Fluorescência de célula única resolução vivo Imaging de Drosophila relógios circadianos em cultura cérebro Larval

Resumo

O objetivo do presente protocolo é estabelecer ex vivo da drosófila cultura larval cérebro otimizada para monitorar circadianos ritmos moleculares com imagem de lapso de tempo a longo prazo da fluorescência. A aplicação deste método de ensaios farmacológicos também é discutida.

Resumo

O circuito de marcapasso circadian orquestra rítmicas saídas comportamentais e fisiológicas coordenadas com dicas ambientais, tais como ciclos de dia/noite. O relógio molecular dentro de cada neurônio de marcapasso gera ritmos circadianos na expressão gênica, subjacentes as rítmicas neuronais funções essenciais para o funcionamento do circuito. Investigação das propriedades dos osciladores moleculares individuais em diferentes subclasses de neurônios de marcapasso e sua interação com a sinalização neuronal resulta em um melhor entendimento do circuito circadian pacemaker. Aqui, apresentamos uma abordagem de lapso de tempo microscopia fluorescente desenvolvida para monitorar a mecânica molecular nos neurônios do relógio do culto cérebro larval de Drosophila . Este método permite a gravação de multi-dia de ritmos de repórteres circadianos fluorescentes geneticamente codificados em resolução de célula única. Esta configuração pode ser combinada com manipulações farmacológicas para analisar atentamente uma resposta em tempo real do relógio molecular para vários compostos. Além dos ritmos circadianos, esse método multiuso em combinação com poderosas técnicas de genética de Drosophila oferece a possibilidade de estudar diversos processos neuronais ou moleculares no tecido cerebral ao vivo.

Introdução

Pulsos de disparo circadianos ajudam os organismos para se adaptar às mudanças ambientais periódicas geradas pela rotação da Terra 24 h. Os loops de feedback transcriptional-translacional entrecruzado comumente fundamentam a maquinaria molecular de relógios circadianos em espécie¹. O circuito de marcapasso circadian composto de relógio contendo neurônios integra informações de tempo do dia, transmitidas pelas pistas ambientais, tais como ciclos de temperatura, para orquestrar os ritmos de uma infinidade de diários e claro/escuro (LD) fisiológica e processos comportamentais^2,3. A coordenação de ritmos moleculares com neuronais entradas e saídas é criticamente importante para o funcionamento do circuito circadian mas permanece apenas parcialmente compreendido.

Em Drosophila, o cerne do relógio molecular, o heterodímero/ciclo de relógio (CLK/CYC) ativa a transcrição do período (por) e atemporal (tim). PER e TIM formam um complexo e entram no núcleo, onde eles inibem a atividade transcricional de CLK/CYC e, consequentemente, sua própria transcrição. Regulamentos pós-transcricional e borne-translational causam atrasos entre transcrição CLK/CYC-mediada e repressão por PER / TIM, garantindo a geração de cerca de 24-h oscilações moleculares^1,3,4 . Cerca de 150 neurônios contendo estes pulsos de disparo molecular forma um circuito de controle circadiano comportamento de adulto voa⁵. Um muito mais simples, mas totalmente funciona circadian circuito constituído por 3 grupos de neurônios do relógio - 5 neurônios Lateral ventral (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo e um negativo PDF LNv, veja abaixo), 2 Dorsal neurônio 1s (DN1s) e 2 Dorsal neurônio 2s (DN2s) - está presente em larval cérebro de^6,7.

O simples circuito circadian larval oferece um excelente modelo para estudar as interações entre comunicação inter neuronal e o relógio molecular. Usando nosso repórter fluorescente recentemente desenvolvido por-TDT, que imita os níveis de por proteínas e sua localização subcellular, procurámos caracterizar a dinâmica da mecânica molecular em subgrupos de neurônio relógio diferente no circuito circadian larval ⁸. Além disso, sabendo que o papel fundamental do fator de dispersão de pigmento de neuropeptide (PDF) produzido pelo 4 LNvs na regulação dos ritmos circadianos no nível neuronal^9,10,11, queríamos examinar diretamente o efeito do PDF sobre os relógios moleculares. Para este fim, nós desenvolvemos um método para monitorar a expressão do gene circadian ritmos no cérebro larval explant durante vários dias pela microscopia confocal lapso de tempo. O protocolo também foi adaptado para ensaios farmacológicos testar o efeito de PDF ou outros compostos no nível de PER-TDT. Assim, a adaptação consiste em tornar a cérebro explante cultura acessível a aplicação da droga, aumentando a resolução temporal e de imagem para uma duração mais curta.

