Microscopia com base em métodos de avaliação da migração de células epiteliais durante a cicatrização em Vitro

Resumo

Este manuscrito descreve como incisão lesões-feitas em monocamadas de células epiteliais culta convenientemente modelo ferida cura em vitro, que permita a para a imagem latente confocal ou microscopia de varredura a laser, e que pode proporcionar alta qualidade dados quantitativos e qualitativos para estudar tanto o comportamento da célula e os mecanismos envolvidos na migração.

Resumo

Migração celular é um aspecto obrigatório para cicatrização de feridas. Criação artificial feridas em modelos animais de pesquisa muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, enquanto potencialmente carente de precisão. Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma plataforma adequada para pesquisar o comportamento de células migratórias na cicatrização de feridas e o impacto de tratamentos nessas células. A fisiologia das células epiteliais é frequentemente estudada em condições não-confluente; no entanto, esta abordagem pode não se assemelham a ferida natural, condições de cura. Rompendo a integridade do epitélio por meios mecânicos, gera um modelo realista, mas pode impedir a aplicação de técnicas moleculares. Consequentemente, as técnicas de microscopia com base são ideais para estudar a migração de células epiteliais in vitro. Aqui nós detalhe dois métodos específicos, o ensaio de zero ferida artificial e o ensaio de migração artificial frontal, que pode obter dados quantitativos e qualitativos, respectivamente, sobre o desempenho migratório das células epiteliais.

Introdução

Migração celular é necessária para a cicatrização de feridas, como é responsável para o fechamento final do gap epitelial e restauração da superfície interrompidos¹. Apresentando ferimentos artificiais em modelos animais permite a replicação deste complexo processo em perto de condições fisiológicas². No entanto, esta abordagem muitas vezes resulta em procedimentos experimentais caros e complicados, que potencialmente carecem de precisão para o estudo de processos distintos, devido à natureza complexa do processo de cicatrização de feridas.

Cultura in vitro de linhas de células epiteliais fornece uma alternativa útil para modelos animais para pesquisar o papel que estas células desempenham na cicatrização de feridas e os efeitos do tratamento sobre comportamento migratório de célula. A fisiologia das células epiteliais geralmente é estudada por técnicas moleculares usando não confluente culturas^3,4,5,6; no entanto, o rompimento da integridade do epitélio é geralmente conseguido incisões mecânicas fina. Em cultura de células, isto implica que o insignificante número de células pode ser exposto para a abertura da ferida, e representam uma amostra muito pequena para as técnicas de biologia molecular. No entanto, estas lesões podem ser estudadas em escala microscópica, aproveitando as propriedades migratórias inatas de algumas linhas de células epiteliais, tais como a célula epitelial de pulmão vison (Mv1Lu) ou a célula de queratinócitos humanos espontaneamente imortalizado (HaCaT) linhas.

Aqui nós descrevemos um método para a microscopia que é adequado para obter dados quantitativos sobre a migração de células epiteliais no contexto de^3,4,7,8de cicatrização de feridas. Além disso, apresentamos métodos adicionais que são úteis para estudar mudanças qualitativamente moleculares e morfológicas que ocorrem em monocamadas epiteliais durante a migração. Em geral, esses métodos fornecem uma estrutura para estudar a dinâmica e a mudanças morfológicas envolvidas com comportamento de célula epitelial e resposta aos tratamentos durante a cicatrização de feridas.

Protocolo

1. artificial ferida ensaio zero para estudos quantitativos

1. Preparação de monocamadas de células
   1. Trabalhando sob condições estéreis, de sementes e desenvolvem-se células epiteliais Mv1Lu ou HaCaT em frascos de cultura usando meio de soro-completada. Atualize médio uma vez cada 24-48 h. Depois que as células alcançar 80% de confluência, desanexe células usando um método adequado, ou seja, tripsinização⁹.
      Nota: Mv1Lu HaCaT linhas de células epiteliais são cultivadas usando meio de cultura EMEM e DEMEM, respectivamente, suplementado com 2 mM L-glutamina e incubadas a 37 ° C, com uma atmosfera controlada de 5% de CO₂. Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-4 x 10⁴ ou 4-6 x 10⁴ células/poço, respectivamente, são semeados em um frasco de cultura² 175 cm, e em 80% a confluência rende até 35 x 10⁶ Mv1Lu ou 1 x 10⁷ células de HaCaT.
   2. Em qualquer uma placa de cultura bem-12 ou 24-bem, as sementes em cada poço 2 mL de células. Atualize a média uma vez a cada 24-48 h. Certifique-se de números de telemóvel são altos o suficiente para alcançar a confluência de 100% após 2 ou 3 dias.
   3. Depois que as células alcançar confluência, remover o meio suplementado por soro e lavar duas vezes com meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes o arranhador.
      Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células sensíveis a desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pré-revestimento de superfície da placa de cultura, usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado¹⁰.
2. Monocamada coçar
   1. Trabalhando em um ambiente estéril, arranhe a monocamada de cultura arrastando-se firmemente a extremidade estreita de um 20 µ l ou 200 µ l de micropipeta estéril ponta, dependendo da largura zero desejada. Mantenha a ponta perpendicular à superfície de cultura para maximizar a homogeneidade de lacuna.
      1. Coloque as placas de cultura sobre uma superfície escura para monitorar claramente a monocamada de células. Se necessário, realize dois arranhões perpendiculares (em forma de cruz) em cada poço para estudar até 4 áreas de migração.
   2. Lavam-se células desanexadas removendo suavemente o meio de cultura e suavemente adicionando meio livre de soro fresco. Repita duas vezes, ou até mais solteira células foram removidas.
3. Coleção de dados e procedimento experimental
   1. Com até 4 imagens de referência de pré-tratamento centradas sobre o fosso de risco de cada poço usando um microscópio de contraste de fase invertida, incorporando uma câmera CCD. Selecione áreas de interesse, alinhando a borda do campo do microscópio para o cruzamento adjacente de arranhões.
      Nota: Normalmente, imagens são adquiridas utilizando uma ampliação de 10x e um tamanho de imagem de 1.280 x 1.024 pixels. Seleção de áreas de interesse, como descrito acima ajuda para fácil localização e validação de até 4 medições por bem.
   2. Uma vez que todas as imagens são adquiridas, designar poços de tratamento; câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados.
      Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura.
   3. Incube a placa riscada (37 ° C com uma atmosfera controlada contendo 5% CO₂) até as condições em fechamento de abertura zero observação alcance 90%. Evite o fechamento completo.
      Nota: Encerramento Total lacuna anula coleção pós-tratamento de imagens, como áreas de referência não são detectáveis e a referência de tempo para o fechamento de lacuna não pode ser estabelecida. No caso de células Mv1Lu ou HaCaT, 16-19 h são necessários para alcançar a confluência de 90%.
   4. Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT.
   5. Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes.
      Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente.
   6. Com imagens de referência pós-tratamento de cada poço das áreas de referência original capturado depois de coçar. Use os mesmos equipamentos (microscópio de contraste de fase ótica invertida incorporando uma câmera CCD) e definições de imagem correspondente (ampliação e resolução digital/densidade).
      Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), as imagens do tempo-curso podem permitir o cálculo das velocidades de migração de células individuais.
4. Análise de imagem e quantificação da migração
   1. Usando o software (por exemplo, ImageJ) de processamento de imagem, definir limites de risco lacuna e determinar a superfície de abertura para até quatro medições no pré-tratamento de fotos. Gravar os dados como "superfície de lacuna de pré-tratamento" (PREGAP). Repita o mesmo procedimento para pós-tratamento fotos. Gravar os dados como "superfície de pós-tratamento lacuna" (POSTGAP).
      1. Abra a imagem gravada usando o ImageJ. No menu "imagem", defina o tipo de imagem de 8 bits. No menu "processo", ir para o submenu "filtros" e aplicar a filtragem de "desvio".
      2. No menu "imagem", digite "ajustar" submenu e definir o limiar para preto e branco (B & W), certifique-se de "Fundo escuro" não está seleccionado. No menu "processo", ir para o submenu "binário" e selecione "tapar buracos".
      3. No menu "analisar", selecione "definir medidas" e ative a "área". Em seguida, desenhe a área mensurável, seguindo o contorno de borda migrando delimita, assim, a lacuna.
      4. No menu "analisar", selecione "analisar partículas" e gravar valores de "área total" para a superfície da área desenhada.
   2. Introduzir o PREGAP e POSTGAP valores de área total em uma folha de cálculo para quantificar a migração absoluta para cada conjunto de amostras individuais como a diferença de medições de superfície lacuna: PREGAP − POSTGAP [unidades arbitrárias]. Além disso, normalizar dados de migração absoluta de cada condição para amostras de controlo: (amostra / controle) * 100 [%].
      Nota: Para as células que migram individualmente e preencher a lacuna independentemente da formação de uma frente coerente, (por exemplo, células humanas de câncer de mama MDA-MB-231), a migração absoluta pode ser calculada pela contagem de células invadindo uma central na tira o controle ou as amostras tratadas.
   3. Plotagem de saídas de quantificação (ver Figura 1). Realizar análise estatística se necessário.

Considere o teste t de Student quando comparando duas condições ou teste de análise de variância para o maior número de condições.

2. ensaio da frente de migração artificial para estudos topográficos

1. Preparação de monocamadas de células
   1. Trabalhando em condições estéreis, coloque uma camada de lamelas redondas esterilizadas em placas de cultura vazia até a superfície da chapa é completamente coberto.
      Nota: Até 12 e 33 lamelas cabem em 5 cm e placas de 10 cm de diâmetro, respectivamente.
   2. Na placa de cultura, sementes delicadamente um volume adequado de células em uma concentração que permite a confluência de 100% após 2 ou 3 dias. Certifique-se de que sem lamela se sobrepõe as lamelas de vizinhas e impedir que as lamelas flutuando aplicando uma pressão suave com uma ponta da micropipeta estéril. Atualize o meio cada 24-48 h.
      Nota: Cada linha da célula deve ser analisada cuidadosamente para determinar a concentração de células e temporização necessária para alcançar a plena confluência. Normalmente para as células de Mv1Lu ou HaCaT, 2-3 x 10⁶ ou 2.5-4 x 10 placa de⁶ células/10 cm de diâmetro, respectivamente, são semeados. Para placas menores, deve ser reduzido número de células.
   3. Depois que as células alcançar confluência, remover o meio de soro-completados e substitua meio livre de soro fresco. Manter as células em meio livre de soro durante 24 h antes que a ferida artificial é realizada.
      Nota: Células Mv1Lu ou HaCaT não tem exigências especiais de substrato; no entanto, para linhas de células suscetíveis de desanexação espontaneamente em condições de livre de soro, pre-revestimento da superfície da cultura usando uma solução de poli-L-lisina deve ser considerado¹⁰.
2. Monocamada ferindo
   1. Usando uma pinça estéril, movimente suavemente uma lamela para um prato limpo 10 cm contendo meio livre de soro fresco. Evite danificar a monocamada, segurando a lamela na periferia, com uma pinça. Evite pressão excessiva, o que pode resultar na ruptura da lamela.
   2. Crie feridas artificiais, arrastando uma lâmina de barbear esterilizada em uma linha transversal sobre o centro das lamelas. Arraste 3 a 4 mm e para trás, a fim de remover completamente a tira central monocamada. Certifique-se de que detritos nenhuma célula permanece anexado às bordas da ferida.
      Nota: em um diâmetro de 12 mm redondo lamela, a incisão é feita na meados da lamela. Certifique-se de deixar um traço de células em frente a frente principal grande o suficiente (pelo menos 2 mm de largura) para evitar a inclinação da lamela nas etapas a seguir.
   3. Transferi as lamelas de feridos com células virada para cima, para uma limpeza 6 placa contendo pelo menos 2 mL soro livre meio fresco. Cabem até 4 lamelas feridos/bem.
   4. Delicadamente, lave duas vezes com produtos frescos meio livre de soro para remover células desanexadas.
3. Amostragem e procedimento experimental
   1. Delicadamente câmbio médio em poços com meio fresco que contém tratamentos selecionados.
      Nota: Como alternativa, para produtos químicos ou compostos que não perturbe a homogeneidade do meio de cultura, tratamentos podem ser inoculados diretamente no meio de cultura. Proceda com cuidado para evitar qualquer potencial desprendimento de células.
   2. Manter a placa dentro de uma incubadora de célula (37 ° C, 5% CO₂) para a altura desejada experimental.
   3. Parar a migração celular, fixando as células; delicadamente, substitua o meio de cultura experimental com 1 mL de formol a 4% em PBS. Incubar durante 15 min em RT.
      Nota: Para curso de experiências de tempo, remova as amostras da placa de cultura e corrigi-los em um prato separado para evitar os vapores de formol que afectam as condições experimentais, outras em andamento.
   4. Lavar as células para remover o formol em excesso; Substitua suavemente a solução em poços com PBS fresco. Repita pelo menos duas vezes.
      Nota: Nesta fase, após a selagem, placas podem ser armazenadas a 4 ° C indefinidamente.
4. Imunofluorescência (IF) e análise topológica
   1. Realizar-se a coloração e imagem latente em lamelas individuais como descrito em outra parte^3,4,11.
      1. Permeabilize por 10 min por imersão lamelas em uma solução de Triton X-100 0,3% em PBS.
      2. Bloco para 30 min, usando a seguinte solução de bloqueio: 0,3% albumina de soro bovino; 10% de soro fetal bovino; 5% de leite desnatado; 0,3 solução de Triton X-100% em PBS.
         Nota: Obstrui a solução sem leite pode ser preparado antecipadamente e armazenado a-20 ° C.
      3. Encube por 1h à temperatura ambiente dentro de uma câmara úmida, com anticorpo primário, diluído em solução de bloqueio isento de leite. Coloque as lamelas de ponta-cabeça na solução de anticorpo de 15 µ l para garantir a distribuição adequada.
         Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o anticorpo anti-c-Jun requer uma diluição de 1/100.
      4. Lavar três vezes mergulhando as lamelas em uma solução de Triton X-100 em 0,1% em PBS.
      5. Incube as lamelas em anticorpo secundário diluído em tampão de bloqueio isento de leite por 30 min.
         Nota: A diluição de trabalho do anticorpo é variável e dependerá do anticorpo em uso. Por exemplo, o bode-anticoelho (488) requer uma diluição de 1/400 para resolução ideal. Outros reagentes rotulagem como faloidina e Hoechst 33258 podem ser adicionados para o buffer de incubação nesta fase.
      6. Lavar três vezes mergulhando as lamelas em solução de Triton X-100 0,1% em PBS.
      7. Monte as lamelas de ponta-cabeça em 10 µ l montagem mídia queda (por exemplo, Vectashield) colocada sobre uma lâmina de microscópio. Deixe os slides no escuro à temperatura ambiente durante a noite para o endurecimento de médio de montagem. Depois, loja a 4 ° C, no escuro, indefinidamente.
   2. Obter imagens de microscopia confocal de mudanças estruturais que ocorrem na borda frontal migrando ou epifluorescência.
      Nota: Estudos topológicos podem ser executados por fotos da frente migrando para a interior monocamada de ladrilho. Semi-quantitativa de estudos são possíveis pela análise de software baseado em intensidades de fluorescência local.

