Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Resumo

Descrevemos a evolução de um modelo tridimensional, esferoide-baseado em vitro que permite-nos testar o padrão atual de regimes de terapia experimental para cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas na linha de celular, com o objetivo de avaliar a terapia susceptibilidade e resistência em células primárias de espécimes humanos no futuro.

Resumo

Opções atuais do tratamento para avançados e recorrente de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) Coloque a radiação e quimioterapia-radiação abordagens com ou sem cirurgia. Enquanto esquemas de quimioterapia baseados em platina, atualmente, representam o padrão ouro em termos de eficácia e são dadas na grande maioria dos casos, novos regimes de quimioterapia, ou seja, imunoterapia estão surgindo. No entanto, as taxas de resposta e mecanismos de resistência de terapia para qualquer regime de quimioterapia são difíceis de prever e permanecem insuficientemente compreendida. Grandes variações dos mecanismos de resistência a quimioterapia e a radiação são conhecidas até à data. Este estudo descreve o desenvolvimento de um ensaio padronizado, elevado-throughput em vitro para avaliar a resposta da linha celular HNSCC para diferentes regimes de terapia e espero que em células primárias de pacientes individuais como futura ferramenta para tumor personalizado terapia. O ensaio é projetado para ser integrado o algoritmo padrão de controle de qualidade para pacientes com HNSCC em nosso centro de atendimento terciário; no entanto, este será o tema de estudos futuros. Viabilidade técnica parece promissor para as células primárias de biópsias de tumor de pacientes reais. Amostras são então transferidas para o laboratório. Biópsias são mecanicamente separadas seguido por digestão enzimática. Então, as células são cultivadas em frascos de cultura de células de ultra baixa adesão que promovem a formação reprodutível, padronizada e espontânea dos conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Esferoides então estão prontos para ser exposto a protocolos de quimioterapia-radiação e protocolos de imunoterapia conforme necessário. O tamanho de viabilidade e esferoide de final de célula são indicadores de susceptibilidade de terapia e, portanto, poderia elaborar-se em consideração no futuro para avaliar a resposta do provável terapia dos pacientes. Este modelo pode ser uma ferramenta valiosa, custo-eficiente para terapia personalizada para câncer de cabeça e pescoço.

Introdução

Cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (HNSCC) é o sexto mais comum de câncer em todo o mundo com uma incidência crescente de patogénese associada a infecção da mucosa papilomavírus humano (HPV), ao lado de uma maioria de casos causados por álcool e nicotina excessiva consumo de ^1,2. Enquanto tumores menores e estágios pre-invasoras são geralmente bem tratáveis com excisão cirúrgica, geralmente combinado com dissecação de linfonodo cervical, o tratamento para estado avançado e recorrente HNSCC permanece desafiador devido à invasão de tumor agressivo com disseminação metastática e resistência à radiação e quimioterapia protocolos^3,4,5,6,7,8. Estudos recentes sugerem uma alta variabilidade do fenótipo celular e caracterização sub circulantes e células tumorais disseminadas começou^9,10. A crença anterior de um tumor sólido, uniforme massa teve que ser revisto à luz dos recentes estudos nos últimos anos^11,12,13,14. As abordagens atuais para caracterização do tumor e identificação das principais mutações poderiam identificar vários genes que parecem estar associadas com resistência à terapia, mas permanecem uma abordagem de custo elevado. Além disso, conhecimento do genótipo não necessariamente permite uma previsão confiável do fenótipo e sua resposta de tratamento.

Tem havido alguns avanços na melhoria da sobrevivência global e livre de doença para doença estado avançado e recorrente. Nicotina - bem como carcinoma de vírus associado, opções atuais do tratamento além de cirurgia juntar radiação agressiva e esquemas de quimioterapia baseados em platina. Há implicações para as taxas de resposta diferente entre carcinoma de HPV-negativas e positiva; no entanto, isso ainda não conduzir a uma mudança em geral orientações de terapia. Resistência à radiação e a quimioterapia é um fenómeno frequente em todas as fases do tumor e existe para baseada em platina quimioterapia bem como quanto à terapia-alvo (Anti-EGFR; receptor de fator de crescimento epidérmico) e recentemente emergentes de inibição posto¹⁵. Quimioterapia e radioterapia ineficaz têm um custo elevado de morbidade paciente significativo em termos de disfagia, mucosite, boca seca e risco de diminuição da função renal ou cardíaca, entre outros. A decisão de um conceito geral de terapia para cada paciente individual prevendo antes da resposta terapêutica parece ser o objetivo crucial, impedindo os conceitos de tratamento desnecessário, efeitos colaterais e custos.