Ex vivo cultura da drosófila cérebros dos diferentes estádios de desenvolvimento têm sido estabelecida anteriormente^{12,13,14,15,16,17 ,18}. Considerando que estes protocolos têm sido utilizados para imagens de vários fenômenos biológicos, alguns deles não são compatíveis com a imagem em resolução de célula única ou não apoiar a cultura por mais de algumas horas. Métodos alternativos para realizar a longo prazo de imagem ao vivo de neurônios circadianos em Drosophila incluem imagens de bioluminescência de ritmos molecular^19,20,21 e imagem latente de fluorescência de indicador de cálcio com microscopia de luz folha^22,23. Embora imagens de bioluminescência podem alcançar maior resolução temporal e microscopia de luz folha pode ser adaptável para a imagem latente na vivo , eles são limitados a resolução espacial e exigem sistemas especializados de microscópio.

O método descrito aqui é adaptado para visualizar sinais fluorescentes na cultura de todo o cérebro em célula única resolução ao longo de vários dias. Este método fácil e versátil pode ser adaptado aos cérebros de mosca adulta imagem cultivada e para experimentos farmacológicos estudar muitos problemas diferentes em neurobiologia da drosófila .

Protocolo

1. preparação das soluções estoque sob uma capa de cultura

1. Preparar 400 mL de 1x Schneider ativo médio (SAM) otimizado para cultura ex vivo dos cérebros larvas (modificado da referência^24,25) (tabela 1). Alíquota de 5 mL e flash congelamento em nitrogênio líquido (LN₂), loja a - 80 ° C.
2. Preparar 1 x Dissecting solução salina (DSS) por 10 diluição de solução-mãe (modificado da referência²⁶) (tabela 2).
3. Fibrinogênio alíquota para 10 mg e loja a 4 ° C, para uma única utilização.
   Cuidado: Pesar fibrinogênio sob fluxo laminar, luvas, como é prejudicial.
4. Preparar a solução de trombina no SAM (1500 NIH unidade/mg) e a alíquota de 10 µ l, flash congelar em LN₂ e manter a-80 ° C.
   Cuidado: Use luvas quando manusear a trombina como é prejudicial.
5. Solução-mãe alíquota de 100 x penicilina-estreptomicina. Manter a-20 ° C.
6. Cortar círculos da membrana de politetrafluoretileno (PTFE) (ver tabela de materiais) para o tamanho que se encaixa dentro de um prato fundo de vidro. Lavá-los em 70% EtOH e depois em autoclave dH₂O. Esterilize e seco sob fluxo laminar com UV. Mantenha-se em uma placa de Petri estéril. Utilização única.
   Nota: O PTFE é uma membrana porosa flexível que permite a troca de gases e impede a evaporação durante a gravação de longo prazo médio.

2. instalação de microscopia lapso de tempo

Nota: A seguinte configuração é para um microscópio confocal de varredor invertido em tandem (veja a tabela de materiais) equipada com um scanner de ressonância (8.000 Hz). O sistema inclui um detector de foto-multiplicador altamente sensíveis, que, juntamente com o scanner de ressonância, impede a fototoxicidade e fotobranqueamento. Temperatura e umidade são controladas dentro de uma câmara ambiental do microscópio (veja a Tabela de materiais) que cobre a maior parte do microscópio.

1. Coloca uma câmara de umidade de palco-top.
2. Liga os controladores de temperatura e umidade para equilibrar a câmara de microscópio para 25 ° C e 80% de umidade.
3. Para realizar experimentos na escuridão constante (DD), cobrir a câmara ambiental do microscópio com uma pano opaco (a menos que a câmara de microscópio é feita de um material opaco).
4. Se usando um objectivo de água-imersão, posicione um dispensador de Micro de imersão de água em cima do objetivo e programar um protocolo com o software de controlador do objectivo de Autoimmersion para o fornecimento de água a uma taxa constante durante a imagem latente de lapso de tempo.
   Nota: Objectivos de imersão de água juntamente com um dispensador de água ou a seca lente objetiva são recomendados para tratamento de imagens ao vivo a longo prazo, como outro tipo de meio de imersão iria secar.
5. Coloque um suporte de placa de Petri no palco, dentro da câmara de umidade.
6. Inicie o software do microscópio e seleccione o modo de ressonância varredor da primeira caixa de diálogo. Selecione Okey para inicializar o estágio quando solicitado. Vá para o guia de configuração e a configuração de Hardware para ligar as linhas de laser relevantes.
7. Ir para adquirir guia e painel de XY para seleccionar o modo bidirecional e definir parâmetros de aquisição, imagem.
   Nota: A descrito configuração de imagem aqui apresentada (Figura 2, Figura 3 e 1 filme) é otimizada para observar a expressão circadiana dos repórteres fluorescentes específicos. Os parâmetros a seguir foram escolhidos para caber melhor nossas especificações: 40 X água objetiva de imersão, média de linha X 8 com resolução de imagem 512 × 512. Para a imagem latente multicolor, aquisição de imagens sequenciais é necessária quando o comprimento de onda de emissão de um fluoróforo e o comprimento de onda de excitação de outra sobreposição (aqui, comprimentos de onda de emissão de proteína fluorescente amarela (YFP) e sobreposição de excitação de tomate). Escolha o modo sequencial "entre pilha" como é o mais rápido e o movimento dos neurônios do relógio é insignificante durante a aquisição de um Z-pilha. Configurações de microscopia devem ser adaptadas de acordo com o objectivo de cada experimento.

