Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Resumo

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Resumo

Como uma promissora plataforma de edição do genoma, o sistema CRISPR/Cas9 tem um grande potencial para manipulação genética eficiente, especialmente para a integração específica de transgenes. No entanto, devido a baixa eficiência de recombinação homóloga (HR) e várias mutações indel de fim não-homóloga ingressar (NHEJ)-com base em estratégias em células não-divisão, na vivo genoma edição permanece um grande desafio. Aqui, descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado sistema CRISPR/Cas9 para integração eficiente na vivo precisos alvo. Neste sistema, o alvo do genoma e o doador vector contendo armas de homologia (~ 800 bp) ladeado por alvo de RNA (sgRNA) único guia sequências são clivadas por CRISPR/Cas9. Esta estratégia baseada em HMEJ alcança a integração do transgene eficiente em zigotos de rato, bem como em hepatócitos na vivo. Além disso, uma estratégia baseada em HMEJ oferece uma abordagem eficiente para correção de fumarylacetoacetate hidrolase (Fah) mutação nos hepatócitos e resgata Fah-deficiência induzida ratos de insuficiência hepática. Tomados em conjunto, focalizando direcionados a integração, esta estratégia baseada em HMEJ fornece uma ferramenta promissora para uma variedade de aplicações, incluindo a geração de modelos de animais geneticamente modificados e terapias do gene alvo.

Introdução

Edição de genoma preciso, alvo é muitas vezes necessária para a produção de modelos de animais geneticamente modificados e terapias clínicas. Muito esforço foi feito para desenvolver várias estratégias para eficiente genoma alvo de edição, tais como nuclease dedo de zinco (ZFN), nucleases efetoras como ativador de transcrição (TALENs) e CRISPR/Cas9 sistemas. Estas estratégias criar quebras de dobro-costa de DNA alvo (DSB) no genoma e tirar proveito dos sistemas de reparo de DNA intrínsecos, como recombinação homóloga (HR)^1,2, microhomology-mediada final juntar-se (MMEJ)^{3 , 4 , 5}e não-homólogas final juntando (NHEJ)^6,7,8 , para induzir a integração específica de transgenes^1,9. A estratégia baseada no HR é atualmente o mais usado do genoma edição de abordagem, que é muito eficiente em linhas celulares, mas não é facilmente acessível de células não-dividindo devido a sua ocorrência restrita na fase tardia do S/G2. Assim, a estratégia baseada no HR não é aplicável para na vivo edição do genoma. Recentemente, a estratégia baseada em NHEJ foi desenvolvida para gene eficiente bata no rato tecidos⁸. No entanto, o método baseado em NHEJ geralmente introduz puntuais nos cruzamentos, tornando difícil gerar edição genoma preciso, especialmente quando tentando construir em-frame fusão de genes⁸. Alvo de integração baseada em MMEJ é capaz de genoma preciso de edição. No entanto, apenas moderadamente aumenta a eficiência de integração orientada em anteriores relatórios⁵. Por conseguinte, melhorando a eficiência da integração alvo precisos na vivo é urgentemente necessária para aplicações terapêuticas amplo³.

Em um trabalho recentemente publicado, demonstrámos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-com base em estratégia, que mostrou a mais alta eficiência de integração orientada em tudo relatado estratégias ambos in vitro e in vivode¹⁰. Aqui, descrevemos um protocolo para o estabelecimento do sistema de HMEJ, e também a construção de vetores de RNA (sgRNA) o single-guia como alvo o gene de interesse e o doador vetores abrigar sites de destino sgRNA e ~ 800 bp de braços de homologia (Figura 1) . Este protocolo, também descrevemos as etapas detalhadas para geração de DNA bater-em ratos e breves etapas de integração alvo em tecidos na vivo. Além disso, um estudo de prova de conceito da estratégia baseada em HMEJ demonstrou sua capacidade de corrigir a mutação Fah e resgatar Fah^{- / -} fígado falha ratos, que revelou ainda mais o seu potencial terapêutico.

Protocolo

Todos os procedimentos, incluindo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de ética biomédica pesquisas nos institutos Shanghai para ciências biológicas (CAS).

1. projeto de plasmídeos de doador

1. Seleção de sgRNA
   1. Use ferramentas de design on-line CRISPR para prever sgRNAs sobre o destino região^{11,12,13,14,15}. Para o locus Cdx2 , design seis sgRNAs diferentes (Cdx2-sgRNA1 ~Cdx2-sgRNA6) em torno da paragem códon com maior potencial de rank e inferior fora-alvos (Figura 1A)¹⁶.
   2. Linearizar 2 µ g de vetores de expressão Cas9-CMV-EGFP e sgRNA por digestão BbsI (1 µ l de BbsI por 2 h a 37 ° C, a uma concentração final de 1 U / µ l em um volume de 20 µ l). Em seguida, purifica o produto pelo kit de purificação de gel com um gel de agarose 1% em tampão TAE 1 ×.
   3. Mistura um par de oligonucleotídeos de sgRNA em 10 µ l de 1 × T4 DNA ligase buffer uma concentração final de 50 µM. Incubar a solução de oligo usando um gradiente de temperatura de 95 ° C e 25 ° C com uma taxa de alteração de temperatura de 5 ° C/5 min (95 ° C por 5 min em seguida, 90 ° C por 5 min, 85 ° C por 5 min, etc.), que será recoze o oligos.
   4. Mix 4 µ l de recozido produto, 2 µ l do vetor tornado linear com 1 μL de T4 DNA ligase em 10 µ l de 1 × T4 DNA ligase do buffer de e em seguida ligate a 22 ° C, durante 1-2 h (Figura 1B).
2. Ensaio de nuclease Surveyor de sgRNA
   Nota: A eficiência de direcionamento do sgRNA usado para o experimento de bater-no é avaliada por ensaio de nuclease surveyor (também conhecido como T7 endonuclease (T7EI) ensaio)¹⁷. Selecione o sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e uma baixa distância entre o local de corte de sgRNA e o códon de parada.
   1. Transfect vetores de expressão Cas9-sgRNA-EGFP em linhas de células N2a cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 1% PSG e 1% não-essenciais aminoácidos pelo transfection kit (veja a Tabela de materiais). Incube a 37 ° C em 5% CO₂células transfectadas.
   2. Após 48 h de incubação, coletar 5.000 células transfectadas (GFP⁺) por fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação usando células não transfectadas como um controle.
   3. Digerir as células coletadas em 2-5 µ l oflysis buffer (0,1% Triton X-100, 0.1% Tween 20 e 100 µ g/mL Proteinase K) a 56 ° C por 30 min, e em seguida o calor inativar proteinase K a 95 ° C por 10 min.
   4. Amplifica a amostra por PCR aninhado (tabela 1) usando o protocolo do fabricante. O tamanho dos produtos PCR é definido a 300-500 bp.
      1. Misturar 1 µ l de produto de Lise com DNA polimerase e um par de primers exteriores, reconhecendo a sequência ao redor do local de destino de sgRNA (0,1 µM, concentração final) (tabela 1) e realizar o PCR primária em um volume de 20 µ l.
      2. Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR primária para 30 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 24 s (1min/1 kb), com uma extensão final a 72 ° C por 5 min.
      3. Realize o PCR secundária usando 1 µ l de produto PCR primário e um par de primers internas aninhadas.
   5. Desnaturar e re-recoze 300-600 ng do produto PCR purificado em 20 µ l de 1 × T7EI amortecedor da reação (50mm NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH de 1 mM DTT 7,9) usando um gradiente de temperatura de 95 ° C a 25 ° C com uma taxa de 5 ° C/5 min.