Procuramos estabelecer um modelo para testar a susceptibilidade de tratamento individual do paciente para o atual padrão quimioterapia radiação-que poderia ser integrada o algoritmo de tratamento oncológico regular e controle de qualidade de um ponto técnico permanente. A meta distante foi usar o modelo sem usar linhas de células fortemente alterado e envelhecido, como mal representam as células de tumor humano real sem sua variabilidade e a heterogeneidade como sabemos agora, enquanto o estabelecimento do protocolo foi feita em várias linhas de células. Para ser independente apenas a partir de linhagens celulares disponíveis comercialmente, recentemente com sucesso geramos uma linha de celular intermediário chamada "PiCa" de células HNSCC primárias de espécimes de tumor humano com marcadores celulares conservadas na suas superfície e limitadas de passagens ¹⁶. linha de celular essa PiCa deve servir como uma preparação para o desenvolvimento do modelo na estrada para depois mais tarde após testes com células cancerosas humanas frescas de biópsias de tumor. Tem sido demonstrado que as células em uma célula tridimensional culturas reagem de forma diferente e mais na vivo-como a administração de drogas de câncer do que aquelas crescendo em monocamadas^{17,18,19,20 ,21}, devido principalmente à conservação de migratórias e propriedades de sub diferenciação de certas células subconjuntos^22,23,24. Aqui, descrevemos o protocolo de um modelo tridimensional, baseado em esferoide de linhas de células intermediárias e maneiras as células primárias humanas carcinoma de células escamosas como integram e tal modelo em tratamento de câncer de cabeça e pescoço cirurgião e oncologista ( Figura 1).

Protocolo

Todos os estudos mostrados neste manuscrito, ou seja, a utilização de amostras de tumor humano, estão protegidos sob e em consentimento com decisões anteriores da Universidade de medicina de Mainz/Universidade da Comissão de ética médica de centro de Munique. Pacientes deram o consentimento informado, de acordo com as diretrizes legais nacionais concordando para uso científico de excesso de material biológico que foi obtido no decorrer de seu tratamento. Pesquisa foi realizada em conformidade com todas as orientações institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.

1. tendo uma biópsia de Tumor de cabeça e Carcinoma de células escamosas Heck

1. Executar geral (propofol e/ou sevoflurano, agente relaxante muscular) ou infiltração local (2% ultracaine, adrenalina) / (xilocaína) anestesia na sala de cirurgia ou Otorrinolaringologia cadeira exame de superfície. Visualize a massa tumoral em orais cavidade/faringe/laringe/outras partes do trato digestivo e respiratório superior com padrão instrumentos de funcionamento e, se necessário, sob o microscópio.
2. Leve uma biópsia do tumor fresco da periferia da lesão cancerosa com instrumentos de corte ou sem corte. Evite o centro da lesão devido a necrose abundante nesta área. Colocar o tecido obtido para um recipiente esterilizado com solução isotônica de cloreto de sódio.
3. Depois da biópsia, realizar hemostasia, conforme necessário, por exemplo., com um dispositivo de coagulação monopolar ou bipolar, além do uso de substâncias vasoconstritores.
4. Trazer a biópsia do tumor que se destina a ser usado para experimentos de cultura celular diretamente para o trato de laboratório adjacente. Envie outras biópsias do tumor para o patologista, como de costume para descartar câncer.
5. Certifique-se que um técnico de laboratório está pronto para processar a amostra diretamente.

2. processamento da amostra de Tumor

1. Coloque o espécime de tumor sobre uma superfície apropriada e estéril e corte cuidadosamente com um bisturi estéril de uso único em pedaços o mínimo possível.
   Atenção: Certifique-se que o status das doenças infecciosas transmitidas pelo sangue é bem documentado e o técnico está na atenção das instituições padrão protocolos para impedir a agulha vara ou lesão de corte com potencialmente material paciente de risco biológico e o protocolos a seguir depois de possíveis lesões.
2. Após a separação mecânica suficiente do tecido primário, coloque o tecido em um frasco contendo colagenase eu / II e incubar durante 1 h a 37 ° C. Através de um filtro de célula de Falcão µm 70 da peneira e lavar a suspensão com solução de sal balanceada de Hanks (HBSS).
3. Após a separação bem sucedida e posterior lavagem, colocar a suspensão contendo 1-2 × 10⁶ células em frascos de cultura de célula uma T75 (75 cm²) crescer para subconfluência a 5% de CO₂ e temperatura de 37 ° C. Esta etapa pode demorar até 10 dias.
   1. Use o meio de cultura especial queratinócito consistindo dos seguintes: 125 mL de Dulbecco modificada do meio eagles (DMEM), 250 mL do meio de queratinócitos complementado (médio complementado, consistindo de 500 mL do meio de SF queratinócito, 15 mg de pituitária bovina extrato (BPE), 2,5 mL de penicilina/estreptomicina 150 ng recombinante humano epiteliais fator de crescimento (EGF), 516 µ l de 300 mM CaCl₂, mistura de estoque para ser preparado com antecedência), 125 mL de mistura de nutrientes F12, 10 mg de BPE (0,75 mL), 75 ng de EGF humano recombinante (2 µ l) , 3,75 mL de 200 mM L-alanil-L-Glutamin-dipeptídeo (tabela de materiais).

