Rastreamento neuroanatômica retrógrado do frênico neurônios em ratos

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo para identificar frênico neurônios em ratos após entrega intrapleural de fluoróforo conjugado beta de subunidade de toxina de cólera. Duas técnicas são comparadas para injetar a cavidade pleural: transdiaphragmatic versus transtorácicos abordagens.

Resumo

Frênico neurônios motores são cervicais neurônios motores provenientes de C3 a C6 níveis em espécies de mamíferos mais. Axonal projeções convergem em nervos frênico que inervam o diafragma respiratório. Em fatias de medula espinhal, neurônios frênico não pode ser identificados de outros neurônios motores em critérios morfológicos ou bioquímicos. Nós fornecemos a descrição dos procedimentos para a visualização do neurônio motor frênico corpos celulares em camundongos, seguir intrapleural injeções de beta cólera toxina subunidade (CTB) conjugada com um fluoróforo. Este marcador fluorescente neuroanatômica tem a capacidade de ser pego na junção neuromuscular de diafragma, efectuar-se retrogradely ao longo dos axônios frênico e alcançar os frênico corpos celulares. Duas abordagens metodológicas da entrega CTB intrapleural são comparadas: transdiaphragmatic versus transtorácicos injeções. Ambas as abordagens são bem sucedidas e resultam em número semelhante de CTB-rotulado frênico neurônios motores. Em conclusão, essas técnicas podem ser aplicadas para visualizar ou quantificar os neurônios motores frênico em vários estudos experimentais tais como aqueles focados no circuito frênico-diafragma.

Introdução

O objetivo do estudo é apresentar um método confiável para identificar os neurônios motores frênico (PhMN) em seções de rato da medula espinhal. Injeção de um traçador fluorescente neuroanatômica na cavidade pleural foi escolhida como o método de entrega para alcançar as projeções frênica neuromusculares sobre o diafragma e usar o transporte retrógrado ao longo dos axônios frênico para rótulo frênico corpos celulares. Duas técnicas de entrega intrapleural são descritas: transdiaphragmatic versus transtorácica.

Frênico neurônios são células de relé espinhal cujos axônios convergem em nervos frênico, que em última análise, inervam o diafragma. Estes são os neurônios motores inferiores recebendo o drive inspiratório do centro respiratório bulbar e retransmitindo-as junções de diafragma neuro-muscular (JNM). PhMN estão estruturados em duas colunas de motor, uma para cada hemicord, correndo ao longo da espinha meados-cervical. Na maioria das espécies mamíferas, incluindo os seres humanos, as colunas de motor frênica espalhar de níveis C3 a C6^1,2,3. Nós e os outros confirmaram que PhMN concentrada nos níveis C3-C5 no rato e o rato da medula espinhal^4,5,6,7,8. A distribuição topográfica das células frênica não é ao acaso; os neurônios motores que inervam a parte esternal do diafragma são mais densamente distribuídos na parte cranial da frota de veículos frênica (C3), Considerando que os neurônios motores que inervam a parte crural são mais caudal (C5)⁹. Além disso, PhMN estão agrupadas vària no Corno ventral cinzenta. A nível de C3, os clusters de células frênico minto lateralmente, então eles se deslocar em uma direção ventrolateral e encontram-se ventromedially com a mais caudal níveis^10,11.

Dado o seu papel vital durante a inspiração, é de extrema importância para identificar com precisão a PhMN na medula espinhal saudável mas também seguir seu destino durante condições patológicas, tais como doenças degenerativas ou lesões traumáticas da medula espinhal. Desde que PhMN não diferem morfologicamente outros neurônios motor cervicais, identificação de PhMN baseia-se na entrega alvo dos marcadores neuroanatômica, tanto ao nível dos centros respiratórios primária⁸, ou diafragma MNJ⁷ ou em o nervo frênico⁴. O tracer é retomado pelas fibras nervosas e transportado até os frênico corpos celulares na coluna cervical, onde ele pode ser visualizado usando sistemas de deteção direta ou indireta. Retrógrada ou anterógrada traçadores são comercialmente disponíveis com uma ampla gama de conjugados. Notável, cada marcador é dotado não, baixas ou altas habilidades para rastreamento sináptica trans.

No estudo atual, nós escolhemos a subunidade beta a toxina da cólera (CTB) acrescida com Alexa Fluor 555 (doravante referido como CTB-fluoróforo) como uma etiqueta fluorescente, permitindo uma visualização directa de PhMN em seções congeladas da medula espinhal. CTB normalmente é descrito como um tracer monosynaptic embora dados experimentais tendem a mostrar uma passagem de transneuronal¹². CTB tem a capacidade de vincular o gangliosídeo GM1 na membrana plasmática do fim do nervo. CTB é internalizada através de Clatrina dependente ou - independente mecanismos e tráfegos através da rede trans-Golgi em retículo endoplasmático em uma moda retrógrada^13,14. A internalização e o transporte retrógrado parecem ser dependente sobre o citoesqueleto de actina^15,16 , bem como sobre a rede de microtúbulos¹⁷.

Para demonstrar a utilidade do CTB como um traçador neuroanatômica retrógrada rotulagem diafragma-PhMN circuitos, CTB-fluoróforo foi entregue intrapleurally. CTB foi administrado usando duas técnicas: a primeira que incluía uma laparotomia e múltiplas injecções de transdiaphragmatic; o segundo, menos invasiva, usado uma única injeção transtorácica. Quatro dias mais tarde, fluorescente-etiquetadas PhMNs foram quantificados na medula espinhal cervical de ambos de saudável e de feridas spinally (C4) animais.

Protocolo

O protocolo experimental foi realizado em conformidade com as directivas do Conselho das Comunidades Europeias para o experimento Animal (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) e foi aprovado pelo Animal ética Comissão de Universidade de Namur (ética projeto n ° 17-284 ). A Figura 1 descreve as duas abordagens respectivas: transdiaphragmatic ou injeções transtorácicos. Usar camundongos C57bl/6J machos (n = 18), a idade de 3 a 4 meses no estudo.

1. preparação da solução do CTB

1. Para injeções de transdiaphragmatic:
   1. Dissolva o poder do CTB em água estéril na concentração de 0,2% (p/v).
   2. Carrega 7,5 µ l da solução CTB (0,2% p/v) em um estéril 10-µ l-microseringa com uma agulha de calibre 33 anexada (chanfro sem corte ou curto) para cada rato.
2. Para injeção transtorácica:
   1. Dissolva o poder do CTB em água estéril na concentração de 0,1% (p/v).
   2. Carrega 20 µ l de solução CTB (0,1% w/v) em uma seringa estéril de insulina-500-µ l com uma agulha de calibre 27 chanfrada para cada rato.
      Nota: Certifique-se de usar água destilada e esterilizada e dissolver adequadamente o pó do CTB. A solução pode ser mantida a 4 ° C por um mês (não congelar). Um precipitado pode formar após alguns dias. Trazer a solução à temperatura ambiente e misture bem com uma pipeta antes do uso.

2. preparação antes da Intrapleural injeções

1. Esterilize instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia, utilizando o esterilizador autoclave ou grânulo de vidro. Prepare um casaco de banco limpo para fazer a cirurgia e para dispor os instrumentos cirúrgicos.
   Nota: Qualquer material utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser estéril. Instrumentos que não podem ser esterilizados, tais como o microseringa deve ser limpo com um desinfectante (Clorexidina) ou deve ser descartáveis apenas. O cirurgião deve lavar suas mãos com um desinfectante (esfoliante de clorexidina) antes do início da cirurgia. O cirurgião deve vestir um vestido limpo, uma máscara e luvas estéreis.
2. Pesar o animal e administrar uma dose apropriada de anestesia: injeção intraperitoneal de anestésico cocktail (por exemplo, a cetamina 100mg/kg e xilazina 5 mg/kg).
3. Aperte o dedo do pé e/ou verificar se há a perda do reflexo palpebral para determinar se o mouse está devidamente anestesiado. Aplica uma pomada de vet para proteger a córnea.
4. Raspe com cuidado a pele ventral (para o procedimento de transdiaphragmatic) ou a lado direito torácica pele (para procedimento transtorácica), usando o cortador de cabelo elétrico. Raspe bem e suficientemente ampla para evitar cabelo entrando no campo da cirurgia.
5. Assegurar condições assépticas por aplicação tópica de solução de iodo 10% sobre a área depilada. Esfregue o local cirúrgico com a solução de iodo, tendo o cuidado de esfregar no centro do local em direção a periferia.
6. Use uma almofada homeotérmicos durante a cirurgia para manter a temperatura do corpo do animal.