3. configuração do cérebro Larval explante cultura

Nota: Todo o processo de dissecação, a incorporação de explantes de cérebro leva ~ 30 min.

1. Preparação dos reagentes sob uma capa de cultura.
   1. Descongelar uma alíquota de trombina e manter à temperatura ambiente até a etapa de incorporação (passo 3.3). Utilização única.
   2. Descongelar rapidamente uma alíquota de SAM a 37 ° C e manter no gelo para uma única utilização.
   3. Adicionar o SAM a uma alíquota de 10 mg de fibrinogênio para 10 mg/mL, agite suavemente e incubar a 37 ° C durante pelo menos 30 min e durante a etapa de incorporação (passo 3.3). Utilização única.
      Nota: Não incube a solução de fibrinogênio mais de 2h quando começa a se polimerizar.
   4. Descongele uma alíquota de 100 ações x penicilina-estreptomicina. Prepare-se 2,5 mL de SAM contendo 1 x penicilina-estreptomicina (SAM/antibióticos). Manter à temperatura ambiente.
      Nota: Estoque de loja os restantes 100 x penicilina-estreptomicina a 4 ° C até 1 mês.
   5. Prepare-se uma alíquota de 500 µ l de SAM o restante. Manter-se no gelo.
   6. Para a imagem latente a longo prazo, aplicar graxa vácuo autoclavada a parte plástica da parte inferior do prato fundo vidro (figura 1A) e esterilizar sob fluxo laminar com UV.
2. Dissecação do sistema nervoso central e ventral cordão nervoso.
   1. Limpar a pinça e 2 x vidro bem três pratos de dissecação com 70% EtOH. Despeje 400 µ l de DSS em 4 poços e 400 µ l de SAM em um poço. Manter-se no gelo.
   2. Retire-lhes a voar meio contendo larvas e escolher não vagando 3º ínstar larvas (L3) com fórceps. Enxaguá-los sucessivamente em 2 poços DSS-cheia. Mantê-los no 3º poço cheio de DSS no gelo que anestesia as larvas.
      Nota: L3 dura aproximadamente 2 dias a 25 ° C. Para observar o cérebro em período de tempo fisiologicamente relevante que escolhemos usar não-vagando as larvas L3. Outros subgrupos de neurônios de relógio, tais como l-LNvs e DN3s, começam a ser formado no vagando fase L3, mas eles ainda não estão necessariamente ciclismo (dados não mostrados). Portanto, embora seja possível a imagem ciclismo relógio neurônios nesta fase (dados não mostrados), é importante distinguir cuidadosamente os neurônios já funcional relógio larval de desenvolvimento para análise de dados. Non-vagando L3 aparecem cerca de 4 a 4,5 dias depois ovo deitado a 25 ° C. Para usar este protocolo para o estudo dos ritmos circadianos, sincronizar (arrastar) as larvas em desenvolvimento em h 12/12 h LD ciclos a 25 ° C durante 3 dias antes de coletar as larvas L3.
   3. Disse cérebros larvas com pinça fina no poço cheio de DSS 4, que não tem sido usado para enxaguar as larvas, usando o método de dentro para fora,²⁷.
      1. Brevemente, cortar a larva em dois, suavemente belisca os ganchos de boca com um par de pinças e arregaçar de dentro para fora da parede do corpo usando o outro par de pinças, assim, expondo o cérebro. Livre o cérebro cortando toda a traqueia e nervos que anexá-lo ao resto do corpo.
      2. Aspirar o cérebro em cerca de 3 µ l de DSS com uma pipeta de 20 µ l (pre-lavada com DSS) e dispense o poço cheio de SAM. Repita o procedimento para até 7 cérebros.