   6. Adicione 1 µ l da enzima T7EI para os produtos PCR recozidos e digerir a 37 ° C por 2 h. Em seguida, execute o produto da digestão em gel de agarose 2% em tampão TAE de 1 × 120 V por 40 min, até que os fragmentos são separados (veja a Tabela de materiais).
   7. Use o ImageJ para determinar as intensidades de banda de corte e DNA sem cortes. Calcule a frequência de indel usando os métodos como anteriormente relatado⁹ (Figura 1C).
3. Construção do vetor de doador
   Nota: Para gerar vetores de doador HMEJ do gene Cdx2 , construir um doador de DNA (bp bp HAL-p2A-mCherry-800 800 HAR) ladeado com 23 nt Cdx2-sgRNAs segmentação sequência em ambas as extremidades (Figura 1D e 1 FiguraE). O PAM da sequência alvo era adjacente à extremidade do braço homóloga. Recomenda-se o assembly de Gibson para doador HMEJ clonagem.
   1. Amplificar o braço de homologia esquerdo bp 800 (HAL) com o avançar da primeira demão-1F (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de vetor, 23 nt Cdx2-sgRNA sequência de direcionamento e cerca de 20 nt sequência de HAL) e inverter a primeira demão-1R (que contém a sequência de sobreposição de bp de 15-20 de p2A-mCherry e cerca de 20 sequência de nt de HAL) na concentração final de 0,1 µM usando DNA genômico de rato em 200 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).
   2. Amplificar o fragmento de inserção p2A-mCherry com o avançar da primeira demão-2F (contendo a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de HAL e cerca de 20 nt sequência de fragmento de inserção) e inverter (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de HAR e cerca de 20 nt sequência da primeira demão-2R o fragmento de inserção) na concentração de final 0.1 µM usando genômica DNA ou plasmídeo com sequências de repórter em 100 ng / µ l ou 30 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).
   3. Amplificar o braço de certa homologia bp 800 (HAR) com o avançar da primeira demão-3F (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de vetor, 23 nt Cdx2-sgRNA sequência de direcionamento e cerca de 20 nt sequência de HAR) e inverter a primeira demão-3R (que contém a sequência de sobreposição de nt de 15-20 de p2A-mCherry e cerca de 20 sequência de nt de HAR) na concentração final de 0,1 µM usando DNA genômico de rato em 200 ng / µ l (Figura 1D, tabela 1).
   4. Executar todos os produtos PCR em gel de agarose a 1% em tampão TAE 1 × e purificar os produtos PCR de tamanho esperado pelo kit de extração do gel, de acordo com as instruções do fabricante (tabela 1).
   5. Digeri a 50-100 ng de um vetor de construção com KpnI e XbaI. Misture 2 µ l do vetor tornado linear em 30-40 ng / µ l, com três PCR amplificados fragmentos (1 µ l de cada um, 100-200 ng / µ l) na 2 x mistura de Gibson. Adicione H₂O para ajustar o volume final de 10 µL.Incubate a mistura a 50 ° C por 60 min.
   6. Competentes de Escherichia coli de transformar células com todo o produto montado e extrair o plasmídeo constrói pelo kit de extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o doador HMEJ por sequenciamento de DNA.

2. genoma edição em embriões de rato usando o método baseado em HMEJ

1. Produção de mRNA Cas9
   1. Para a preparação de mRNA Cas9, adicione a sequência de promotor T7 para o Cas9 região de codificação por amplificação por PCR usando o par de primer apropriado listado na tabela 1. Adicionar o primer Cas9 F/R em uma concentração final de 0,1 µM e 20 ng de Cas9 expressando o vetor para 1 × alta fidelidade mistura de DNA polimerase. Ajustar o volume final de 50 µ l com H₂O.
   2. Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR para 36 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 68 ° C por 4 min (1min/1 kb), com uma extensão final a 68 ° C por 10 min.
   3. Purificar o produto do PCR T7-Cas9 em vitro transcrição (IVT) e em seguida transcrever 0.5-1 µ g de DNA pelo kit de transcrição do mRNA em 37 ° C, durante 8 h em um volume total de 20 µ l, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).
   4. Adicione 1 µ l de DNase à mistura para remover o molde do ADN a 37 ° C durante 15 min. adicionar uma cauda poli-A por 45 min a 37 ° C e recuperar o mRNA Cas9 pelo kit de purificação de RNA, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).
2. Produção de sgRNA
   1. Gere o modelo de sgRNA, impulsionado por um promotor T7 com alta fidelidade DNA polimerase, como acima. Escolha um andaime de sgRNA contendo o vetor como o modelo. Os primers utilizados são listados na tabela 1.
   2. Purificar o produto do PCR T7-sgRNA e use 0.5-1 µ g de DNA como o modelo para a transcrição em vitro de sgRNA usando um kit de transcrição do RNA curto a 37 ° C por 6 horas em um volume total de 20 µ l, de acordo com as instruções do fabricante (ver tabela de materiais de < / c11 >).
   3. Adicione 1 µ l de DNase à mistura e continue a incubação a 37 ° C por 15 min remover o modelo de DNA. Purificar o sgRNAs pelo kit de purificação de RNA, como acima (ver Tabela de materiais).
   4. Diluir o sgRNA a 500 ng / µ l em água livre de RNase e armazenar as amostras em −80 ° C por até 3 meses.
      Nota: Ribonucleoproteínas CRISPR (RNPs) são uma substituição alternativa com uma melhor eficiência de^19,corte^18,20.
3. Cultura de coleção, microinjeção e in vitro de embriões
   1. Superovulate B6D2F1 (C57BL/6 × DBA2J) ratos fêmeas (7-8 semanas de idade) por gonadotropina de soro de égua grávida (PMSG), seguidos de gonadotrofina coriônica humana (hCG) 48 h mais tarde. Após a injeção de hCG, fêmeas de casa com machos de B6D2F1 durante a noite.
   2. Sacrifica as fêmeas por CO₂ anestesia, 24h após a injeção de hCG. Recolha os embriões fertilizados de seus ovidutos (com 30-50 embriões para cada fêmea) médio/M2.
   3. Lugar os embriões fertilizados (cerca de 300 ovos por injeção de um dia) em meio KSOM (5,55 g/L de NaCl, KCl, 0,05 g/L KH₂PO₄, 0,05 g/L MgSO₄•7H₂O, 0,04 g/L de glicose, 1,12 g/L de sódio de 0,19 g/L de lactato, 2,1 g/L NaHCO₃ , piruvato de sódio 0,02 g/L, 0,25 g/L CaCl₂•2H₂O, 0,004 g/L EDTA, 0,146 g/L, L-glutamina e albumina de soro bovino de 1 g/L) a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO₂.
   4. MRNA Cas9 Mix (100 ng / µ l), sgRNA (50 ng / µ l), doador HMEJ vector (100 ng / µ l) e adicionar o H₂O para ajustar o volume final de 10 µ l. Coloque a mistura no gelo.
   5. Puxe capilares agulhas (diâmetro exterior de 1,0 mm, diâmetro interno 0,78 mm com filamento) usando um extrator de micropipeta (parâmetros: calor, 74; puxar, 60; velocidade, 80; retardo, 200, pressão, 300. Consulte tabela de materiais). Agulhas comerciais seria uma substituição alternativa para o microinjection.
   6. Injetar um provável volume da mistura no citoplasma de zigotos com pró-núcleos bem definidos em uma gota de meio de HEPES-CZB contendo 5 µ g/mL citocalasina B usando um microinjector com constante fluxo de configurações(Figura 2)(ver Tabela de materiais)²¹.
      Nota: Cada grupo de zigotos deve ser injectado dentro de 20-30 min. Cytochalasin B poderia aumentar a viabilidade do zigoto rato após a injeção. Alternativamente, microinjeção pode ser operada com o sistema de piezo, conforme descrito anteriormente,²².
   7. Cultura de zigotos injetados no meio KSOM a 37 ° C, menos de 5% de CO₂ até o blastocisto estágio após 3,5 dias para observação da fluorescência (figuras 2B e 2C).
4. Transferência de embriões e a geração de ratos
   1. Meu estral ratos fêmeas do ICR com vasectomizado camundongos machos do ICR no mesmo dia como injeção.
   2. Cultura de zigotos injetados na fase 2-célula a 37 ° C sob 5% CO₂e a transferência de 25-30 2-célula de embriões em ovidutos das pseudopregnant fêmeas ICR em 0,5 dia post coitum (dpc). Mães de destinatários entregam filhotes na dpc 19,5.
5. Genotipagem de mouse
   1. Extrair DNA genômico de rato do dedo do pé ou cauda amostras usando um kit de extração de DNA, de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais).
   2. Identifica a junção de 5' e 3' do TOC-em eventos usando 200-400 ng de DNA genômico, medido por espectrometria de UV/vis, como um modelo para realizar o PCR amplification.
      1. Ativar o DNA polimerase a 95 ° C por 5 min e realizar o PCR para 38 ciclos a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C, durante 1 minuto (1 min/1 kb), com uma extensão final a 72 ° C por 10 min. Para 5' junção, use o primer para a frente na jusante do HAL, com o reverso no TOC-no fragmento (p2A-mCherry). Quanto à 3' junção, use o primer para a frente no TOC-no fragmento (p2A-mCherry), com o reverso na jusante do HAR (tabela 1).
   3. Execute 6 µ l do produto de PCR em gel de agarose 1% 1 × TAE buffer e verifique o tamanho do fragmento esperado. Em seguida, verificá-los por (Figura 2D) de sequenciamento de DNA.

