (etapa 2.2.3). Use microbeads CD34 e colunas de separação para o isolamento de células CD34 + da pilha.
   3. Isolamento de células mononucleares por centrifugação gradiente de densidade
      Nota: As células mononucleares são isoladas de amostras de sangue e medula óssea por centrifugação gradiente de densidade ^{17 , 18 , 19}.
      1. Diluir a amostra de sangue heparinizado em uma proporção de 1:1 com PBS e a amostra heparinizada medula óssea na proporção de 1:3 com PBS. Suspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes.
      2. Adicionar um volume de meio de gradiente de densidade para um tubo de fresco. Camada delicadamente o sangue diluído ou medula óssea em cima do meio de gradiente de densidade. Tome cuidado para não misturar as duas camadas.
      3. Centrifugar o tubo durante 30 min à temperatura ambiente e 400 g. x desviar a camada superior de plasma com a pipeta. Então, cuidadosamente Colha as células mononucleares na camada acima do meio de gradiente de densidade. Transferir as células mononucleares em um tubo fresco.
      4. Adicionar pelo menos três volumes de PBS para as células mononucleares no tubo. Suspenda as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes. Centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x
      5. Após o spin remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de 4 ° C, 1 x solução de lise de eritrócitos. Ressuspender as células suavemente desenhando-as dentro e fora da pipeta duas vezes e colocar o tubo no gelo por 5 min. Em seguida, adicionar 30 mL de PBS a 4 ° C e centrifugar o tubo para 10 min a temperatura ambiente e 400 g. x
   4. Preparação da cytospins
      1. preparar dois cytospins com células mononucleares das amostras (ou seja, um cytospin para coloração de imunofluorescência de γH2AX e um cytospin para γH2AX e 53BP1 combinado a mancha da imunofluorescência) por centrifugação (300 x g, 10 min) de 1,0 x 10 ⁵ células para cada preparação ( Figura 3 e 4).

3. γH2AX e coloração de imunofluorescência de 53BP1

1. fixação e permeabilização: consertar as células com 200 µ l de 4% PFA por 10 min. Após a fixação, lave suavemente as células três vezes com 30 mL de PBS por 5 min num agitador de laboratório. Em seguida, permeabilize as células com 200 µ l de 0.1% Octoxinol 9 de 10 min. lavar as células suavemente três vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 5% por 5 min num agitador de laboratório. Bloquear as células em 30 mL de fresco 5%, que obstrui a solução por 1 h.
2. De incubação com anticorpos
   1. incuba uma preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e a outra preparação das células com um anticorpo monoclonal anti-γH2AX de rato (1: 500) e um anticorpo de coelho policlonal anti-53BP1 (1: 500) durante a noite em 4 ° C.
   2. Após incubação lavar as células suavemente 3 vezes com 30 mL de solução de bloqueio de 2% por cada 5 min em um shaker laboratório.
   3. Remover a solução de bloqueio e incubar a primeira preparação das células com um anticorpo secundário de anti-rato conjugada Alexa488 cabra (1: 500) e a segunda preparação das células com uma cabra Alexa488-conjugado anticorpo secundário anti-rato ( 1: 500) e um burro Alexa555-conjugado anticoelho anticorpo secundário (1: 500) por 1h à temperatura ambiente.
3. Meio de montagem: Coloque o slide com as células em uma tigela e lave as células suavemente três vezes com 30 mL de PBS para cada 5 min num agitador de laboratório. Remover a PBS e montar as células com o meio de montagem contendo 4,6-diamidino-2-phenylindole. Cautelosamente, colocar uma lamela em cima do meio de montagem para que nenhuma bolha de ar incorporado. Espere pelo menos 3 h para endurecimento do meio de montagem antes de analisar as células por microscopia de fluorescência.

4. Análise de γH2AX e 53BP1 focos

1. microscopia de fluorescência: analisar os focos de γH2AX e 53BP1 no núcleo de células com um microscópio de fluorescência, equipado com filtros para DAPI, Alexa 488 e Cy3 durante a imagem latente em um objetivo X 100 ampliação. Gravar imagens com uma câmera e processar as imagens com o software de imagem adequado.

Resultados

Análise dos focos de γH2AX nas células é mais preciso na fase G0/G1 e a G2 fase quando γH2AX focos aparecem como distintos pontos fluorescentes (Figura 5A). Em contraste, análise dos focos de γH2AX nas células durante a fase S é complicado por manchas dispersas γH2AX pan-nuclear causadas pelo processo de replicação (Figura 5B).

Fixação das células foi rea...

Discussão

Microscopia de imunofluorescência de γH2AX e 53BP1 é um método útil para analisar a formação e reparação de ORL em um amplo espectro de domínios de investigação. Parâmetros críticos que influenciam o resultado dos experimentos são a fase do ciclo celular, os agentes utilizados para a fixação e permeabilização das células, a escolha dos anticorpos e o hardware e software, o microscópio de fluorescência.

A influência do ciclo celular em padrões de focos γH2AX foi demonst...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software