3. Intrapleural injeções usando a abordagem de Transdiaphragmatic

1. Coloque o mouse anestesiado em posição supina sobre uma almofada de aquecimento. Coloque uma gaze enrolada sob o pescoço do animal. Para um rato adulto, use uma gaze enrolada de 0,5 polegada de espessura. Fita esta almofada ao Conselho de cirurgia para evitar o movimento, se houver.
2. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão na pele ventral ao longo da linha mediana: fazer uma incisão do processo xifoide à região umbilical ao esticar a pele lateralmente com a outra mão para fazer a pele esticada. Não exerça demasiada pressão sobre a lâmina para não danificar os órgãos subjacentes.
3. Usando tesouras pequenas, cuidadosamente retire a pele dos músculos ao redor da incisão abdominais. Este procedimento ajudará na costura dos músculos e a pele separada no final da cirurgia.
4. Realize laparotomia usando tesouras pequenas. Abra a cavidade abdominal através da realização de uma incisão de caseado ao nível do umbigo. Faça uma incisão ao longo da linha branca, os músculos abdominais ("linea alba") até o processo xifoide.
5. A fim de visualizar a superfície abdominal, do diafragma, retrai os músculos abdominais, usando afastadores comerciais ou caseiros.
   Nota: Estes retractores podem ser feitos de clipes de papel de tamanho midi moldadas em L-gancho¹⁹.
6. Estique-se ambos os lados da laparotomia e fita para baixo os afastadores para revestir o banco. Otimize a iluminação do campo de visão para que a superfície abdominal, do diafragma é não mais na penumbra. O mais poderoso dispositivo de iluminação para esta finalidade é uma lâmpada de LED com um feixe de luz orientável.
7. Usando uma pinça macia em uma mão, levante o apêndice xyphoid e puxar para baixo os lóbulos laterais do fígado (Figura 2A). Usando tesouras pequenas na outra mão, cuidadosamente corte o ligamento suspensor, sem danificar a vesícula biliar ou do diafragma (Figura 2B).
8. Usando uma pinça macia em uma mão, levante o apêndice xyphoid. Segure a seringa Hamilton na outra mão. Alvo de três locais de injecção no diafragma para cobrir respectivamente o esterno, a medial e as regiões crural (Figura 3A, inserir-se na Figura 3B).
9. Como a espessura do diafragma é em torno de 0,37 mm em ratos⁷, insira a agulha não mais de 1 ou 2 mm além da folha de diafragma para impedir os danos de pulmão durante a respiração. Entrega 2,5 µ l de solução CTB (0,2% p/v) através do diafragma direito em cada local (Figura 4B). Estabilização do diafragma não é necessária.
10. Repita este procedimento para os três sites ipsilaterais da injeção (figura 1A) e contralaterally para uma rotulagem bilateral da piscina PhMN.
11. Para fechar o site de laparotomia, suture os músculos abdominais com reabsorvíveis sutura 4-0. Uso interrompidos pontos espaçados de 3 mm. pele de grampo fechado com grampos de 9,0 mm ferida. Aperte os grampos para impedir que o animal retirar agrafos. Espaço grampeia separado aproximadamente 5 mm. Não aperte os clipes de ferida, como isso pode levar a cicatrização prejudicada.
12. Limpa micro seringa com água destilada para evitar o entupimento. Lentamente, elaborar e expulsar 2 - 3 vezes. Não extrair o ar na seringa.

4. Intrapleural injeção usando abordagem transtorácica

Nota: Este método é inspirado o procedimento descrito em ratos⁴ e foi adaptado ao rato.

1. Coloque o mouse anestesiado em esquerda posição decúbito lateral, sobre uma almofada de aquecimento (Figura 4A).
2. Identifica as sexta e sétima costelas sob a prega do cotovelo através da palpação manual (Figura 4B).
3. Enquanto o assistente se estende direito dianteiro - e -membros posteriores (Figura 5A), inserir a seringa orientada cranialmente e tangencialmente sob a sexta ou sétima vértebra, 3 mm de profundidade da pele, com o bisel para baixo (figura 1B e Figura 5B).
4. Eleve a agulha suavemente para confirmar, levantando as costelas, se ele está bem posicionado dentro da cavidade torácica (Figura 5, as inserções na figura 1B).
5. Estabilize a respiração movimentos do tórax, aplicando leve pressão com dois dedos na parede torácica.
6. Mantendo a seringa na outra mão, entrega 20 µ l de solução CTB (0,1% w/v) em uma única injeção.

5. no pós-operatório cuidados

1. Imediatamente após o procedimento, coloque o mouse na posição de decúbito lateral direita sobre uma almofada homeotérmicos para recuperação. Isto assegura o tracer para espalhar no lado direito da cavidade pleural e permite o monitoramento de respiração do animal.
2. 1 mL de solução salina estéril i.p. Administre por via subcutânea. Fornece acompanhamento injeções se o animal for exibida, desidratados e/ou apático.
3. Administrar por via subcutânea 0,1 mg/kg de buprenorfina, duas vezes por dia durante o primeiro dois dias depois da cirurgia, para minimizar qualquer dor potencial.
   Nota: Muitas instituições recomendaria analgesia multimodal de procedimentos invasivos, tais como a laparotomia retratado aqui. Isto pode incluir a utilização de um não-esteroides anti-inflamatórios (AINEs) e/ou de um agente anestésico local no local da incisão. Esses medicamentos normalmente são entregues antes da primeira incisão para minimizar a dor de dar corda.
4. Monitorar os animais diariamente até a eutanásia.

Resultados

Camundongos C57bl/6J machos (n = 18), com idade de 3 a 4 meses foram incluídos no estudo. No dia 0 do experimento, 8 ratos sofreram uma contusão unilateral do C4, lado direito, de acordo com o protocolo publicado^7,18. Como procedimento de Souza, 10 ratos foi submetido a uma laminectomia em cima C4 sem contusão. No dia 3, os ratos estavam preparados para as injeções intrapleural do CTB-fluoróforo de acordo com os dois procedi...

Discussão

O protocolo descrito neste documento pode ser aplicado a qualquer tipo de ratos adultos ou qualquer paradigma experimental em que a integridade do diafragma-PhMN circuito deve ser avaliada. Por exemplo, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e lesão medular cervical (cSCI) são condições associadas com perda de PhMN, anterógrada degeneração dos axônios frênico e subsequente compromisso respiratório. Modelos animais de ALS ou cSCI imitam histopatológicos e funcionais respiratórios déficits observados em doenç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm