Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Resumo

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

Resumo

Interações da proteína-proteína são mecanismos fundamentais para a retransmissão de transdução de sinal em processos mais celulares; Portanto, a identificação dos pares de interação da proteína-proteína do romance e monitoração dinâmica da interação da proteína são de particular interesse por revelar como as plantas respondem a fatores ambientais e/ou sinais do desenvolvimento. Uma infinidade de abordagens foram desenvolvidas para examinar as interações da proteína-proteína, seja in vitro ou em vivo. Entre eles, a complementação de luciferase recentemente estabelecida de imagem (ICM) ensaio é o método mais simples e mais rápido para demonstrar na vivo interações da proteína-proteína. Neste ensaio, proteína ou proteína B está fundida com a metade de amino-terminal ou carboxila-terminal de luciferase, respectivamente. Quando a proteína A interage com a proteína B, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para formar uma enzima luciferase funcional e activa. Atividade do luciferase pode ser gravada com um luminómetro ou CCD da câmera. Em comparação com outras abordagens, o ensaio LCI mostra interações da proteína-proteína, tanto qualitativa como quantitativamente. Infiltração de Agrobacterium em folhas de Nicotiana benthamiana é um sistema amplamente utilizado na expressão de proteínas transitória. Com a combinação de LCI e expressão transiente, essas abordagens mostram que a interação física entre COP1 e SPA1 foi gradualmente reduzida após o tratamento jasmonate.

Introdução

A fim de coordenar o crescimento com seu ambiente, as plantas evoluíram elegantes vias de sinalização para sentir, transduce e responder a sinais de sinalização. Como os corredores em uma corrida de revezamento, as proteínas são necessários jogadores na transdução de sinal da planta. Foi amplamente reconhecido que a interação da proteína-proteína (PPI) desempenha um papel importante para a comunicação celular. Degradação, acetilação e fosforilação de proteínas são todos dependentes da interação física entre uma proteína do alvo e suas enzimas modificando. Por exemplo, Jasmonate ZIM-domínio da proteína (JAZ) família proteínas interage com um factor de transcrição MYC2... e suprimir sua atividade transcricional^1,2. Dada a importância do PPI, proteínas em grande escala interactomes em plantas têm sido recentemente exploraram^3,4,5. Estes resultados interactome mais revelam a complexa rede de regulamentação que coordena diversas funções celulares.

Existem algumas abordagens estabelecidas para o monitoramento de PPI. O fermento dois híbridos (Y2H) é o método mais utilizado para a deteção de PPI. Y2H é fácil de executar e apropriado para um teste rápido examinar interações da proteína. Y2H é também amplamente utilizado para a seleção de parceiros de interação desconhecida para o proteína de interesse específico. No entanto, porque Y2H é inteiramente realizado em fermento, ele não pode refletir o cenário real em planta células e traz altas taxas de falsas positivas. Outra estratégia semelhante é o ensaio de suspenso. Em geral, duas proteínas são expressas e purificadas de células de Escherichia coli misturadas e imobilizadas para detectar interações da proteína. Embora este método não é demorado, isso não é possível obter na vivo resultados de interação também. Para fins de interação na vivo , co-imunoprecipitação (co-IP) é o ensaio mais popular, que exige o anticorpo de alta qualidade para immunoprecipitate o proteína de interesse e não pode excluir a possibilidade de IPP indireta. Além disso, devido os procedimentos experimentais complicados em co-IP, os resultados geralmente variam com a experiência individual.

Ensaios de reconstituição do repórter baseado grandemente avançam a detecção de na vivo PPI. Estes métodos incluem fluorescência ressonância energia transferência (FRET)⁶, fluorescência bimolecular complementação (BiFC)⁷e a complementação de luciferase de vaga-lume de imagem (ICM) ensaio⁸. Embora essas três abordagens são melhor do que co-IP para refletir o direto na vivo PPI, FRET e BiFC precisam de microscópios específicos para detectar sinais de fluorescência e facilmente não podem quantificar a intensidade de interação. Em contraste, a LCI tira proveito da luciferase de vaga-lume, que irá brilhar após reagir com sua Luciferina de substrato. Mais importante, intensidade PPI pode ser determinada do valor da atividade de luciferase. Assim, a LCI não só indica se duas proteínas interagem ou não, mas também fornece informações sobre a dinâmica de interação com o tratamento. Embora existam alguns métodos estabelecidos para monitorar a interação dinâmica (baseada em turnos de ressonância ou thermo-estabilidade de plasmon de superfície)^9,10, essas abordagens requerem instrumentos delicados ou rotulagem específica. Em contraste, a LCI é mais fácil de executar e detectar.

O princípio para a LCI é que as metades amino-terminal e carboxila-terminal de luciferase (chamado N-Luc ou C-Luc, respectivamente) foram fundidos com a proteína A e B e estes dois fusion proteínas simultaneamente foram expressos em células vegetais. Se A proteína interage com a proteína B, então, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para ser uma enzima luciferase ativo. Atividade do luciferase pode ser detectada com um luminómetro ou CCD da câmera. Não é necessário obter transformants estável para LCI; expressão transiente é suficiente para obter um resultado de interação de alta qualidade.

ANEL-tipo E3 ubiquitina ligase constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interage com uma miríade de fatores de transcrição e promove sua degradação através do Proteassoma 26S¹¹. Alguns desses fatores de transcrição COP1-alvo são os reguladores positivos para Fotomorfogénese. No escuro, COP1 interage com supressor de fitocromo A-105 1 (SPA1), que aumenta a atividade de E3 COP1⁸. Após a percepção de luz, fotorreceptores irão revogar a interação COP1-SPA1 para inibir a atividade COP1 e depois estabilizar COP1 substratos^12,13,14. Este exemplo ilustra a importância biológica da PPI a estudar e determinar a dinâmica do PPI.

Protocolo

1. preparação de plantas (8 semanas)

1. Colocar 50 sementes de Nicotiana benthamiana em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 1 mL de 5% NaClO e solução de 0,1% Triton X-100 (V/V) e deixar por 5 min esterilizar as sementes.
2. Lave as sementes com água esterilizada 5 vezes e suspender as sementes em 200 µ l de água estéril.
3. Cuidadosamente o lugar individual sementes na superfície do MS-ágar-ágar (1 l: 1 x Murashige & Skoog sais, 10 g de sacarose, pH 5,8 (KOH), 1% de ágar) com dicas bem e loja médio chapas em 4 ° C por 3 dias para sincronizar a germinação.
   Nota: Para evitar a contaminação de micróbio, execute esta etapa sobre uma bancada limpa. Não é necessário apertar o tubo durante a esterilização.
4. Coloque placas médias em condições normais de crescimento (22 ° C, 80-90 µmolm^-2s^-1 branco intensidade de luz) por 10 dias e depois transferir as mudas germinadas em solo.
   Nota: Certifique-se de inserir as raízes das mudas no solo e não danificam as raízes. Cubra a bandeja com uma tampa de plástico transparente durante a noite para manter a umidade.
5. Cultivar plantas em uma sala de crescimento controlado em uma umidade de ciclo e 70% de luz/escuro h 16/8 h. 7 semanas de idade N. benthamiana plantas estão prontas para a infiltração Agrobacteriumtumefaciens (Figura 1A).
   Nota: Regar as plantas e controlar pragas como necessário para manter as plantas saudáveis.

2. expressão transiente em folhas de S. Benthamiana (7-10 dias)

1. Entregar 150 ng de plasmídeos (plasmídeo controle pEGAD-HA-LUC, vetor vazio e plasmídeo construído para LCI do ensaio, neste caso usamos Nluc-pCAMBIA1300 e pCAMBIA1300-Cluc para construção de plasmídeo) em células competentes da . tumefaciens estirpe GV3101 com um método padrão de eletroporação.
2. Cultura a. tumefaciens em Luria-Bertani (LB) ágar médio (1 l: 10 g de NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g triptona, 1,5% de ágar) contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina a 28 ° C, durante 4 dias.
   Nota: A escolha de antibióticos depende do vetor e a cepa da . tumefaciens usado.
3. Inocular uma única colônia da . tumefaciens de cada prato em 3 mL de meio líquido LB, contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina e agitar a 220 rpm a 28 ° C por 24 h propagar a cultura de células.
4. Transferência de 75 µ l de cultura bacteriana em 15 mL fresco LB meio líquido contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina, diluindo-a por um fator de 200. Cultura de bactérias em 220 rpm a 30 ° C, durante cerca de 8 h, até OD₆₀₀ é entre 0,5 a 1,0.
5. Transferir a cultura líquida da . tumefaciens em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 4.000 x g e 4 ° C por 15 min. descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 15 mL de solução de transformação para lavar o sedimento.
6. Girar o tubo a 4.000 x g e 4 ° C por 15 min e descartar o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.
7. Resuspenda o pellet em 5 mL de solução de transformação e manter por 2 h à temperatura ambiente. Ajuste a densidade de células da . tumefaciens pelota com solução de transformação até a concentração final de OD₆₀₀ é 0,5, ou mistura duas amostras com igual volume para testes interações proteína emparelhados.
8. Infiltrarem células suspensas 4^th para 7^th folhas com uma seringa de 1 mL auto-injeções (Figura 1B-C). Após a infiltração, cobrir as plantas imediatamente com uma cobertura de plástico preta e coloque o tabuleiro no escuro por 12h. Depois disso, cultivar plantas, como de costume para 2 a 4 dias antes de detectar atividades LUC.
   Nota: Escolha folhas saudáveis de tamanho similar. A infiltração de quatro zonas diferentes em uma folha está bem.

3. detecção de atividade de Luciferase (um dia)

Nota: Existem duas maneiras de monitorar a atividade do luciferase. Um é baseado na imagem, e o outro é para medir quantitativamente a atividade de luciferase.

1. Método de imagem
   1. Separe uma folha infiltrada e colocar todo o folheto em MS-ágar-ágar.
   2. Pulverize o buffer de trabalho luciferina na superfície adaxial da folha com um frasco de spray 50 mL. Manter os materiais no escuro por 5 min saciar a autofluorescência da clorofila.
   3. Use um CCD de refrigeração de pouca luz (resfriados a-30 ° C) de aparelhos de imagem para capturar imagens (Figura 2). O tempo de exposição de luz-arquivado é de 50 ms e tempo de detecção de luminescência é 1 min.
      Nota: Ajuste os parâmetros de acordo com o manual da máquina. Temperaturas mais baixas irão melhorar a relação sinal-ruído para melhorar a qualidade de imagem.
2. Alternativamente, medir a luminescência diretamente com um comercial luminómetro.
   1. Cuidadosamente corte fragmentos de folhas (cerca de 0,25 cm²) da área de infiltração das folhas N. benthamiana e imergir o disco de folha em 100 µ l de água deionizada em um prato branco de 96 poços (Figura 3).
   2. Adicionar 10 µ l de tampão de trabalho luciferina e deixar por 5 min. Em seguida, execute tratamentos específicos para estudar a dinâmica da interação da proteína.
      Nota: Detecta a luminescência com um luminómetro em pontos de tempo diferentes para obter a dinâmica de actividade de luciferase, que representam a cinética de interações da proteína-proteína sob determinados tratamentos. Este método tem vantagens para testar um grande número de pares de proteína simultaneamente. Para aqueles sem um comercial luminómetro, examinar as abundâncias de proteína luciferase pelo borrão ocidental, portanto, referir-se a LUC atividade quantitativamente. Se a luz não é necessariamente obrigatório, apenas manter a placa no luminómetro e medir a luminescência em pontos diferentes do tempo. Caso contrário, mova a placa em uma câmara de crescimento durante a abertura da deteção. Para obter resultados estatisticamente significativos, use pelo menos três repetições biológicas. Embora atividades LUC de zonas de infiltração diferentes irão variar, seus padrões de mudanças são consistentes após a normalização.

Resultados

Três etapas principais podem ser apontadas no presente protocolo de complementação do luciferase para o estudo da proteína-proteína interações na vivo, incluindo o crescimento das plantas, infiltração de tabaco e o ensaio de luciferase. A etapa mais crucial neste protocolo está infiltrando líquido a. tumefaciens em folhas de s. benthamiana (Figura 1).

Aqui está...

Discussão

O protocolo descrito aqui é simples e reproduzíveis para estudar na vivo interações da proteína-proteína e particularmente adequado para a detecção dinâmica da interação da proteína sob tratamento exógeno. A etapa chave neste ensaio é infiltração N. benthamiana . Para garantir o sucesso de infiltração, as plantas devem ser muito saudáveis. Outro fator crítico é quando verificar a actividade do luciferase após infiltração. Não há nenhuma resposta correta para esta questão. Os i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml