Identificação de OTX1 e OTX2 como duas possíveis marcadores moleculares para Carcinomas Nasossinusal e Neuroblastomas olfativas

Resumo

Genes homeobox são genes regulatórios, frequentemente associados com tumores nos organismos adultos. Nós investigamos sua expressão comparativa por imuno-histoquímica e análise PCR em tempo real, na mucosa nasal normal e inflamatória e em neoplasias Nasossinusal para utilizá-los como possíveis alvos de diagnósticos e terapêuticos.

Resumo

Genes homeobox (HB) de OTX são expressos durante a morfogênese embrionária e durante o desenvolvimento do epitélio olfatório em organismos adultos. Mutações ocorrem nestes genes estão muitas vezes relacionadas a tumorigênese em humanos. Não existem dados hoje sobre a possível correlação entre genes OTX e tumores da cavidade nasal. O objetivo deste trabalho é entender se OTX1 e OTX2 podem ser considerado como marcadores moleculares no desenvolvimento de tumores nasais. Nós selecionamos adenocarcinomas nasais e Nasossinusal para investigar a expressão dos genes OTX1 e OTX2 através de imuno-histoquímica e análises PCR em tempo real. Tanto OTX1 como OTX2 estavam ausentes em todas as amostras de Nasossinusal Adenocarcinomas Intestinal-tipo (ITACs). OTX1 mRNA foi identificado apenas em Non-Intestinal tipo Adenocarcinomas (NITACs), enquanto OTX2 mRNA foi expressa somente em Neuroblastomas olfativo (ONs). Nós demonstramos que a expressão diferencial do gene para ambos OTX1 e OTX2 genes pode ser um útil marcador molecular para distinguir os diferentes tipos de tumores Nasossinusal.

Introdução

OTX HB genes são o vertebrados homólogo dos genes orthodenticle da drosófila (otd) e eles codificam para fatores de transcrição que normalmente são expressos durante a morfogénese embrionária, mas eles também podem ser expressos no organismo adulto com diferentes funções . Durante o desenvolvimento embrionário, eles controlam a especificação de identidade celular, diferenciação celular e o posicionamento do axis¹ corpo. A família OTX inclui genes OTX1 e OTX2 , que exibem diferentes funções. OTX1 está envolvida no cérebro e desenvolvimento de órgãos sensoriais. No organismo adulto, que é expresso em órgãos sensoriais e é transcrito em níveis baixos no lobo anterior da hipófise²; também desempenha um papel na hematopoiese, sendo expressa em hematopoiéticas pluripotentes e de células progenitoras³. OTX2 está envolvida no desenvolvimento da cabeça rostral e seus atos de proteína traduzida como um morphogen porque ele gera um gradiente através do quais outros genes são ativados ou reprimidos de forma espaço-temporal, contribuindo assim para a célula proliferação e diferenciação. No organismo adulto, OTX2 é encontrado exclusivamente na glândula pineal e do plexo coroide⁴.

Mutações nos genes OTX estão muitas vezes relacionadas com o aparecimento de defeitos metabólicos, congênitos ou somáticos humanos. Ganho ou perda de mutações em genes OTX poderiam promover a tumorigênese, se eles não são capazes de controlar corretamente de crescimento e/ou diferenciação celular⁵. Em leucemias e linfomas, bem como em muitos tumores sólidos (por exemplo, Meduloblastomas⁶, agressivo linfomas não-Hodgkin², carcinomas de mama⁷, cancros colo-rectais⁸e retinoblastoma⁹), o desregulamentado expressão de genes de HB OTX é bem documentado¹⁰. Além disso, as mutações de OTX2 foram demonstradas em casos de anophthalmia e microphtalmia¹¹ , devido ao papel crucial para este gene no controle do desenvolvimento do olho.

No contexto de neoplasias sólidas, a descoberta de marcadores moleculares e fenotípicos é um desafio importante para o diagnóstico, classificação e tratamento de vários tipos de tumor¹¹, incluindo aqueles que se originam na cavidade nasal e seios paranasais seios paranasais. Na verdade, apesar de que estas áreas ocupam apenas um modesto espaço anatômico, epitélio da mucosa, glândulas, tecidos moles, osso, cartilagem ou neural/neuroectodérmico, e hematolymphoid as células podem ser frequentemente o local para a origem do complexo e histologicamente diferentes grupos de tumores. Diferentes tipos de neoplasias envolvendo o trato Nasossinusal apresentam uma variedade de características que superar o que geralmente é visto no tracto aerodigestive superior ou mesmo durante a maioria das partes do corpo¹². Neoplasias malignas Nasossinusal são raras e apresentam uma incidência anual de 1: 100.000 habitantes em todo o mundo, e então isso impede que estudos sobre as vias envolvidas na tumorigênese e à análise das estratégias de tratamento alternativo. Apesar disso, os avanços em imagens técnicas, as abordagens cirúrgicas e radioterapia têm melhorado o manejo clínico de câncer Nasossinusal. Além disso, o desenvolvimento de linhas de células, bem como modelos animais e perfis genéticos do câncer atualmente constituem a base para a futura terapias anticâncer alvo¹³. Até à data, não existem relatos sobre OTX1 e/ou OTX2 expressão em neoplasias da cavidade nasal, nasofaringe e seios paranasais. Já observamos anteriormente que OTX1 e OTX2 estão envolvidos no câncer de mama⁷, gostaríamos de saber se estes genes poderiam estar presentes não só na mucosa nasal normal, mas também em tumores da cavidade nasal. Para atingir este objetivo, que temos obtidos a partir do "Ospedale di Circolo" em amostras de Varese de mucosa normal e adenocarcinomas nasais e Nasossinusal coletados de 1985 para 2012 e classificados de acordo com a Organização Mundial de saúde (OMS), o departamento de patologia classificação dos tumores de pescoço e cabeça. Optamos por analisá-los através de análises em tempo real do PCR e imuno-histoquímica e avaliamos a expressão OTX1 e OTX2 para determinar se eles podem ser considerados marcadores moleculares para estes tipos de tumores.

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Protocolo

Todos os estudos foram realizados de acordo com a declaração de Helsínquia (1975) com o consentimento informado por escrito e aprovado pelo Comitê de ética da Universidade de Insubria Varese.

1. coleta das amostras

1. Coletar e dividir todas as amostras de Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) humano em diferentes subgrupos de acordo com a classificação do WHO de cabeça e pescoço tumores¹⁴.
   Nota: Aqui usamos as seguintes amostras: mucosa Nasossinusal Normal como controle (10 amostras); Papiloma invertido (PI, código ICD-O 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O código 8144 habitantes/3, 32 amostras); NITAC (ICD-O código 8140/3, 12 amostras); Carcinoma adenoide cístico (ACC, código ICD-O 8200/3); Adenoma pleomórfico (PA, código ICD-O 8941/3); (ICD-O código 9522/3, 13 amostras); Mal diferenciadas Carcinoma neuroendócrino (PDNEC, código ICD-O 8041/3, 19 amostras); Tumor neuroendócrino (NET, ICD-O código 8041/3).

2. imunoquímica

1. Deparaffinization e reidratação das seções
   1. Aqueça os slides de amostra em estufa a 60 ° C por 30 min e reidratar 3 µm espessura FFPE seções usando uma série de álcool à água.
   2. Brevemente, lavar as lâminas em xilol por 10 min e repita este passo; Lave os slides por 5 min em 100% de álcool e repita este passo usando álcool 95%, 85% e 75% em série. Enxágue as lâminas por 5 min em água destilada.
2. Bloqueando a atividade endógena
   1. Bloquear a atividade endógena, colocando os slides em 3% peróxido de hidrogênio aquoso por 12 min.
3. Recuperação do antígeno
   1. Execute a recuperação do antígeno, tratando com 10 mM de tampão citrato (pH 6) por 10 min em um tratamento de microondas.
4. Incubação com o anticorpo primário
   1. Lave as seções em tampão TBS (pH 7,4) e, em seguida, adicionar a solução de bloqueio por 10 min.
   2. Lave as seções em tampão TBS (pH 7,4) e, em seguida, adicione 0,2% Triton X.
   3. Incube durante uma noite a 4 ° C com cabra anti-humano OTX2 anticorpo diluído 1: 100.
5. Incubação com anticorpo secundário
   1. Incubar as seções por 1h à temperatura ambiente com biotinilado coelho anticorpo secundário de antidiluído cabra 1: 200 seguido pelo complexo ABC-peroxidase (ver Tabelas de materiais).
6. Desenvolvendo o immunoreaction
   1. Desenvolver o immunoreaction usando 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride e counterstain os núcleos com Harris Hematoxylin.
7. Montagem e imagem
   1. Desidratar as seções usando uma escala crescente de álcool e explicitá-los usando uma clareira a substância de origem de terpenos (ver Tabela de materiais). Incorporar as seções em meio de montagem, colocar as seções em um microscópio e observar as seções através de um microscópio óptico.