Resultados

Ensaio de zero ferida artificial para estudos quantitativos: avaliação fator de crescimento epidérmico (EGF) promoção da migração:

EGF é um conhecido indutor de proliferação de células epiteliais e migração e, portanto, um controle positivo para quantificar a promoção de migração. Monocamadas de células Mv1Lu e HaCaT foram utilizadas em ensaios de zero a ferida e pré-tratamento fotos foram obtidas. Após a inocul...

Discussão

Em cima da pele ou mucosa interrupção, função de barreira é restaurada pelas ações de numerosos tipos de células, incluindo fibroblastos ou células epiteliais e imunes. Em conjunto, estas células passam por um complexo processo envolvendo a apoptose, proliferação, diferenciação e importante, fibroblastos e epiteliais células migração, que é o derradeiro mecanismo responsável pela restauração do tecido interrompida e o encerramento do fosso epitelial superficial^1,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Optional 10 % FBS supplement
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E	Use at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Dilute as appropriate
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Dilute to 1x
24-well culture plates	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Used 10 ng/mL
Round cover glass	MENZEL-GLÄSER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743	Martor (through VWR)	MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscope	Motic Spain	Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscope	ZEISS Microimaging, Germany	LSM 510 META
10 cm Culture dish	BD FALCON	353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488	Invitrogen	A11008	Used 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	Used 1:100
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Skim milk	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Release 1.50i
Zen LSM 510 image processing software	ZEISS Microimaging, Germany	Release 5.0 SP 1.1