         Nota: Dissecação deve ser realizada sobre uma superfície fria para manter as larvas anestesiadas e o cérebro refrigerados. Por exemplo, coloca o prato de dissecação em um bloco de refrigeração ligado a uma bomba para circular a água gelada de gelo. O procedimento de dissecação leva 30 ~ s por cérebro. É importante manter os olho/antenais discos imaginária anexados para o cérebro e o cordão nervoso ventral intacto. A arrancar essas partes irá danificar o cérebro e reduzir a qualidade da cultura. Além disso, Evite expor o cérebro para o ar. Antes de aspirar o primeiro cérebro, pipete subindo e descendo o DSS contendo partes das larvas dissecadas, como impede o cérebro de furar a parede da ponta.
3. Incorporação de explantes de cérebro em uma matriz 3D e montagem (~ 20 min).
   1. Mergulhe um cérebro dissecado em solução de trabalho de fibrinogênio (concentração final de fibrinogênio ~3.3 mg/mL, 10.5 µ l por cérebro) como segue:
   2. Aspire 3,5 µ l de SAM/antibióticos (com a mesma dica usada na seção 3.2.3). Aspire um cérebro dissecado com a dissecção bem para a ponta da pipeta mesmo sem dispensar o meio de SAM/antibióticos na ponta.
   3. Dispense o cérebro e o meio da tampa de uma placa de Petri estéril. Adicione outro µ l 3.5 de SAM/antibióticos e 3,5 µ l de fibrinogênio quente/SAM 10 mg/mL solução na gota que contém o cérebro. Misture a solução ao redor do cérebro suavemente pipetando com uma ponta de pipeta de 20 µ l.
      Nota: Usar uma pipeta, ao invés de fórceps nesta etapa evita salientando o cérebro.
   4. Pegue 2 µ l da solução de trabalho de fibrinogênio no menu suspenso e aplicá-lo sobre a lamela de vidro prato fundo como um pequeno círculo. Adicionar 0,8 µ l de trombina e mistura-se muito rapidamente com a ponta da pipeta. O fibrinogênio é convertido em fibrina e começa a se polimerizar.
   5. Pegue o cérebro que senta-se em solução (passo 3.3.1) entre um par de pinças de trabalho o fibrinogênio e posicioná-lo na matriz, uma vez que um branco matriz de fibrina é visível. Oriente o lado anterior do cérebro para baixo (para imagem relógio neurônios). -Empurre para baixo tão próxima quanto possível para o tampa de vidro. Coágulo de fibrina é composto de camadas de fibrina. Escolha uma camada e dobre-o em cima do cérebro com movimentos pequenos e suaves sem desanexar a matriz.
      1. Repita 2 a 3 vezes de diferentes partes do coágulo para estabilizar o cérebro.
         Nota: Quando estiver manipulando o cérebro com fórceps, tenha cuidado para não secar ou impô-la um estresse físico.
   6. Adicione 20 µ l de SAM/antibióticos em cima do cérebro incorporado para parar a ação da trombina.
   7. Repita o procedimento para montar o restante do cérebro. É possível inserir até 5 a 6 cérebros em um prato fundo de vidro.
   8. Para geração de imagens ao vivo a longo prazo, adicione 600 µ l de SAM/antibióticos na fonte interna (a parte de vidro). Posicione uma membrana PTFE pré-cortada em cima do meio e furá-lo para a vácuo graxa aplicada na parte de plástico da parte inferior (3.1.5) (figura 1A).
   9. Para os ensaios farmacológicos, encha o prato com 2 mL de SAM/antibióticos (figura 1B).
      Nota: É muito importante evitar a evaporação do meio, como a pressão osmótica do meio é fundamental para a viabilidade dos neurônios. Portanto, para experimentos de imagem a longo prazo, é necessário selar o prato de cultura com membrana PTFE. Considerando que para experimentos de curto prazo, membrana de vedação não é necessária enquanto o prato está cheio de 2 mL do meio e monitorado em uma câmara umidificada.