3. extração do RNA e transcrição reversa

1. Extração de RNA
   1. Extraia o RNA das seções, realizando a primeira etapa da imunoprecipitação (ver secção 2.1) e manter as lâminas em água destilada. Se sobrepõem as seções imaculadas com o correspondente hematoxilina-eosina manchado seções para identificar fragmentos de interesse.
   2. Realize a extração do RNA usando um kit de extração de RNA comercial para amostras FFPE (ver Tabela de materiais) e seguir indicações do fabricante.
2. Reversa de RNA-transcrição
   1. Usar um kit comercial retrô-transcrever RNA em cDNA (ver Tabela de materiais) seguindo o protocolo. Retrô-transcrever pelo menos 1.000 ng do RNA total para realizar diversas análises.

4. em tempo real do PCR e análise de dados

1. PCR em tempo real
   1. Realizar análises quantitativas de PCR em tempo real (qRT-PCR) com tecnologia baseada em investigação (ver Tabela de materiais) e um termociclador.
2. Preparação da mistura de reação de PCR
   1. Prepare a mistura de reação de PCR usando 12,5 µ l do mix de mestre baseada em investigação, µ l 1,25 cada de OTX1, OTX2 e ACTB sondas (ver Tabela de materiais), 50 ng de cDNA e livre de nuclease até 25 µ l de volume total de água.
   2. Execute todas as reações em triplicata, utilizando o gene ACTB como o controle endógeno para normalizar os níveis de expressão do gene.
   3. Centrifugar a placa a 1.109 x g por 3 min e armazenar a placa protegida da luz a 4 ° C até o experimento.
3. Definindo o termociclador
   1. Conjunto o perfil do termociclador com um começo quente inicial do ciclo a 50 ° C por 2 min e 95 ° C por 10 min, seguido por 40 ciclos a 95 ° C por 15 s e um ciclo final de 60 ° C por 1 min.
4. Análises nível de expressão do gene
   1. Normalize os níveis de expressão do gene através do método de ciclo comparativo limiar (ΔCt) usando o gene ACTB como o controle endógeno.
   2. Avaliar os níveis de expressão de gene usando o método 2^-ΔCt e plotar os resultados.
5. Análises estatísticas
   1. Realizar análises estatísticas usando o Student t-teste, considerando resultados estatisticamente significativos com p < 0,05.

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Resultados

Na mucosa normal observamos reatividade nuclear forte e homogênea para genes OTX no epitélio de tipo respiratório pseudoestratificado ciliado e nas células glandulares submucosas (figura 1A). Encontramos uma expressão nuclear para OTX1 em todas NITACs as amostras (figura 1B), enquanto pouco ou ausente imunorreatividade destacou-se em ITACs (Figura 1). Imunorreatividade intensa esteve presente em...

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Discussão

Este estudo mostra pela primeira vez que, com base nos níveis de RNAm, os genes HB OTX1 e OTX2 são expressas em mucosa Nasossinusal normal e glândulas submucosas, pólipos inflamatórios, Nasossinusal Schneiderian papilomas e em diferentes epiteliais e Neuroectodérmicos Neoplasias, incluindo carcinomas escamosos, tipo não-intestinal Nasossinusal adenocarcinomas, tumores de glândulas salivares-tipo, neoplasias neuroendócrinas e ONs.

Modificações e solução de problemas:

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799