3. HMEJ-baseado no Vivo genoma edição em hepatócitos

1. Coloque destinatário C57BL/6J rato (8 semanas) em um dispositivo de restrição e coloque a cauda através da fenda.
2. Misture vetores de doador HMEJ (30 µ g) e vetores de expressão spCas9 (30 µ g) em 2 mL de solução salina. Para o experimento de controle, suspenda vetores de doador HMEJ (30 µ g) em 2 mL de solução salina(Figura 3).
3. Limpe o rabo de rato com etanol a 70%. Inserir a agulha na cauda da veia e injetar a solução de DNA de plasmídeo dentro de 5-7 s. Retire a agulha e solte o mouse do dispositivo de restrição.
4. Sacrificar os ratos pelo CO₂ anestesia depois de 5-9 dias após a injeção. Perfundir o transcardially de ratos com soro fisiológico a 0,9%, seguido por paraformaldeído 4%, utilizando uma bomba peristáltica e corrigir o fígado durante a noite a 4 ° C.
5. Desidrate o tecido usando 30% de sacarose durante a noite, até que ele afunda até o fundo do tubo.
6. Secção do tecido congelado em uma espessura de 10 µm para amostras de fígado.
7. Enxagúe as seções três vezes em tampão fosfato 0,1 M (PB) e incube-os com anticorpo primário: Rabbit anti-mCherry (diluído em 5% NGS) durante a noite a 4 ° C.
8. Lave as seções três vezes no PB e incube-os então com anticorpo secundário: Cy3-AffiniPure cabra anti-coelho IgG para 2 h à temperatura ambiente em um agitador orbital.
9. Counterstain as seções com DAPI por 20 min e montagem com glicerina em lâminas de vidro para observação de fluorescência posterior (Figura 3B).

Resultados

Edição de genoma HMEJ-baseado em embriões do rato: Para definir a eficiência de bater-do método baseado em HMEJ de zigotos de rato, nós entregamos Cas9 mRNA, sgRNA, tendo como alvo o gene Cdx2 e o doador HMEJ em zigotos de rato, que foi projetado para fundir um gene repórter de p2A-mCherry para o último códon do Cdx2 gene(Figura 2). Os zigotos injetados desenvolveram em blastocistos na cultura. Para...

Discussão

Os passos mais críticos na construção de plasmídeos de doador HMEJ são: (1) seleção da sgRNA com alta eficiência de clivagem de DNA e baixa distância entre local de corte de sgRNA e stop códon e (2) a boa construção de doador HMEJ. Clivagem CRISPR/Cas9-mediada em ambos vetor de doador do transgene (contendo sites de destino sgRNA e braços de homologia ~ 800 bp) e genoma alvo é necessária para a integração de alvo eficiente e precisa in vivo. Os passos mais importantes da geração de batida-em r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pX330	Addgene	42230
pAAV vector	Addgene	37083
pX260	Addgene	42229
AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40	Addgene	97307	AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter
AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA	Addgene	97308	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone.
AAV_Cdx2 HMEJ donor	Addgene	97319	HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2.
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Life Technology	L3000015
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9930
Bbs I	New England Biolabs	R0539S
NEB Buffer 2	New England Biolabs	B7002S
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621L
Plasmid EndoFree-Midi Kit	Qiagen	12143
MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA	Life Technologies	AM1345
MEGACLEAR KIT 20 RXNS	Life Technologies	AM1908
MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS	Life Technologies	AM1354
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97	Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300)
Borosilicate glass	Sutter Instrument	B100-78-10	type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament)
FemtoJet microinjector	Eppendorf
Freezing microtome	Leica	CM1950-Cryostat	thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver
Rabbit anti-mCherry	GeneTex
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Gibco	10099141
NEAA	Gibco	11140050
Pen,Strep,Glutamine	Gibco	10378016
Gel Extraction Kit	Omega	D2500-02
FACS	BD AriaII
PMSG	Ningbo Sansheng Medicine	S141004
HCG	Ningbo Sansheng Medicine	B141002
Cytochalasin B	Sigma	CAT#C6762
KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red	Millipore	CAT#MR-106-D
M2 Medium with Phenol Red	Millipore	CAT#MR-015-D
Mineral oil	Sigma