4. aquisição de imagem lapso de tempo

1. Coloque o prato fundo de vidro no suporte do prato de Petri dentro da câmara de umidade de palco-top.
2. Vá ao painel de z-pilha na aba de adquirir e definir as etapas de z-seção a partir do software de microscópio (2 µm × ~ 40 nos experimentos mostrado na Figura 2 e Figura 3e 1 filme). Defina o início de uma z-pilha no plano mais afastado da lamela e final na superfície do explante do cérebro, perto da lamela. Embora os movimentos do cérebro são negligenciáveis, adicionar z-seções extras no início e no final da pilha-z.
3. Ir para marcar & encontrar a aquisição de imagens multi-posição do painel e set-up. Com um objetivo X 40, 1 hemisfério do cérebro pode ser capturado dentro de um campo de visão
4. Vá ao painel de modo de aquisição e selecione xyzt (z-pilha de lapso de tempo). Vá ao painel de aquisição de tempo e definir os parâmetros de intervalo e frequência de tempo preferido.
   Nota: Adquirir imagens de lapso de tempo com a frequência desejada. Observe que a longo prazo-imagem ao vivo (24-72 h), com intervalo de lapso de tempo inferior a 2 h tende a resultados em menos neurônios ciclismo, provavelmente porque reduz a viabilidade dos neurônios. O volume de dados se expande como a taxa de aumento de aquisição de imagem, que torna o armazenamento e análise de dados mais desafiador.

5. farmacológico tratamento de explantes de cérebro com curto prazo viver Imaging

Nota: O procedimento a seguir é essencialmente a mesma que para a imagem latente a longo prazo, mas não requer uma membrana PTFE. Para evitar expor o cérebro para luz azul quando o produto químico é adicionado para a cultura, o microscópio deve ser colocado no quarto escuro com luz vermelha.

1. Vá ao painel de aquisição de tempo e definir o intervalo de tempo desejado e o número de verificação para obter os dados de linha de base antes da aplicação da droga. Inicie a digitalização.
2. Depois da linha de base digitalização é concluída, levantar a cabeça de varredura do sistema de microscópio. Retire a tampa do controlador de umidade de palco-top e com muito cuidado, retire a tampa do prato fundo vidro sem movê-lo.
3. Se necessário, remova a quantidade apropriada de meio de cultura. Adicionar a solução experimental no meio e, com cuidado e muito delicadamente, misture com uma pipeta Pasteur estéril sem tocar os explantes de cérebro.
   Nota: Para aplicação de banho de PDF, use 2 µM PDF solução (em 10% DMSO).
4. Substitua as tampas do prato fundo de vidro e a câmara húmida e a cabeça de varredura. Se usando, reposicione o pano preto opaco ao redor da câmara de microscópio.
5. Verifique se os cérebros estão em suas posições originais no modo de varredura ao vivo. Ajuste se necessário.
6. Vá ao painel de aquisição de tempo e definir o intervalo de tempo desejado e o número de verificação. Inicie a digitalização.
   Nota: Aqui nós testamos o lapso de tempo imagens adquiridas a cada hora por até 10 h.

Resultados

Aqui, nós mostramos os resultados representativos da gravação a longo prazo de uma repórter fluorescente circadian ex vivo cultura larval do cérebro e os resultados ao vivo de imagem do aplicativo de banho PDF na expressão de repórter.

Non-vagando as larvas L3 expressando o relógio molecular repórter PER-TDT e conduzido por um motorista de neurônio relógio Clk 856-gal4 (Figura 1<...

Discussão

Aqui, descrevemos o método para longo prazo lapso de tempo a microscopia de fluorescência dos cérebros larvas culturas. O sucesso deste tipo de experiências depende de vários fatores, tais como a saúde da cultura, método para a imobilização do explante cérebro, intensidade de fluorescência e relação sinal-ruído do repórter, temporal e resolução espacial, e acessibilidade para o explante. Estes fatores podem ser mutuamente exclusivos. Por exemplo, aumento da frequência de lapso de tempo afeta a saúde da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Malic acid	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
Succinic acid	Sigma-Aldrich	S9512
Fumaric acid	Sigma-Aldrich	F8509
α-Ketoglutaric acid	Sigma-Aldrich	K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrinogen from bovine plasma	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T9549	CAUTION: Health Hazard, use gloves
PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes	fisherscientific	08-772A
Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Polytetrafluoroethylene (PTFE) film	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLHV033RS
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore	SLGV033RS
Three-well glass dissection dish	Any company
Fine forceps, size 5, Dumont	Fine Science Tools	11254-20
Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors	Leica microsystem CMS GmbH
Temperature control chamber	Life Imaging Services	The CUBE & BOX temperature control system, custom designed
Stage-top humidity controller	Life Imaging Services	custom made
Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software	Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin	ImageJ software
10x iterative deconvolution	AutoQuant and Imaris software