3. propagação das células em placas de cultura de célula ultra baixa adesão

1. Confirme o crescimento de células de tumor sob um microscópio. Contar as células em cultura (primária ou cultura de células) e semente de 5.000 células do tumor primário ou 1.000-2.000 células de linhagem de células intermediárias / outra linha celular em 200-300 µ l de mídia (passo 3.2.) em uma placa de ultra baixa adesão com côncavo, rodada de fundos (96 poços).
2. Cultura de células em 5% CO₂ a 37 ° C e em partes iguais DMEM e vias aéreas médias de células epiteliais (BEGM), 10% de soro fetal bovino, 1% penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio 1%, 1% não aminoácidos essenciais, 1% L-glutamina (etapa 2.3.). Se linhas celulares estão sendo usadas, a mídia com base em DMEM é suficiente.
   1. Execute alterações de mídia todos os dias. Preste atenção para não aspirar o spheroid com pipeta durante as mudanças de mídia. Cultura de esferoides até o nível de crescimento como descibed 3.3 é alcançado (aproximadamente 7-10 dias).
3. Confirme a formação espontânea de esferoide sob o microscópio procurando por conglomerados de células tridimensionais, em forma de esferoide. Exclua os poços com irregular e/ou formação de esferoide múltiplas de maiores investigações.
   Nota: Esferoides devem ser visíveis a olho nu, também, facilitar a transformação e as mudanças de mídia como descrito abaixo.

4. expor esferoides de terapia Multimodal Tumor padrão ou Experimental

1. Escolha um regime de terapia desejada. Criar grupos de controle suficientemente grande que permitem comparações dos tratamentos de esferoides não tratadas ou esferoides recebendo apenas regimes de terapia parcial, por exemplo. radiação sozinha. O tamanho dos grupos de controle varia de acordo com o projeto do grupo experimental e não pode ser definido universalmente.
2. Troca a mídia a mídia com aditivos, significado media com chemotherapeutics e/ou anticorpos monoclonais em concentrações desejadas. Adicione cisplatina nas concentrações de 2,5/5/10 µM ou 5-fluoruracil (5FU) em 30 µM.
   Nota: Para experimentos de alta taxa de transferência ou grande grupo tamanhos/elevado número de grupos, pode-se usar um robô automatizado de pipetagem como estabelecemos ainda mais nas experiências.
3. Alternativamente, irradie as placas de cultura de células com esferoides em 2 Gy usando um recurso de radiação apropriado.
   Atenção: Respeite os protocolos da instituição em matéria de prevenção da exposição de radiação nociva dos empregados. Trabalhar apenas com técnicos treinados e designados de acordo com as diretrizes de proteção de radiação. Se desejar, adicione chemotherapeutics conforme descrito em 4.2. Depois disso.
4. Incube as celulas por 24 h em condições de cultura descrito anteriormente (37 ° C, passo 3.2).
5. Após a incubação, continue a cultura de pilha pelo menos 6 dias com alterações de mídia todos os dias.

5. avaliação do tamanho do Spheroid e extensão da proliferação celular para ensaio de leitura

1. Medir o tamanho de esferoide em termos de área após documentação de foto digital no dia 6 (dia 10, dia 16) com um software gráfico (parâmetro 1).
2. Após a centrifugação a 520 x g, durante 2,5 min da placa, remova o sobrenadante. Lave as células com quantidade suficiente de 1X PBS e centrifugar que a placa novamente conforme descrito, seguida de remoção do sobrenadante (PBS).
3. Adicione 100 µ l de solução de desprendimento de células enzimático a cada frasco para permitir que os esferoides dissolver. Incubar a placa por 8 min a 37 ° C.
4. Seleção para dissolver bem sucedida do spheroid sob o microscópio. Adicione 100 µ l de DMEM. Centrifugue a placa a 520 x g durante 2,5 min. remover o sobrenadante e suspender as células em 100 µ l de DMEM.
5. Realize um ensaio de proliferação colorimétrico comercialmente disponível, em exemplo WST-8 ensaio em cada frasco de acordo com instruções^{25 as indicações do fabricante}. Ler o ensaio em um leitor de ensaio (ELISA) enzima-lig da imunoabsorção (parâmetro 2).

Resultados

Fomos capazes de gerar reproducibly esferoides de suspensões de célula única, primeiro a partir de linhas de células diferentes, incluindo a linha de celular proprietária da PiCa, depois a partir de células de câncer humano primário derivado de biópsias de tumor fresco conforme descrito em Hagemann et al . ²⁶. foram avaliados dois métodos estabelecidos para a geração de esferoide; os dois sendo o so-called enforcamento cair (HD) método e o mé...

Discussão

Fomos capazes de estabelecer um protocolo para gerar esferoides reprodutíveis de suspensões celulares, para ambas as linhas de célula e, em experimentos preliminares, as células do tumor primário humano. Nós primeiro avaliados dois métodos anteriormente descritos e identificado o ULA-método, um método onde as placas de cultura com ultra baixa aderência são utilizadas, para ser a mais segura e confiável para a geração de esferoides tridimensionais uniformes. Combinando dois métodos distintos para a leitura ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350